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反応中心光捕集複合体1（RC-LH1）は、紫色光合成細菌の中核的な光合成構成要素です。私たちは、Rhodopseudomonas palustris由来のRC-LH1複合体の2つのクライオ電子顕微鏡構造を紹介しました。2.65Å分解能のRC-LH114-W複合体の構造は、タンパク質Wによって中断されたRCを囲む14個のサブユニットLH1ループから構成されていますが、タンパク質Wのない複合体は、RCを囲む閉じた16個のサブユニットLH1ループによって完全に構成されています。これらの構造を比較することで、RC-LH1複合体におけるキノンのダイナミクス、特にRC QB部位でキノンが結合する際のこれまで未解明であった構造変化、およびキノンをRCに渡すのに役立つ補助キノン結合部位の位置についての洞察が得られます。 Wタンパク質の独特な構造はLH1ループの閉鎖を防ぎ、それによってキノン／キノロン交換を促進する経路を作り出す。
光合成によって供給されるエネルギーは地球上のほぼすべての生命を支えることができ、太陽光バイオテクノロジーの大きな可能性を秘めている。紫色の光合成細菌は、地球規模の光合成を促進する一方で、さまざまなエネルギーモードと代謝能力も示している。光合成を回避して暗所で従属栄養細菌として増殖したり、窒素や二酸化炭素を固定したり、水素を生成したり、芳香族化合物を分解したりすることができる（1-3）。これらのプロセスにエネルギーを供給するためには、光を迅速かつ効率的に化学エネルギーに変換する必要がある。このプロセスは、光捕捉アンテナ複合体が光を吸収し、捕捉したエネルギーを反応中心（RC）に伝達し、それによって電荷分離を開始するときに始まる（4-7）。紫色の光合成細菌における光合成の基本単位は、光捕集複合体1（LH1）に囲まれたタイプ2 RCで構成され、RC-LH1コア複合体を形成する。LH1は湾曲したαβヘテロ二量体の配列で構成され、それぞれが2つの細菌クロロフィル（BChl）a分子と1つまたは2つのカロテノイドを結合する（8-12）。最も単純な LH1 アンテナは、閉じたループで RC (9-13) を囲む 16 個または 17 個の αβ ヘテロ二量体から構成されていますが、他のコア複合体では、膜貫通ペプチドが周囲の LH1 の連続性を中断し、それによって RC とシトクロム bc1 複合体間のキノール/キノン拡散を促進します (11、13-15)。紫色の光合成植物 Rhodopseudomonas (Rps.) は、光合成を支えるエネルギーと電子の伝達を理解できるモデル生物です。Rps. palustris の最初の結晶構造は、RC-LH1 複合体のモデルであり、15 個のヘテロ二量体 LH1 ループに囲まれた RC ですが、このループは「タンパク質 W」と呼ばれる未知のタンパク質によって中断されています (14)。タンパク質Wはその後、RPA4402として同定されました。これは、3つの予測される膜貫通ヘリックス（TMH）を持つ未特徴の10.5kDaタンパク質です（16）。タンパク質Wをコードするrpa4402遺伝子を、RC-L、M（pufL、pufM）およびLH1α、β（pufA、pufB）サブユニットをコードする遺伝子の命名法と一致させるために、pufWに改名することを提案します。興味深いことに、タンパク質WはRC-LH1の約10%にしか存在せず、Rps. palustrisが2つの異なるRC-LH1複合体を産生していることが明らかになりました。ここでは、タンパク質Wと14個のαβヘテロ二量体を含むコア複合体と、タンパク質Wを含まず閉じた16個のヘテロ二量体LH1ループを持つコア複合体の2つの高解像度クライオ電子顕微鏡（クライオEM）構造を報告します。私たちの構造は、Rps. palustris の RC-LH1 複合体の理解における画期的な進歩を表しています。なぜなら、私たちは各変異体の均一な集団を分析し、各ペプチド、結合色素、関連する脂質およびキノンを明確に割り当てるのに十分な解像度を得たからです。これらの構造を比較すると、これまで他のどの RC-LH1 複合体にも見つかっていない 3 つの TMH タンパク質 W がキノンチャネルを生成し、キノン/キノロン交換を促進することがわかります。多数の保存された脂質およびキノン結合部位が特定され、キノンと RC の結合後に新たな構造変化が明らかになりました。これは、酸素化された光合成生物の光化学系 II (PSII) RC に適している可能性があります。私たちの発見は、紫色光合成細菌の RC-LH1 コア複合体におけるキノン/キノロン結合および交換の速度論に関する新たな知見を提供します。
Rps. palustris に見られる 2 つの複合体の詳細な研究を容易にするために、生化学的方法により各 RC-LH1 を単離した。タンパク質 W 欠損複合体 (以下、ΔpufW と呼ぶ) は pufW 遺伝子を欠損した株 (16) から精製され、1 つの RC-LH1 複合体のみが生産される。タンパク質 W 含有複合体は、ある株によって生産される。この株のタンパク質 W は、C 末端に 10x His タグで修飾されているため、タンパク質 W 含有複合体は、金属を固定化することにより、タンパク質 W を欠損したほとんどのタンパク質と効果的に結合することができる。複合体は、アフィニティークロマトグラフィー (IMAC) により効果的に分離される (16)。
図1に示すように、どちらの複合体も、LH1アンテナに囲まれた3つのサブユニットRC（RC-L、RC-M、RC-H）を含んでいます。タンパク質Wを欠く複合体の2.80Å構造は、16個のαβヘテロ二量体を示し、RCを完全に囲む閉じたLH1ループを形成しており、以下、RC-LH116複合体と呼びます。タンパク質Wを含む複合体の2.65Å構造は、タンパク質Wによって分断された14個のヘテロ二量体LH1を有しており、以下、RC-LH114-Wと呼びます。
（A および B）化合物の表面表現。（C および D）ロッドで表現された結合色素。（E および F）細胞質表面から観察された複合体は、ペプチドと LH1 サブユニットが漫画で表現されており、タンパク質 W ギャップから時計回りに番号が付けられています [Rba 番号付けと一致しています。 sphaeroides 複合体 (13)]。LH1-α の場合、タンパク質サブユニットの色は黄色です。LH1-β の場合、タンパク質サブユニットの色は青です。タンパク質 W の場合、タンパク質は赤です。RC-H の場合、タンパク質はシアンです。RC-L の場合、オレンジです。RC-M の場合、マゼンタです。補因子はロッドで表現され、緑は BChl および BPh a 分子、紫はカロテノイド、黄色は UQ10 分子を表します。 （GおよびH）RC-LH114-W複合体（G）およびRC-LH116複合体（H）の同等領域におけるタンパク質-Wギャップの拡大図。補因子は空間充填の形で表示され、キレート化されたキノンは青色で表示されている。タンパク質-Wギャップは（G）で青色の破線で強調表示され、キノン/キノロールがLH116リング上に拡散する小さな穴は（H）で黒色の破線で強調表示されている。
