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メラミンは、特定の食品カテゴリーに偶発的にも意図的にも存在する可能性がある、認識されている食品汚染物質です。この研究の目的は、乳児用粉ミルクと粉ミルク中のメラミンの検出と定量を確認することでした。イランのさまざまな地域から入手した、乳児用粉ミルクと粉ミルクを含む合計40の市販食品サンプルを分析しました。サンプルの概算メラミン含有量は、高速液体クロマトグラフィー紫外（HPLC-UV）システムを使用して決定しました。0.1～1.2 μg mL−1の範囲のメラミン検出用に検量線（R2 = 0.9925）を作成しました。定量限界と検出限界は、それぞれ1 μg mL−1と3 μg mL−1でした。乳児用粉ミルクと粉ミルク中のメラミンを検査した結果、乳児用粉ミルクと粉ミルクサンプル中のメラミンレベルは、それぞれ0.001～0.095 mg kg−1と0.001～0.004 mg kg−1であることが示されました。これらの値は、EU法およびコーデックス委員会の基準に準拠しています。メラミン含有量を低減したこれらの乳製品の摂取は、消費者の健康に重大なリスクをもたらさないことに留意することが重要です。これは、リスク評価の結果によっても裏付けられています。
メラミンは、シアナミドから誘導される分子式C3H6N6の有機化合物です。水への溶解度が非常に低く、窒素含有量は約66%です。メラミンは、プラスチック、肥料、食品加工機器（食品包装や台所用品を含む）の製造において、幅広い用途で広く使用されている工業用化合物です1,2。メラミンは、病気の治療のための薬剤キャリアとしても使用されています。メラミンの窒素含有量が高いため、この化合物の誤用や、食品成分にタンパク質分子の特性を付与することにつながる可能性があります3,4。そのため、乳製品を含む食品にメラミンを添加すると、窒素含有量が増加します。その結果、牛乳のタンパク質含有量が実際よりも高いと誤って結論付けられました。
メラミンを1グラム添加すると、食品のタンパク質含有量が0.4%増加します。しかし、メラミンは水に非常に溶けやすく、より深刻な害を引き起こす可能性があります。牛乳などの液体製品に1.3グラムのメラミンを添加すると、牛乳のタンパク質含有量が30%増加します5,6。メラミンはタンパク質含有量を増やすために動物や人間の食品にも添加されていますが7、コーデックス委員会（CAC）および各国の当局はメラミンを食品添加物として承認しておらず、飲み込んだり、吸入したり、皮膚から吸収されたりすると危険であるとリストしています。2012年、世界保健機関（WHO）の国際がん研究機関は、メラミンが人間の健康に有害である可能性があるため、メラミンをクラス2Bの発がん性物質としてリストしました8。メラミンに長期間曝露すると、がんや腎臓障害を引き起こす可能性があります2。食品中のメラミンはシアヌル酸と複合体を形成し、水に溶けない黄色の結晶を形成する可能性があり、腎臓や膀胱の組織に損傷を与えたり、尿路がんや体重減少を引き起こしたりする可能性がある9,10。メラミンは急性食中毒を引き起こし、高濃度では特に乳幼児に死をもたらす可能性があります。11 世界保健機関（WHO）は、CACガイドラインに基づき、ヒトのメラミンの許容一日摂取量（TDI）を体重1kgあたり1日0.2mgに設定しています。12 米国食品医薬品局（US FDA）は、乳児用粉ミルク中のメラミンの最大残留量を1kgあたり1mg、その他の食品中の最大残留量を2.5mg/kgに設定しています。2,7 2008年9月、国内の複数の乳児用粉ミルクメーカーが製品のタンパク質含有量を増やすために粉ミルクにメラミンを添加していたことが報告され、粉ミルク中毒が発生し、全国的なメラミン中毒事件を引き起こしました。この事件では29万4000人以上の子供が体調を崩し、5万人以上が入院しました。13