図 1 (A および B) は、開いたまたは閉じた LH1αβ ヘテロ二量体の配列に囲まれた RC を示しており、それぞれの配列は 2 つの BChl と 1 つのカロテノイドを結合します (図 1、C および D)。これまでの研究では、Rps が LH1 複合体であることが示されています。スピルリナキサンチンの生合成経路では、これらの種はカロテノイドの混合集団を含んでいます (17)。しかし、スピロピロキサンチンが主要なカロテノイドであり、その密度は十分です。したがって、すべての LH1 結合部位でスピロキサンチンをモデル化することを選択しました。α および β ポリペプチドは、短い膜外領域を持つ単一の TMH です (図 1、A、B、E、および F)。C 末端の 17 残基の密度は観察されませんでしたが、両方の複合体で α ポリペプチドは Met1 から Ala46 まで切断されました。 RC-LH116ではβポリペプチドがGly4からTyr52まで、RC-LH114-WではSer5からTyr52まで減少していた。N末端側3つまたは4つ、あるいはC末端側13個の残基の密度は観察されなかった（図S1）。野生型株から調製した混合RC-LH1複合体の質量分析により、欠落領域はこれらのペプチドの異種切断の結果であることが示された（図S1およびS2）。α-Met1のN末端ホルミル化も観察された（f）。分析により、α-ペプチドはfMet1からAsp42/Ala46/Ala47/Ala50の残基からなり、β-ペプチドはSer2からAla53の残基からなり、低温EM密度マップとよく一致することが示された。
α-His29とβ-His36の協調によりBChlが向かい合うようになり、各αβヘテロダイマーは隣接するものと共にRCの周りに開いたループ（RC-LH114-W）または閉じたループ（RC-LH116）を形成する。励起子結合色素アレイ（図1、CおよびD）。RC-LH114-Wの877 nmバンドと比較すると、RC-LH116の880 nm吸収の赤方偏移は3 nmである（図2A）。しかし、円偏光二色性スペクトルはほぼ同じであり（図2B）、開いたループと閉じたループの間には明確な違いがあるものの、BChlの局所環境は非常に似ていることを示している。吸収の赤方偏移は、閉じたループでの熱運動の減少と安定性の増加（18、19）、閉じたループによって引き起こされる色素結合の変化（20、21）、またはこれら2つの効果の組み合わせ（11）の結果である可能性がある。
(A) 紫外線/可視光/近赤外吸収スペクトル。ピークは対応する色素でマークされ、775 nm の BPh ピークに対して正規化されている。(B) 805 nm の BChl 吸光度に対して正規化された円偏光二色性スペクトル。(C および D) RC-LH114-W 複合体 (C) および RC-LH116 複合体 (D) の時間分解吸収スペクトルから選択された ΔA スペクトル。比較しやすくするために、すべてのスペクトルは 0.2 ps での −A の ΔA に対して正規化されている。(E) さまざまな濃度の UQ2 の存在下で照射後のシトクロム c2 酸化速度 (生データについては図 S8 を参照)。(F) 低、中、または高強度の光 (それぞれ 10、30、または 300μMm-2 s-1) の下で培養された細胞における、精製複合体および分離された膜中のタンパク質 W および RC-L サブユニットの比率。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫測定法によりタンパク質レベルを測定する（生データについては図S9を参照）。精製されたRC-LH114-W複合体に対する比率を測定する。複合体中のRC-Lとタンパク質-Wの化学量論比は1:1である。
RC-LH114-W の変形した αβ14 ループの位置 1 にある BChl (図 1、A、C、および E) は、RC-LH116 の同等の BChl (図 1、B、D、および F、および図 S3) よりも 6.8Å だけ RC のプライマリ ドナー (P) に近い。しかし、2 つの複合体の過渡吸収動力学は、RC-LH114-W と RC-LH116 の場合、LH1 から RC への励起エネルギー移動時定数が 40 ±4 ps と 44 ±3 ps であることを示している (図 2)。 、C および D、図 S4 および表 S2)。RC 内の電子移動にも有意な差はない (図 S5 および関連する補足テキスト)。LH1 と RC-P 間のエネルギー移動時間が密接に対応しているのは、2 つの LH1 ループ内のほとんどの BChl の距離、角度、およびポテンシャル エネルギーが類似しているためであると推測される。 LH1のエネルギーパターンを探索して最小距離に到達することは、最適でない部位からRCへの直接的なエネルギー伝達よりも速くはないようです。RC-LH114-WのオープンループLH1ループは、構造解析のために低温条件下ではわずかな熱運動も起こす可能性があり、室温ではRC 1の位置にあるβBChlの色素距離からαβ14リングのコンフォメーションがより長くなっています。
RC-LH116複合体は32個のBChlと16個のカロテノイドを含み、その全体的な配置はThermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9)、Thiorhodovibrio (Trv.) 970株 (PDB ID 7C9R) (12)、緑藻類 (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) から得られたものと同じである。アライメント後、αβヘテロ二量体の位置にわずかなずれが見られ、特に1-5、15、16 (図S6) で顕著であった。タンパク質Wの存在はLH1の構造に大きな影響を与える。その3つのTMHは短いループで連結されており、N末端は複合体の内腔側に、C末端は細胞質側に位置する (図1Aおよび3、A～D)。タンパク質Wは大部分が疎水性であり（図3B）、TMH2とTMH3はLH1αβ-14と相互作用して膜貫通面を形成する（図3、BおよびE～G）。この界面は主に膜貫通領域のPhe、Leu、Val残基から構成されている。これらの残基は疎水性アミノ酸とαβ-14色素と積み重なっている。いくつかの極性残基も相互作用に寄与しており、複合体空洞表面のW-Thr68とβ-Trp42間の水素結合などが含まれる（図3、FおよびG）。細胞質表面では、Gln34がαβ-14カロテノイドのケト基に隣接している。さらに、n-ドデシルβ-d-マルトシド（β-DDM）分子が解像され、その疎水性尾部はタンパク質Wとαβ-14の界面まで伸びており、脂質尾部は細胞体内に位置している可能性がある。また、タンパク質WとRCHのC末端領域は非常に近いものの、特異的な相互作用を形成する範囲にはないことも確認しました（図1、AおよびE）。しかしながら、これら2つのタンパク質の未解明のC末端アミノ酸には相互作用が存在する可能性があり、それがRC-LH114-W複合体の形成中にタンパク質Wをリクルートするメカニズムを提供している可能性があります。