都市生活の困難さ、母親や子供の病気など、さまざまな要因により母乳育児が常に可能とは限らず、乳児に粉ミルクを与えることにつながります。その結果、母乳にできるだけ近い組成の粉ミルクを製造する工場が設立されました14。市販の粉ミルクは通常、牛乳から作られ、脂肪、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラルなどの化合物の特別な混合物で作られています。母乳に近づけるために、粉ミルクのタンパク質と脂肪の含有量は異なり、牛乳の種類に応じて、ビタミンや鉄などのミネラルなどの化合物で強化されています15。乳児は敏感なグループであり、中毒のリスクがあるため、粉ミルクの摂取の安全性は健康にとって非常に重要です。中国の乳児のメラミン中毒事件の後、世界各国がこの問題に細心の注意を払い、この分野の感度も高まりました。したがって、乳児の健康を守るために、粉ミルクの製造管理を強化することが特に重要です。食品中のメラミンを検出する方法は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、電気泳動、官能検査、分光光度法、抗原抗体酵素免疫測定法など多岐にわたる16。2007年、米国食品医薬品局（FDA）は、食品中のメラミンとシアヌル酸を測定するためのHPLC法を開発・発表した。これはメラミン含有量を測定する最も効果的な方法である17。
新しい赤外分光法を用いて測定した乳児用粉ミルク中のメラミン濃度は、0.33～0.96ミリグラム/キログラム（mg kg-1）の範囲であった。18 スリランカで行われた研究では、全粉乳中のメラミン濃度は0.39～0.84 mg kg-1の範囲であった。さらに、輸入乳児用粉ミルクのサンプルには、それぞれ0.96 mg/kgと0.94 mg/kgという最も高いメラミン濃度が含まれていた。これらの濃度は規制値（1 mg/kg）を下回っているが、消費者の安全のためにはモニタリングプログラムが必要である。19
いくつかの研究で、イランの乳児用粉ミルク中のメラミン濃度が調査されています。サンプルの約65%にメラミンが含まれており、平均濃度は0.73 mg/kg、最大濃度は3.63 mg/kgでした。別の研究では、乳児用粉ミルク中のメラミン濃度は0.35～3.40 μg/kgの範囲で、平均濃度は1.38 μg/kgであったと報告されています。全体として、イランの乳児用粉ミルク中のメラミンの存在と濃度は様々な研究で評価されており、一部のサンプルでは規制当局が設定した最大許容濃度（2.5 mg/kg/食）を超えるメラミンが含まれていました。
食品業界における粉ミルクの直接的および間接的な消費量が膨大であること、そして乳児用ミルクが子供の栄養摂取において特に重要であることを考慮し、本研究は粉ミルクおよび乳児用ミルク中のメラミンの検出方法を検証することを目的とした。実際、本研究の第一の目的は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と紫外線（UV）検出を用いて、乳児用ミルクおよび粉ミルク中のメラミン混入を検出するための迅速、簡便かつ正確な定量法を開発することであった。第二に、本研究の目的は、イラン市場で販売されている乳児用ミルクおよび粉ミルク中のメラミン含有量を測定することであった。
メラミン分析に使用される機器は、食品の生産場所によって異なります。高感度で信頼性の高いHPLC-UV分析法を使用して、牛乳と乳児用粉ミルク中のメラミン残留物を測定しました。乳製品には、メラミン測定を妨害する可能性のあるさまざまなタンパク質と脂肪が含まれています。したがって、Sunら22が指摘しているように、機器分析の前に適切で効果的なクリーンアップ戦略が必要です。この研究では、使い捨てシリンジフィルターを使用しました。この研究では、乳児用粉ミルクと粉ミルク中のメラミンを分離するためにC18カラムを使用しました。図1は、メラミン検出のクロマトグラムを示しています。さらに、0.1～1.2 mg/kgのメラミンを含むサンプルの回収率は95%～109%の範囲であり、回帰式はy = 1.2487x − 0.005 (r = 0.9925)であり、相対標準偏差(RSD)値は0.8～2%の範囲でした。入手可能なデータによると、この方法は検討した濃度範囲において信頼性が高いことが示されています（表1）。メラミンの機器検出限界（LOD）および定量限界（LOQ）は、それぞれ1 μg mL⁻¹および3 μg mL⁻¹でした。さらに、メラミンのUVスペクトルは242 nmに吸収帯を示しました。この検出方法は、感度が高く、信頼性が高く、正確です。この方法は、メラミン濃度の日常的な測定に使用できます。
同様の結果が複数の著者によって発表されている。乳製品中のメラミンの分析のために、高速液体クロマトグラフィー・フォトダイオードアレイ（HPLC）法が開発された。定量下限は、240 nmで粉ミルクで340 μg kg−1、乳児用調製粉乳で280 μg kg−1であった。Filazziら（2012）は、HPLCでは乳児用調製粉乳中のメラミンは検出されなかったと報告した。しかし、粉ミルクサンプルの8%には、0.505～0.86 mg/kgのレベルでメラミンが含まれていた。Tittlemietら23は同様の研究を実施し、高速液体クロマトグラフィー・質量分析法/MS（HPLC-MS/MS）により乳児用調製粉乳（サンプル番号：72）のメラミン含有量が約0.0431～0.346 mg kg−1であることを決定した。Venkatasamyらが実施した研究では、 （2010）では、グリーンケミストリーアプローチ（アセトニトリルなし）と逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を用いて、乳児用粉ミルクと牛乳中のメラミンを推定した。サンプル濃度範囲は1.0～80 g/mLで、応答は直線的であった（r > 0.999）。この方法は、濃度範囲5～40 g/mLで97.2～101.2の回収率を示し、再現性は相対標準偏差1.0%未満であった。さらに、観測されたLODとLOQはそれぞれ0.1 g mL−1と0.2 g mL−124であった。Lutterら（2011）は、HPLC-UVを用いて牛乳と乳児用粉ミルク中のメラミン汚染を測定した。メラミン濃度は< 0.2～2.52 mg kg−1の範囲であった。 HPLC-UV法の線形ダイナミックレンジは、牛乳で0.05～2.5 mg kg−1、タンパク質質量分率が15%未満の乳児用調製粉乳で0.13～6.25 mg kg−1、タンパク質質量分率が15%の乳児用調製粉乳で0.25～12.5 mg kg−1であった。LOD（およびLOQ）の結果は、牛乳で0.03 mg kg−1（0.09 mg kg−1）、タンパク質15%未満の乳児用調製粉乳で0.06 mg kg−1（0.18 mg kg−1）、タンパク質15%の乳児用調製粉乳で0.12 mg kg−1（0.36 mg kg−1）であり、信号対雑音比はそれぞれLODとLOQで3と1025であった。Diebesら（2012）は、HPLC/DMDを使用して乳児用調製粉乳と粉ミルクサンプル中のメラミンレベルを調査した。乳児用粉ミルク中の最低濃度は9.49 mg kg⁻¹、最高濃度は258 mg kg⁻¹であった。検出限界（LOD）は0.05 mg kg⁻¹であった。
Javaid らは、フーリエ変換赤外分光法 (FT-MIR) により、乳児用調製粉乳中のメラミン残留量が 0.002～2 mg kg−1 の範囲であることを報告した (LOD = 1 mg kg−1、LOQ = 3.5 mg kg−1)。Rezai ら 27 は、メラミンを推定するための HPLC-DDA (λ = 220 nm) 法を提案し、粉ミルクの LOQ を 0.08 μg mL−1 と達成したが、これは本研究で得られたレベルよりも低い。Sun らは、固相抽出 (SPE) により液体ミルク中のメラミンを検出する RP-HPLC-DAD を開発した。彼らは、LOD と LOQ をそれぞれ 18 と 60 μg kg−128 と達成したが、これは本研究よりも感度が高い。Montesano らHPLC-DMD法は、タンパク質サプリメント中のメラミン含有量を評価するのに有効であり、定量限界は0.05～3 mg/kgであったが、本研究で使用した方法よりも感度が低かった29。
分析ラボは、さまざまなサンプル中の汚染物質を監視することで環境保護において重要な役割を果たしていることは疑いようがありません。しかし、分析中に多数の試薬や溶媒を使用すると、有害な残留物が生成される可能性があります。そのため、分析手順がオペレーターや環境に及ぼす悪影響を軽減または排除するために、2000 年にグリーン分析化学 (GAC) が開発されました 26。メラミンの検出には、クロマトグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA) などの従来のメラミン検出方法が使用されてきました。しかし、数多くの検出方法の中でも、電気化学センサーは、優れた感度、選択性、迅速な分析時間、およびユーザーフレンドリーな特性により、大きな注目を集めています 30,31。グリーンナノテクノロジーは、生物学的経路を利用してナノ材料を合成し、有害廃棄物の発生とエネルギー消費を削減し、持続可能な慣行の実施を促進します。例えば、環境に優しい材料から作られたナノコンポジットは、メラミンなどの物質を検出するバイオセンサーに使用できます32,33,34。
この研究は、固相マイクロ抽出法（SPME）が従来の抽出法に比べてエネルギー効率と持続可能性が高いため、効果的に使用されていることを示しています。SPMEの環境への優しさとエネルギー効率は、分析化学における従来の抽出法に代わる優れた方法であり、サンプル調製のためのより持続可能で効率的な方法を提供します35。