(A) LH1αβ14との界面に面するタンパク質Wは、棒状の側鎖（赤色）を持ち、静電ポテンシャル図の一部（等高線レベル0.13の透明な灰色の表面）に表示されている。(B) 疎水性の色付き表面で表されたタンパク質W。極性および荷電領域はシアンで、疎水性領域は白色で、強い疎水性領域はオレンジ色で表示されている。(CおよびD) カートゥーンで表されたタンパク質W。その向きは(A)(C)と同じで、180°回転している(D)。配列中の位置に応じて、識別可能な残基は虹色の配色を採用しており、N末端は青色、C末端は赤色である。(E) (A)と同じ視点でのタンパク質W。タンパク質W:LH1界面の残基は、付印付きの棒で表されている。 (F) カートゥーン表示では、タンパク質Wは(E)およびLH1αβ14に対して90°回転しており、バー表示では界面残基に対して回転している。βポリペプチドから突き出た残基にはラベルが付いている。補因子は図1と同じ色のバーで示され、分解されたβ-DDMは灰色で、酸素は赤色で示されている。(G) (F)のビューは180°回転しており、ラベル付きαポリペプチドの目立つ残基が示されている。
タンパク質Wはαβヘテロダイマー（図1Fの15番目）を置換し、ループの閉鎖を妨げ、最初の3つのαβヘテロダイマーを傾ける。フィルム法線に対する最初のαβ-1ヘテロダイマーの最大傾斜角は25°～29°であることが観察された（図1、AおよびE）。これは、RC Aのシャープコントラスト-LH116におけるαβ-1の2°～8°の傾斜によって形成された（図1、BおよびF）。2番目と3番目のヘテロダイマーは、それぞれ12°～22°と5°～10°に傾いている。RCの立体障害により、αβ-1の傾斜には2番目のαβペア（図1Fの16番目のαβに相当）が含まれないため、LH1リングに明確なギャップが形成される（図1、AおよびE）。 2 つの αβ ヘテロ二量体が欠如し、4 つの BChl と 2 つのカロテノイドが失われるため、カロテノイドはねじれた αβ-1 サブユニットに結合せず、結果として 13 個のカロテノイドと 28 個の BChl を含む LH114-W リングが形成される。αβ1 ～ 7 領域の 2 つの複合体の局所的な解像度推定値は、LH1 ループの残りの部分のそれよりも低く、これは RC QB 部位に隣接する LH1 サブユニットの固有の可塑性を反映している可能性がある (図 4)。
RC-LH114-W（AおよびB）とRC-LH116（CおよびD）の写真は、図1と同じ上面図/側面図（AおよびB）（AおよびC）とキャビティ表面（BおよびD）から示されている。右側には色付きの凡例が示されている。
化学量論比が 1:14 である他の特徴的なコア複合体は、Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX 二量体 (13) のみです。しかし、タンパク質 W と PufX には明らかな相同性はなく、それぞれの LH1 構造に大きな影響を与えます。PufX は、N 末端細胞質ドメインを持つ単一の TMH であり、Rps. palustris LH116αβ-16 に対応する位置で RC-H サブユニット (13) の細胞質側と相互作用します。PufX は、RC-LH1 とシトクロム bcl 複合体間のキノン/キノロン交換のためのチャネルを作成し、すべての Rba. sphaeroides コア複合体 (13) に存在します。モノマー-モノマー界面は Rba. にあります。スフェロイデスRC-LH1-PufX二量体はRC-LH114-Wのタンパク質Wの結合位置に位置し、PufXとタンパク質Wによって誘導されるギャップは同等の位置にある（図S7A）。RC-LH114-Wのギャップは、タンパク質WまたはPufXとは無関係のペプチドによって形成されるPseudomonas rosea LH1の仮説上のキノンチャネル（8）とも整列している（図S7B）。さらに、1つのγサブユニット（7）を除外して形成されるBlc.エメラルドグリーンLH1のキノンチャネルも同様の位置にある（図S7C）。異なるタンパク質によって媒介されているにもかかわらず、これらのキノン/キノロールチャネルがRC-LH1複合体の共通の位置に現れることは収斂進化の一例であるように思われ、タンパク質Wによって形成されるギャップがキノンチャネルとして機能する可能性があることを示唆している。
LH114-Wループのギャップにより、タンパク質のようにタンパク質孔を介して2つのドメインを接続するのではなく、RC-LH114-W複合体の内部空間とバルク膜との間に連続した膜領域が形成される（図1G）。RC-LH116複合体は閉じたTchに似ている。針状複合体（22）（図1H）。膜を介したキノンの拡散は狭いタンパク質チャネルを介した拡散よりも速いため、開いたLH114-Wループは閉じたLH116ループよりも速いRCターンオーバーを可能にし、キノンのRCへの拡散はより制限される可能性がある。タンパク質WがRCを介したキノンの変換に影響を与えるかどうかをテストするために、特定の濃度のユビキノン2（UQ2）（イソプレン尾部が短い天然UQ10のアナログ）でシトクロム酸化アッセイを行った（図2E）。キレート化キノンの存在により見かけのミカエリス定数の正確な決定が妨げられるものの（RC-LH114-WとRC-LH116はそれぞれ0.2±0.1μMと0.5±0.2μMに適している）、RC-LH114-Wの最大速度（4.6±0.2 e-RC-1 s-1）はRC-LH116（3.6±0.1 e-RC-1 s-1）よりも28±5%大きい。
我々は当初、タンパク質Wがコア複合体の約10%に存在すると推定した（16）。ここでは、低光、中光、高光で増殖した細胞の占有率はそれぞれ15±0.6%、11±1%、0.9±0.5%である（図2F）。質量分析の定量的比較により、ヒスチジンタグの追加は野生型株と比較してタンパク質Wの相対存在量を減少させなかった（P = 0.59）ため、これらのレベルは修飾タンパク質Wのアーティファクトではないことが示された（図S10）。しかし、RC-LH1複合体におけるタンパク質Wの占有率が低いことで、一部のRCが加速された速度で反転し、それによってRC-LH116複合体におけるより遅いキノン/キノロン交換が緩和される可能性がある。光占有率が高いことは、最近のトランスクリプトミクスデータと一致しないことに気付きました。このデータは、強い光の下でpufW遺伝子の発現が増加することを示しています（図S11）（23）。pufWの転写とタンパク質WのRC-LH1複合体への組み込みの違いは混乱を招き、タンパク質の複雑な制御を反映している可能性があります。
RC-LH114-W では、6 個のカルジオリピン (CDL)、7 個のホスファチジルコリン (POPC)、1 個のホスファチジルグリセロール (POPG)、および 29 個の β-DDM 分子が配置され、モデル化されています。 RC-LH116 (図 5、A および B)。 これら 2 つの構造では、CDL は複合体のほぼ細胞質側に位置していますが、POPC、POPG、および β-DDM は主に管腔側に位置しています。 2 つの脂質および界面活性剤分子が RC-LH114-W 複合体の αβ-1 ～ αβ-6 領域で分離され (図 5A)、5 つの脂質および界面活性剤分子が RC-LH116 の同等の領域で分離されました (図 5B)。複合体の反対側には、主に CDL などの脂質が RC と αβ-7 ～ αβ-13 の間に蓄積していることがわかった (図 5、A および B)。構造的に解明された他の脂質および界面活性剤は LH1 リングの外側に位置し、よく解明されたアシル鎖が LH1 サブユニット間に伸びており、暫定的に RC-LH114-W では β-DDM と指定され、RC では β-DDM と定義されています。β-DDM と POPC-LH116 の混合物。キレート脂質と界面活性剤が構造内で同様の位置にあることから、これらは生理学的に関連する結合部位であることが示唆される (図 S12A)。Tch 内の同等の分子の位置も一貫性が高い。Gentle および Trv。株970 RC-LH1s（図S12、B～E）（9、12）と脂質ヘッドグループの水素結合残基は配列アライメントでかなり良好な保存性を示し（図S13）、RCに結合する保存されたCDL（24）を示していることから、これらの部位はRC-LH1複合体で保存されている可能性がある。