2013年、Wuらは、メラミンと抗メラミン抗体の結合を利用して乳児用ミルク中のメラミンを免疫測定法で迅速に検出する、高感度かつ選択的な表面プラズモン共鳴（mini-SPR）バイオセンサーを開発した。免疫測定法（メラミン結合ウシ血清アルブミンを使用）と組み合わせたSPRバイオセンサーは、使いやすく低コストな技術であり、検出限界はわずか0.02 μg mL-136である。
NasiriとAbbasianは、市販サンプル中のメラミンを検出するために、グラフェン酸化物-キトサン複合体（GOCS）と組み合わせた高ポテンシャル携帯型センサーを使用しました37。この方法は、超高選択性、精度、応答性を示しました。GOCSセンサーは、顕著な感度（239.1 μM−1）、0.01～200 μMの線形範囲、1.73 × 104の親和定数、および最大10 nMのLODを示しました。さらに、2024年にChandrasekharらが実施した研究では、環境に優しく費用対効果の高いアプローチが採用されました。彼らは、環境に優しい方法で酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO-NPs）を合成するために、還元剤としてパパイヤの皮抽出物を使用しました。その後、乳児用粉ミルク中のメラミンの測定のために、独自のマイクロラマン分光法が開発されました。農業廃棄物由来のZnOナノ粒子は、メラミンのモニタリングと検出のための貴重な診断ツールおよび信頼性の高い低コスト技術としての可能性を示している38。
Alizadeh ら (2024) は、高感度金属有機構造体 (MOF) 蛍光プラットフォームを使用して粉ミルク中のメラミンを測定した。3σ/S を用いて決定したセンサーの線形範囲と検出下限は、それぞれ 40 ～ 396.45 nM (25 μg kg−1 ～ 0.25 mg kg−1 に相当) および 40 nM (25 μg kg−1 に相当) であった。この範囲は、乳児用調製粉乳 (1 mg kg−1) およびその他の食品/飼料サンプル (2.5 mg kg−1) 中のメラミンの検出用に設定された最大残留レベル (MRL) を十分に下回っている。蛍光センサー (テルビウム (Tb)@NH2-MIL-253(Al)MOF) は、粉ミルク中のメラミンの検出において、HPLC39 よりも高い精度とより精密な測定能力を示した。グリーンケミストリーにおけるバイオセンサーとナノコンポジットは、検出能力を向上させるだけでなく、持続可能な開発の原則に沿って環境への悪影響を最小限に抑える。
グリーンケミストリーの原理は、メラミンの定量のためのさまざまな方法に適用されてきました。1つのアプローチは、乳児用ミルクや温水などのサンプルからメラミンを効率的に抽出するために、クエン酸で架橋された天然極性ポリマーβ-シクロデキストリンを使用したグリーン分散固相マイクロ抽出法の開発です40。別の方法では、マンニッヒ反応を使用してミルクサンプル中のメラミンを定量します。この方法は、安価で環境に優しく、0.1～2.5 ppmの直線範囲と低い検出限界で非常に正確です41。さらに、液体ミルクと乳児用ミルク中のメラミンを定量するための費用対効果が高く環境に優しい方法が、フーリエ変換赤外透過分光法を使用して開発され、それぞれ1 ppmと3.5 ppmの高い精度と3.5 ppmの検出限界を実現しています42。これらの方法は、メラミンの定量のための効率的で持続可能な方法の開発にグリーンケミストリーの原理が応用されていることを示しています。
いくつかの研究では、メラミン検出のための革新的な方法が提案されており、固相抽出と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）43の使用、複雑な前処理やイオンペア試薬を必要としない高速高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により化学廃棄物の量を削減する44などが挙げられる。これらの方法は、乳製品中のメラミンの定量において正確な結果を提供するだけでなく、グリーンケミストリーの原則にも準拠しており、有害化学物質の使用を最小限に抑え、分析プロセスの全体的な環境への影響を低減する。
異なるブランドの40サンプルを3回ずつ検査し、結果を表2に示します。乳児用粉ミルクと粉ミルクのメラミン濃度は、それぞれ0.001～0.004 mg/kgと0.001～0.095 mg/kgの範囲でした。乳児用粉ミルクの3つの年齢グループ間で有意な変化は観察されませんでした。また、粉ミルクの80%からメラミンが検出されましたが、乳児用粉ミルクの65%がメラミンに汚染されていました。