（AおよびB）RC-LH114-W（A）およびRC-LH116（B）ペプチドは、図1の配色を使用して、漫画で表され、色素は棒で表されています。脂質は赤色で、界面活性剤は灰色で示されています。RC QAおよびQB部位に結合したUQは黄色、単離されたUQは青色です。（CおよびD）脂質を省略した、（A）および（B）と同じビュー。（E～G）RC-LH116のQ1（E）、Q2（F）、およびQ3（G）の拡大図で、互いに影響し合う側鎖が示されています。水素結合は黒色の破線で示されています。
RC-LH116では、電荷分離プロセスで電子移動に関与するRC QAとQB UQの両方が結合部位で分解されています。しかし、RC-LH114-Wでは、QBキノンは解読されておらず、以下で詳しく説明します。QAとQBキノンに加えて、2つのキレート化されたUQ分子（RCとLH1リングの間に位置）が、それぞれQ1とQ2に位置するよく解読されたヘッドグループに従って、RC-LH114-W構造に割り当てられています。空間）。図5C）。2つのイソプレンユニットがQ1に割り当てられ、密度マップはQ2の10個のイソプレンテール全体を解読しています。RC-LH116の構造では、3つのキレート化されたUQ10分子（Q1からQ3、図5D）が解読され、すべての分子はテール全体にわたって明確な密度を持っています（図5、DからG）。 2 つの構造において、Q1 と Q2 のキノンヘッドグループの位置は非常に一貫しており (図 S12F)、RC とのみ相互作用します。Q1 は RC-LH114-W の W ギャップの入口に位置し (図 1G および 5、C、D および E)、Q2 は QB 結合部位の近くに位置します (図 5、C、D および F)。保存された L-Trp143 および L-Trp269 残基は Q1 および Q2 に非常に近く、π スタッキング相互作用の可能性を提供します (図 5、E および F、および図 S12)。Q1 の遠位酸素から 3.0 Å 離れた L-Gln88 は強い水素結合を提供します (図 5E)。この残基は、最も遠い関係を除いてすべての RC で保存されています (図 S13)。 L-Ser91は他のほとんどのRCではThrに保守的に置換されており（図S13）、Q1のメチル酸素から3.8オングストローム離れており、弱い水素結合を提供する可能性がある（図5E）。Q3は特定の相互作用はないようだが、RC-MサブユニットとLH1-αサブユニット5～6の間の疎水性領域に位置している（図5、DおよびG）。Q1、Q2、Q3または近傍のキレート化キノンは、Tch. Gentle、Trv. Strain 970、およびBlcでも解明されている。虹彩構造（9、10、12）は、RC-LH1複合体における保存された補助キノン結合部位を示している（図S12G）。 RC-LH116 中の 5 つの分解された UQ は、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) によって決定された各複合体の 5.8±0.7 とよく一致しているが、RC-LH114-W 中の 3 つの分解された UQ は、測定値 6.2±0.3 (図 S14) よりも低く、構造中に未解決の UQ 分子が存在することを示している。
擬似対称のLおよびMポリペプチドはそれぞれ5つのTMHを含み、1つのBChl二量体、2つのBChl単量体、2つのバクテリオファージ（BPh）単量体、1つの非ヘム鉄、および1つまたは2つのUQ10分子を組み合わせたヘテロ二量体を形成する。末端ケトン基上の水素結合の存在とRpsにおけるその既知の蓄積により、カロテノイドはMサブユニットに組み込まれ、cis-3,4-デヒドロオロドピンと名付けられる。種（25）。RC-Hの外膜ドメインは、単一のTMHによって膜に固定されている。RC全体の構造は、関連種（Rbaなど）の3つのサブユニットRCに似ている。sphaeroides（PDB ID：3I4D）。 BChlとBPhのマクロサイクル、カロテノイドの骨格、非ヘム鉄は、これらの構造の分解能範囲内で重なり合っており、QA部位のUQ10ヘッドグループとRC-LH116のQBキノンも同様である（図S15）。
QB部位の占有率が異なる2つのRC構造が利用可能になったことで、QBキノン結合に伴う一貫した構造変化を調べる新たな機会が得られた。RC-LH116複合体では、QBキノンは完全に結合した「近位」位置（26）にあるが、分離したRC-LH114-WにはQBキノンはない。RC-LH114-WにはQBキノンがないが、これは驚くべきことである。なぜなら、この複合体は活性があり、構造的に解明されたQBキノンを持つRC-LH116複合体よりも活性が高いからである。2つのLH1環は約6つのキノンをキレートするが、閉じたRC-LH116環では5つが構造的に解明されているのに対し、開いたRC-LH114-W環では3つしか構造的に限定されていない。この構造的無秩序の増加は、RC-LH114-W QB 部位の置換速度の速さ、複合体内のキノン反応速度の速さ、および LH1 ループを横断する可能性の増加を反映している可能性があります。RC-LH114-W の RC QB 部位に UQ がないのは、より複雑でより活性な複合体の結果であり、RC-LH114-W の QB 部位は UQ ターンオーバーの特定の段階 (QB 部位への入口が閉じられている) で即座に凍結されており、この活性のコンフォメーションを反映していると考えられます。
QBがない場合、L-Phe217の回転はUQ10結合と両立しない位置に移動し、尾部の最初のイソプレンユニットと空間的に衝突します（図6A）。さらに、明らかな主要な構造変化、特にヘリックスde（TMH DとEの間のループにある短いヘリックス）では、L-Phe217がQB結合ポケットに移動し、L-Tyr223が回転します（図6A）。これにより、M-Asp45フレームワークとの水素結合が切断され、QB結合部位の入り口が閉じられます（図6B）。ヘリックスdeは基部で回転し、L-Ser209のCαは0.33Å、L-Val221Cαは3.52Å移動します。TMH DとEには目立った変化はなく、両方の構造で重ね合わせることができます（図6A）。我々の知る限り、これは天然のRCにおいてQB部位を閉じる最初の構造である。完全な（QB結合）構造との比較から、キノンが還元される前に、キノンに入るためにコンフォメーション変化が必要であることがわかる。L-Phe217が回転してキノンの頭部とπスタッキング相互作用を形成し、らせんが外側にずれることで、L-Gly222の骨格とL-Tyr223の側鎖が安定した水素結合構造を持つ水素結合ネットワークを形成できるようになる（図6、AおよびC）。