工業用粉ミルクのメラミン含有量は乳児用ミルクよりも高く、その差は有意であった（p<0.05）（図2）。
得られた結果は、FDAが定める基準値（1mg/kgおよび2.5mg/kg未満）を下回っていました。さらに、結果はCAC（2010）およびEU45,46が定める基準値とも一致しており、乳児用粉ミルクの最大許容値は1mg/kg、乳製品の最大許容値は2.5mg/kgとなっています。
Ghanati らによる 2023 年の調査 47 によると、イランのさまざまな種類の包装済み牛乳のメラミン含有量は 50.7 ～ 790 μg kg−1 の範囲でした。彼らの結果は FDA の許容限度を下回っていました。私たちの結果は Shoder ら 48 および Rima ら 49 の結果よりも低くなっています。Shoder ら (2010) は、ELISA で測定した粉ミルク (n=49) のメラミンレベルが 0.5 ～ 5.5 mg/kg の範囲であることを発見しました。Rima らは、蛍光分光光度法で粉ミルク中のメラミン残留物を分析し、粉ミルク中のメラミン含有量が 0.72 ～ 5.76 mg/kg であることを発見しました。2011 年にカナダで、液体クロマトグラフィー (LC/MS) を使用して乳児用調製粉乳 (n=94) のメラミンレベルを監視する調査が行われました。メラミン濃度は許容限度（暫定基準：0.5 mg kg−1）を下回っていることが判明した。検出された不正なメラミン濃度がタンパク質含有量を増やすための策略であった可能性は低い。しかし、肥料の使用、容器内容物の移動、または同様の要因では説明できない。さらに、カナダに輸入された粉ミルク中のメラミンの発生源は明らかにされていない50。
ハッサニらは2013年にイラン市場で粉ミルクと液体ミルクのメラミン含有量を測定し、同様の結果を得ました。結果によると、粉ミルクと液体ミルクの1つのブランドを除いて、他のすべてのサンプルはメラミンで汚染されており、粉ミルクでは1.50～30.32 μg g−1、ミルクでは0.11～1.48 μg ml−1の範囲でした。注目すべきは、どのサンプルからもシアヌル酸が検出されなかったため、消費者のメラミン中毒の可能性が低減されたことです。51 以前の研究では、粉ミルクを含むチョコレート製品のメラミン濃度を評価しました。輸入サンプルの約94%とイランサンプルの77%にメラミンが含まれていました。輸入サンプルのメラミンレベルは0.032～2.692 mg/kgの範囲でしたが、イランサンプルのメラミンレベルは0.013～2.600 mg/kgの範囲でした。全体として、サンプルの85%でメラミンが検出されましたが、許容限度を超えるレベルを示した特定のブランドは1つだけでした。44 Tittlemierらは、粉ミルク中のメラミンレベルが0.00528～0.0122 mg/kgの範囲であることを報告しました。
表3は、3つの年齢層におけるリスク評価結果をまとめたものである。すべての年齢層においてリスクは1未満であった。したがって、乳児用粉ミルクに含まれるメラミンによる非発がん性健康リスクは存在しない。
乳製品中のメラミン濃度が低い場合は、製造過程における意図しない汚染が原因である可能性があり、高い場合は、意図的な添加が原因である可能性があります。さらに、メラミン濃度が低い乳製品を摂取することによる人体への全体的なリスクは低いと考えられています。したがって、このような低濃度のメラミンを含む製品を摂取しても、消費者の健康にリスクはないと言えます52。
乳製品業界、特に公衆衛生保護の観点から食品安全管理の重要性を考慮すると、粉ミルクおよび乳児用調製粉乳中のメラミン濃度および残留量を評価および比較するための方法を開発し、検証することが極めて重要である。乳児用調製粉乳および粉ミルク中のメラミンを測定するための、簡便かつ正確なHPLC-UV分光光度法を開発した。この方法は、信頼性と正確性を確保するために検証された。この方法の検出限界および定量限界は、乳児用調製粉乳および粉ミルク中のメラミン濃度を測定するのに十分な感度であることが示された。我々のデータによると、イランのサンプルのほとんどでメラミンが検出された。検出されたメラミン濃度はすべてCACが設定した最大許容限度を下回っており、これらの種類の乳製品の摂取は人間の健康にリスクをもたらさないことを示している。
使用した化学試薬はすべて分析グレードのもので、メラミン（2,4,6-トリアミノ-1,3,5-トリアジン）純度99%（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）、HPLCグレードのアセトニトリル（Merck、ドイツ、ダルムシュタット）、超純水（Millipore、フランス、モルフハイム）を使用した。使い捨てシリンジフィルター（Chromafil Xtra PVDF-45/25、孔径0.45 μm、膜径25 mm）（Macherey-Nagel、ドイツ、デューレン）を使用した。
試料の調製には、超音波洗浄器（Elma社製、ドイツ）、遠心分離機（Beckman Coulter社製、クレーフェルト、ドイツ）、およびHPLC（KNAUER社製、ドイツ）を使用した。
UV検出器を備えた高性能液体クロマトグラフ（KNAUER、ドイツ）を使用した。HPLC分析条件は以下のとおりである。ODS-3 C18分析カラム（4.6 mm × 250 mm、粒子径5 μm）（MZ、ドイツ）を備えたUHPLC Ultimateシステムを使用した。HPLC溶離液（移動相）はTFA/メタノール混合液（450:50 mL）で、流速は1 mL min-1であった。検出波長は242 nmであった。注入量は100 μL、カラム温度は20 °Cであった。薬剤の保持時間が長い（15分）ため、次の注入は25分後に行う必要がある。メラミンは、メラミン標準品の保持時間とUVスペクトルピークを比較することによって同定した。
メラミン標準溶液（10 μg/mL）を水で調製し、光を避けて冷蔵庫（4 °C）に保存した。原液を移動相で希釈し、作業用標準溶液を調製した。各標準溶液をHPLCに7回注入した。検量線式10は、測定されたピーク面積と測定された濃度の回帰分析によって算出した。
市販の牛乳粉末（20サンプル）と、異なるブランドの牛乳ベースの乳児用調製粉乳（20サンプル）をイランの地元のスーパーマーケットや薬局で購入し、異なる年齢の乳児（0～6か月、6～12か月、12か月超）に与えるために、分析まで冷蔵温度（4 °C）で保管した。次に、均質化した牛乳粉末 1 ± 0.01 g を秤量し、アセトニトリル：水（50:50、v/v、5 mL）と混合した。混合物を 1 分間攪拌し、次に超音波浴で 30 分間超音波処理し、最後に 1 分間振とうした。次に、混合物を室温で 9000 × g で 10 分間遠心分離し、上清を 0.45 μm シリンジフィルターを使用して 2 ml オートサンプラー バイアルにろ過した。濾液（250 μl）を水（750 μl）と混合し、HPLCシステムに注入した10,42。
本手法の妥当性を検証するため、最適条件下で回収率、精度、検出限界（LOD）、定量限界（LOQ）、および精密度を測定した。LODは、ピーク高さがベースラインノイズレベルの3倍となる試料濃度として定義した。一方、LOQは、ピーク高さが信号対雑音比の10倍となる試料濃度として定義した。
デバイスの応答は、7 つのデータ ポイントからなる校正曲線を使用して決定されました。異なるメラミン含有量 (0、0.2、0.3、0.5、0.8、1、および 1.2) が使用されました。メラミン計算手順の直線性が決定されました。さらに、いくつかの異なるレベルのメラミンがブランク サンプルに添加されました。標準メラミン溶液 0.1～1.2 μg mL−1 を乳児用調製粉乳および粉ミルク サンプルに連続的に注入することにより校正曲線が作成され、その R2 = 0.9925 でした。精度は手順の繰り返し性と再現性によって評価され、最初の日とそれに続く 3 日間にサンプルを注入することによって達成されました (3 回ずつ)。方法の繰り返し性は、添加された 3 つの異なる濃度のメラミンの RSD % を計算することによって評価されました。精度を決定するために回収率試験が実施されました。抽出法による回収率は、乳児用粉ミルクおよび乾燥ミルクのサンプル中のメラミン濃度の3つのレベル（0.1、1.2、2）で計算された9,11,15。
推定一日摂取量（EDI）は、次の式を使用して決定されました：EDI = Ci × Cc/BW。
ここで、Ciは平均メラミン含有量、Ccは牛乳の摂取量、BWは子供の平均体重である。
データ分析はSPSS 24を用いて行った。正規性はコルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて検証したが、すべてのデータはノンパラメトリック検定（p = 0）であった。そのため、群間の有意差を判定するためにクルスカル・ウォリス検定とマン・ホイットニーU検定を用いた。
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