(A) ホログラム (L 鎖、オレンジ/M 鎖、マゼンタ) とアポ (灰色) 構造の重ね合わせた模式図。主要な残基は棒状の表現で示されている。UQ10 は黄色の棒で表されている。点線は構造全体で形成される水素結合を示している。(B および C) アポリポタンパク質の表面表現とリング構造全体。L-Phe217 の側鎖酸素は青色、L-Tyr223 は赤色でそれぞれ強調表示されている。L サブユニットはオレンジ色。M および H サブユニットは着色されていない。(D および E) アポリポタンパク質 (D) およびリング構造全体 (E) [それぞれ (A) で着色] と Thermophilus thermophilus PSII (緑色、プラスチックキノンを含む青色; PDB ID: 3WU2) Align (58)。
意外なことに、LH1 を欠く QB 欠損 RC の構造はいくつか入手可能であるにもかかわらず、本研究で観察された構造変化はこれまで報告されていません。これらには、Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27)、Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28)、および Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) の QB 欠損構造が含まれており、これらはすべて、全体的な QB 構造とほぼ同じです。3PRC を詳しく調べたところ、LDAO (ラウリルジメチルアミンオキシド) 界面活性剤分子が QB 位置の入口に結合し、閉じた構造への再配置を妨げている可能性があることがわかりました。LDAO は 1EYS または 1OGV では同じ位置で分解しませんが、これらの RC は同じ界面活性剤を使用して調製されているため、同じ効果が生じる可能性があります。Rba.シトクロムc2と共結晶化したSphaeroides RC（PDB ID: 1L9B）も、閉じたQB部位を持っているようです。しかし、この場合、RC-MポリペプチドのN末端領域（Qヘリックス上のTyr残基のH結合を介してQB結合部位と相互作用する）は不自然なコンフォメーションをとり、QBのコンフォメーション変化はそれ以上調べられていません（30）。安心できるのは、RC-LH116 RCのN末端領域とほぼ同じRC-LH114-W構造では、このようなMポリペプチドの変形が見られなかったことです。また、界面活性剤ベースのLH1アンテナを除去した後、PDBのアポリポタンパク質RCが解明され、RCと周囲のLH1リングの内表面との間の隙間にある内部キノンプールと脂質が除去されたことも注目すべきです（31、32）。 RCは、分解可能なQBキノンを除いてすべての補因子を保持しているため、機能を維持します。QBキノンは安定性が低く、調製プロセス中に失われることが多いです（33）。さらに、RCからLH1と天然環状脂質を除去すると、電荷分離したP+QB状態の寿命が短くなるなど、機能に影響を与えることが知られています（31、34、35）。したがって、RCを取り囲む局所的なLH1リングの存在が「閉じた」QB部位を維持し、それによってQB近傍の局所環境を維持しているのではないかと推測します。
アポリポタンパク質（QBキノンなし）と完全な構造は、一連のイベントではなく、QB部位のターンオーバーの2つのスナップショットを表しているにすぎないが、ヒドロキノンによる再結合を防ぐために結合をゲートできるという兆候がある。基質阻害を阻害するために。アポリポタンパク質のQB部位付近でのキノロールとキノンの相互作用は異なる可能性があり、それがRCによる拒絶につながる。キノンの結合と還元には構造変化が関与していることが長い間提唱されてきた。暗順応後の凍結RCのキノン還元能力は損なわれている（36）。X線結晶構造解析によると、この損傷はQBキノンが活性近位位置から約4.5Å離れた「遠位」構造に捕捉されていることによるものである（26）、37）。我々は、この遠位結合コンフォメーションは、アポリポタンパク質と完全な環状構造との間の中間状態のスナップショットであり、キノンとの最初の相互作用とQB部位の開口に続くものであると示唆する。
特定の光合成細菌、シアノバクテリア、藻類、植物のPSII複合体に見られるタイプII RCは、構造と機能が保存されている（38）。図6（DとE）に示す構造アライメントは、PSII RCと細菌RC複合体のQB部位との類似性を強調している。この比較は、キノン結合と還元の密接に関連するシステムを研究するためのモデルとして長年用いられてきた。以前の論文では、PSIIキノン還元に伴って構造変化が起こることが示唆されている（39、40）。したがって、RCの進化的な保存性を考慮すると、これまで観察されていなかったこの結合メカニズムは、酸素化された光合成植物のPSII RCのQB部位にも適用できる可能性がある。
Rps ΔpufW (ラベルなし pufW 欠失) および PufW-His (天然の pufW 遺伝子座から発現される C 末端 10x His タグ付きタンパク質-W) 株。palustris CGA009 は、以前の研究 (16) で説明されています。これらの株と同質遺伝子型の野生型親株は、PYE (各 5 g リットル -1) (LB 培地で -80 °C で保存、50% ( w/v) グリセロール、酵母エキス、コハク酸を含む) 寒天 [1.5% (w/v)] プレートに少数の細胞を塗抹することにより、冷凍庫から回収されました。プレートは、嫌気条件下で室温の暗所で一晩インキュベートされ、その後、OSRAM 116-W ハロゲン電球 (RS Components、英国) から供給される白色光 (約 50 μmolm-2 s-1) で 3 ～ 5 日間照射され、単一のコロニーが現れました。単一コロニーを用いて、0.1% (w/v) カザミノ酸を添加した M22+ 培地 (41) 10 ml に接種した (以下、M22 と呼ぶ)。培養は、34℃、暗所、低酸素条件下で 180 rpm で 48 時間振とうし、その後、培養液 70 ml を同じ条件下で 24 時間接種した。1 ml の半好気性培養液を用いて、30 ml のユニバーサルスクリューキャップ透明ガラス瓶内の M22 培地 30 ml に接種し、滅菌磁気攪拌棒で 48 時間、攪拌 (~50μmolm-2 s-1) しながら照射した。次に、同じ条件下で約1リットルの培養液に30mlの培養液を接種し、その後、約200μmolm-2 s-1の光照射下で72時間培養した約9リットルの培養液に接種した。細胞は7132 RCFで30分間遠心分離して回収し、約10mlの20mMトリス-HCl（pH 8.0）に再懸濁し、必要になるまで-20℃で保存した。
解凍後、再懸濁した細胞にデオキシリボヌクレアーゼ I (Merck、英国) の結晶、リゾチーム (Merck、英国) および Roche ホロ酵素プロテアーゼ阻害剤錠 (Merck、英国) 2 錠を加える。20,000 psi フレンチ プレッシャー セル (Aminco、米国) で、細胞を 8 ～ 12 回破砕する。4 °C で 18,500 RCF で 15 分間遠心分離して未破砕細胞と不溶性デブリを除去した後、43,000 °C で 2 時間 113,000 RCF で遠心分離して、色素溶解液から膜を沈殿させる。可溶性画分を捨て、着色した膜を 100 ～ 200 ml の 20 mM tris-HCl (pH 8.0) に再懸濁し、目に見える凝集物がなくなるまで均質化する。懸濁した膜を、2% (w/v) β-DDMを含む20 mMトリス-HCl (pH 8.0) (Anatrace、米国) 溶液中で、4℃の暗所で1時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。その後、70℃で150,000 RCFを溶解し、4℃で1時間遠心分離して残留不溶物を除去した。
ΔpufW株由来の可溶化膜を、結合バッファー[20 mMトリス-HCl(pH 8.0)、0.03%(w/v)β-DDM含有]を3カラム容量(CV)入れた50 ml DEAEセファロースイオン交換カラムに適用した。カラムを2 CVの結合バッファーで洗浄し、次に50 mM NaClを含む2つの結合バッファーで洗浄した。RC-LH116複合体は、1.75 CVで150～300 mM NaCl(結合バッファー中)の直線勾配で溶出し、残りの結合複合体は、0.5 CVで300 mM NaClを含む結合バッファーで溶出した。 250～1000 nm の吸収スペクトルを収集し、880～280 nm での吸光度比 (A880/A280) が 1 より大きい画分を保持し、結合バッファーで 2 倍に希釈し、精製時に DEAE カラムで同じ手順を再度使用します。A880/A280 比が 1.7 より高く、A880/A805 比が 3.0 より大きい画分を希釈し、3 回目のイオン交換を行い、A880/A280 比が 2.2 より高く、A880/A805 比が 5.0 より大きい画分を保持します。部分的に精製された複合体を、Amicon 100,000 分子量カットオフ (MWCO) 遠心フィルター (Merck、英国) で約 2 ml に濃縮し、200 mM NaCl バッファーを含む Superdex 200 16/600 サイズ排除カラム (GE Healthcare、米国) にロードし、同じバッファーで 1.5 CV で溶出しました。サイズ排除画分の吸収スペクトルを収集し、A880/A280 比が 2.4 以上、A880/A805 比が 5.8 以上である吸収スペクトルを 100 A880 に濃縮し、クライオ TEM グリッドの準備または保管に直ちに使用します。必要になるまで -80°C で保管してください。
PufW-His株由来の可溶化膜を、IMACバッファー（GE Healthcare）中の20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharoseカラム（20 mMトリス-HCl（pH 8.0）、200 mM NaClおよび0.03%（w/w）含有）に適用した。v) β-DDM]。カラムを5 CVのIMACバッファーで洗浄し、次に10 mMヒスチジンを含む5 CVのIMACバッファーで洗浄した。コア複合体を100 mMヒスチジンを含む5つのIMACバッファーでカラムから溶出した。RC-LH114-W複合体を含む画分を、Amicon 100,000 MWCOフィルター（Merck、英国）を備えた撹拌槽で約10 mlに濃縮し、結合バッファーで20倍に希釈し、25 mlに加えた。DEAE Sepharoseカラムでは、バッファーに結合した4 CVを事前に使用した。カラムを 4 つの CV 結合バッファーで洗浄し、次に 8 つの CV で複合体を 0 ～ 100 mM NaCl (結合バッファー中) の直線勾配で溶出し、残りの 4 つの CV には 100 mM 結合バッファーが含まれています。塩化ナトリウムと A880/A280 比が 2.4 より高く、A880/A805 比が 4.6 より高い画分で溶出された残りの複合体を、Amicon 100,000 MWCO 遠心フィルターで約 2 ml に濃縮し、1.5 CV の IMAC バッファーで事前に平衡化した Superdex 200 16/600 サイズ排除カラムで、次に同じバッファーで 1.5 CV にわたって溶出しました。サイズ排除分画の吸収スペクトルを収集し、A880/A280比が2.1以上、A880/A805比が4.6以上の吸収スペクトルを100 A880まで濃縮し、凍結TEMグリッドの作製に直ちに使用するか、必要になるまで-80°Cで保存する。
低温TEMグリッドの作製には、ライカEM GP浸漬式冷凍機を使用した。複合体をIMACバッファーでA880が50になるように希釈し、5μlを新たにグロー放電処理したQUANTIFOIL 1.2/1.3カーボンコート銅メッシュ（Agar Scientific、英国）に載せた。グリッドを20℃、相対湿度60%で30秒間インキュベートした後、3秒間吸水し、-176℃の液体エタンで急冷した。
RC-LH114-W複合体のデータは、加速電圧300kV、公称倍率130,000倍、エネルギーギャップ20eVで動作するTitan Krios顕微鏡を使用して、eBIC（電子バイオイメージングセンター）（英国ダイヤモンド光源）で記録されました。データ収集には、K2ピーク検出器を備えたGatan 968 GIF Quantumを使用して、カウントモードで画像を記録しました。校正されたピクセルサイズは1.048Å、線量率は3.83 e-Å-2s-1です。11秒でムービーを収集し、40部分に分割しました。カーボンコーティング領域を使用して顕微鏡を再フォーカスし、穴ごとに3つのムービーを収集しました。合計で3130のムービーが収集され、デフォーカス値は-1～-3μmでした。
RC-LH116複合体のデータは、アスターベリー生物構造研究所（英国リーズ大学）の同じ顕微鏡を使用して収集されました。データは、130k倍率の計数モードで収集され、ピクセルサイズは4.6 e-Å-2s-1の線量で1.065 Åに較正されました。動画は12秒間記録され、48の部分に分割されました。合計で3359本のフィルムが収集され、デフォーカス値は-1～-3μmでした。
すべてのデータ処理は、Relion 3.0 パイプライン (42) で実行されます。Motioncorr 2 (43) を使用して線量加重によりビームの動きを補正し、次に CTFFIND 4.1 (44) を使用して CTF (コントラスト伝達関数) パラメータを決定します。これらの初期処理段階後の典型的な顕微鏡写真は、図 2 に示されています。S16。自動選択テンプレートは、250 ピクセルのフレーム内の 1000 個の粒子の約 250 ピクセルを手動で選択し、参照 2 次元 (2D) 分類を行わないことで生成され、サンプル汚染に該当する分類や識別可能な特性がない分類は除外されます。次に、すべての顕微鏡写真に対して自動選択が実行され、RC-LH114-W は 849,359 個の粒子、RC-LH116 複合体は 476,547 個の粒子でした。選択されたすべての粒子は、2 ラウンドの非参照 2D 分類を受け、各実行後、炭素領域、サンプル汚染、明らかな特徴がない、または強く重なり合う粒子に該当する粒子が除外され、結果として 772,033 (90.9%) および 359,678 (75.5%) ) 粒子がそれぞれ RC-LH114-W および RC-LH116 の 3D 分類に使用されます。初期 3D 参照モデルは、確率的勾配降下法を使用して生成されました。初期モデルを参照として使用して、選択された粒子は 3D で 4 つのカテゴリに分類されます。このカテゴリのモデルを参照として使用して、最大のカテゴリの粒子に対して 3D 精製を実行し、次に初期 15Å ローパスフィルタを使用して溶媒領域をカバーし、6 ピクセルのソフトエッジを追加し、ピクセルを後処理して、トップ検出器の Gatan K2 ピーク変調伝達関数を補正します。 RC-LH114-Wデータセットの場合、この初期モデルはマスクの端にある強い密度（UCSF Chimeraのコア複合体密度から切り離されている）を除去することによって修正されました。結果として得られたモデル（RC-LH114-WとRC-LH116の解像度はそれぞれ3.91Åと4.16Å）は、2回目の3D分類の参照として使用されます。使用された粒子は最初の3Dクラスにグループ化され、近傍との強い相関関係はありません。明らかな構造的特徴の重複または欠如。2回目の3D分類の後、最も高い解像度のカテゴリが選択されました[RC-LH114-Wの場合、1つのカテゴリは377,703粒子（44.5%）、RC-LH116の場合、2つのカテゴリがあり、合計260,752粒子（54.7%）です。これらは、最初の回転後にわずかな違いで整列した場合にのみ同じです]。選択された粒子は 400 ピクセルのボックスで再抽出され、3D 精製によって精製されます。溶媒マスクは、最初の 15Å ローパスフィルター、3 ピクセル マップ拡張、および 3 ピクセル ソフトマスクを使用して生成されます。粒子ごとの CTF 精製、粒子ごとのモーション補正、および 2 回目の粒子ごとの CTF 精製を使用して、各ステップの後に 3D 精製、溶媒マスキング、および後処理が実行され、結果として得られるテクスチャがさらに精製されます。FSC (フーリエ シェル相関係数) カットオフ値 0.143 を使用すると、RC-LH114-W および RC-LH116 の最終モデルの解像度はそれぞれ 2.65 Å および 2.80 Å になります。最終モデルの FSC 曲線は図 2. S17 に示されています。
すべてのタンパク質配列はUniProtKBからダウンロードされました: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)。SWISS-MODEL (45) を使用してRCの相同性モデルを構築しました。このモデルにはRC-L、RC-M、RC-Hのタンパク質配列と、Rba. sphaeroides RCの結晶構造がテンプレートとして使用されました (PDB ID: 5LSE) (46)。 UCSF Chimera の「fit map」ツールを使用して、生成されたモデルをマップ (47) に適合させ、タンパク質構造を改善し、Coot (48) を使用して補因子 [4×BChl a (モノマーライブラリの残基名 = BCL)、2×BPh a (BPH)、1 種類または 2 種類の UQ10 (U10)、1 つの非ヘム鉄 (Fe)、および 1 つの 3,4-ジヒドロヘキサカルボニルコリン (QAK)] を追加します。QAK はモノマーライブラリにないため、PHENIX (49) の eLBOW ツールを使用してパラメーター化しました。
次に、LH1サブユニットを構築した。まず、PHENIX (49) の自動構築ツールを使用して、マップとLH1-αおよびLH1-βタンパク質配列を入力として、LH1配列の一部を自動的に構築した。最も完全なLH1サブユニットを選択し、それを抽出してCootにロードし、不足している配列を手動で追加し、関連するRps LH1複合体の密度と既知のカロテノイド含有量(17)に従って、2つのBCl a (BCL)とスピリロキサンチン(CRT)を追加する前に、構造全体を手動で精緻化した。完全なLH1サブユニットをコピーし、UCSF Chimeraの「Docking Map Tool」を使用して、LH1密度の隣接する非モデル領域にドッキングし、Cootで精緻化した。すべてのLH1サブユニットがモデル化されるまで、このプロセスを繰り返した。 RC-LH114-W 構造の場合、Coot で未割り当ての密度を抽出することにより、USCF Chimera マップでタンパク質が残りの非タンパク質成分からセグメント化され、Autobuild ツールを使用して初期モデルが確立され、残りのサブユニット (タンパク質-W) のモデリングが PHENIX (49) で行われます。Coot (48) で結果のモデルに不足している配列を追加し、サブユニット全体を手動で改良します。残りの未割り当ての密度は、脂質 (CDL = CDL、POPC = 6PL、POPG = PGT の PDB モノマーライブラリ ID)、β-DDM 界面活性剤 (LMT)、および UQ10 分子 (U10) の組み合わせに適合します。PHENIX 最適化 (49) と Coot (48) での手動最適化を使用して、モデル統計と適合の視覚的品質がこれ以上改善できなくなるまで、完全な初期モデルを完成させます。最後に、LocScale (50) を使用してローカルマップをシャープにし、その後、未割り当て密度のモデリングと自動および手動最適化のサイクルを数回実行します。
それぞれのペプチド、補因子、その他の脂質およびキノンがそれぞれの密度内にドッキングした様子を図1および図2に示します。S18～S23。最終モデルの統計情報は表S1に示されています。
特に指定がない限り、UV/Vis/NIR吸収スペクトルは、Cary60分光光度計（Agilent社、米国）を用いて、250 nmから1000 nmまで1 nm間隔で、0.1秒の積分時間で測定した。
試料を光路長2 mmの石英キュベットで希釈し、A880を1とし、400～1000 nmの吸収スペクトルを測定した。円偏光二色性スペクトルは、Jasco 810分光偏光計（日本分光）を用いて、400 nm～950 nmの範囲で1 nm間隔、20 nm min⁻¹の走査速度で測定した。
モル吸光係数は、コア複合体を約 50 の A880 に希釈することによって決定されます。10μl の容量を 990μl の結合バッファーまたはメタノールで希釈し、BChl の分解を最小限に抑えるために、すぐに吸収スペクトルを収集します。各メタノールサンプルの BChl 含有量は、771 nm での 54.8 mM-1 cm-1 の吸光係数によって計算され、吸光係数が決定されました (51)。測定された BChl 濃度を 32 (RC-LH114-W) または 36 (RC-LH116) で割ってコア複合体濃度を決定し、次に、バッファーで収集された同じサンプルの吸光スペクトルを決定するために使用します。吸光係数。並行。各サンプルについて 3 回繰り返し測定を行い、BChl Qy 最大値の平均吸光度を使用して計算しました。 RC-LH114-Wの878 nmにおける消光係数は3280±140 mM-1 cm-1であり、RC-LH116の880 nmにおける消光係数は3800±30 mM-1 cm-1である。
UQ10は（52）の方法に従って定量した。簡単に言うと、Agilent 1200 HPLCシステムを使用して逆相HPLC（RP-HPLC）を行った。約0.02 nmolのRC-LH116またはRC-LH114-Wを0.02%（w/v）塩化第二鉄を含む50:50メタノール：クロロホルム50μlに溶解し、平衡化済みのBeckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mmカラムに、40℃で1 ml-1 min-1の速度でHPLC溶媒（80:20メタノール：2-プロパノール）を注入する。HPLC溶媒で等濃度溶出を行い、275 nm（UQ10）、450 nm（カロテノイド）、780 nm（BChl）の吸光度を1時間モニタリングする。 275 nmクロマトグラムの25.5分におけるピークを積分したが、このピークには他の検出可能な化合物は含まれていなかった。積分面積を用いて、0～5.8 nmolの純粋な標準物質を注入して作成した検量線（図S14）を参照し、抽出されたUQ10のモル量を算出した。各サンプルは3回繰り返し分析し、報告されている誤差は平均値の標準偏差に相当する。
最大 Qy 吸収が 0.1 の RC-LH1 複合体を含む溶液を、30 μM の還元型ウマ心臓シトクロム c2 (Merck、英国) と 0 ～ 50 μM MUQ2 (Merck、英国) を用いて調製した。各 UQ2 濃度で 1 ml のサンプルを 3 つ調製し、測定前に暗所への完全な順応を確保するため、4°C で一晩暗所でインキュベートした。溶液を、300 nm フレーム/500 ライン グレーティング、1.24 mm の入口スリット、0.12 mm の中央スリット、および 0.6 mm の出口スリットを備えた OLIS RSM1000 モジュラー分光光度計にロードした。励起光を遮断するために、サンプル光電子増倍管と参照光電子増倍管の入口に 600 nm ロングパス フィルターを配置した。吸光度は 550 nm で、積分時間 0.15 秒でモニターした。励起光は、880 nm M880F2 LED（発光ダイオード）（Thorlabs Ltd.、英国）から光ファイバーケーブルを介してDC2200コントローラ（Thorlabs Ltd.、英国）を介して90%の強度で放出され、光源に対して90°の角度で放出されます。測定ビームは、サンプルによって最初に吸収されなかった光を反射するためにミラーに反対向きに配置されます。50秒間の照射の10秒前に吸光度を監視します。その後、キノロールがシトクロムc23+を自発的に還元する程度を評価するために、暗所でさらに60秒間吸光度を監視しました（生データについては図S8を参照）。
データは、0.5～10秒（UQ2濃度に応じて）の範囲で線形初期速度を当てはめ、各UQ2濃度における3つのサンプルすべての速度を平均化することによって処理された。それぞれの消光係数によって計算されたRC-LH1濃度を使用して速度を触媒効率に変換し、Origin Pro 2019（OriginLab、米国）でプロットし、ミカエリス・メンテンモデルに当てはめて見かけのKm値とKcat値を決定した。
過渡吸収測定では、RC-LH1サンプルを、50 mMアスコルビン酸ナトリウム（Merck、米国）と0.4 mMテルブチン（Merck、米国）を含むIMACバッファーで約2μMに希釈した。アスコルビン酸は犠牲電子供与体として、tert-ブタクロフェンはQB阻害剤として使用され、測定プロセス全体を通して主要なRC供与体が還元状態（すなわち光酸化されない状態）に保たれるようにする。約3 mlのサンプルを、光路長2 mmのカスタム回転セル（直径約0.1 m、350 RPM）に加え、レーザー光路内のサンプルが励起パルス間の暗順応に十分な時間を確保できるようにした。約 100 fs のレーザー パルスを使用して Ti: サファイア レーザー システム (Spectra Physics、米国) を増幅し、880 nm でサンプルを 1 kHz の繰り返し周波数 (NIR の場合は 20 nJ、Vis の場合は 100 nJ) で励起します。データ収集の前に、サンプルを励起光に約 30 分間曝露します。曝露により QA が不活性化されます (QA が 1 回または 2 回減少する可能性があります)。ただし、長時間の暗順応の後、RC は徐々に QA 活性に戻るため、このプロセスは可逆的であることに注意してください。Helios 分光計 (Ultrafast Systems、米国) を使用して、遅延時間 -10 ～ 7000 ps の過渡スペクトルを測定しました。Surface Xplorer ソフトウェア (Ultrafast Systems、米国) を使用してデータセットをグループ解除し、マージして標準化します。 CarpetViewソフトウェアパッケージ（Light Conversion Ltd.、リトアニア）を使用して、結合データセットから減衰に関連する差分スペクトルを取得するか、Origin（OriginLab、米国）で複数の指数を機器応答と畳み込む関数を使用して単一波長スペクトル変化に適合させます。
前述の通り（53）、RCと末梢LH2アンテナの両方を欠くLH1複合体を含む光合成膜を調製した。膜を20 mMトリス（pH 8.0）で希釈し、光路長2 mmの石英キュベットにロードした。30 nJのレーザーパルスを用いて、遅延時間-10～7000 psで540 nmのサンプルを励起した。データセットの処理は、Rps. palサンプルについて説明したとおりに行った。
膜は、4℃で2時間、150,000 RCFで遠心分離してペレット化し、その後、880 nmでの吸光度を20 mMトリス-HCl（pH 8.0）と200 mM NaClに再懸濁した。膜を2%（w/v）β-DDMで4℃の暗所で1時間ゆっくり撹拌して溶解した。サンプルを100 mMトリエチルアンモニウムカーボネート（pH 8.0）（TEAB；Merck、英国）でタンパク質濃度2.5 mg ml-1（Bio-Rad分析）に希釈した。さらに処理は、以前に発表された方法（54）に従って、50 μgのタンパク質を1%（w/v）ラウリン酸ナトリウム（Merck、英国）を含む合計50 μlのTEABに希釈することから開始して行った。 60秒間の超音波処理後、37℃で30分間、5 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(Merck、英国)で還元した。S-アルキル化の場合、サンプルを10 mMメチルS-メチルチオメタンスルホン酸(Merck、英国)とインキュベートし、200 mMイソプロパノールストック溶液から添加して室温で10分間インキュベートした。タンパク質分解は、2 μgのトリプシン/エンドプロテイナーゼLys-C混合物(Promega UK)を添加し、37℃で3時間インキュベートすることによって行った。ラウリン酸界面活性剤は、50 μlの酢酸エチルと10 μlの10% (v/v) LCグレードトリフルオロ酢酸(TFA; Thermo Fisher Scientific、英国)を添加し、60秒間ボルテックスすることによって抽出した。 15,700 RCFで5分間遠心分離することにより、相分離が促進された。製造元のプロトコルに従い、C18スピンカラム（Thermo Fisher Scientific、英国）を用いて、ペプチドを含む下層を慎重に吸引し、脱塩した。真空遠心分離により乾燥後、サンプルを0.5% TFAと3%アセトニトリルに溶解し、500 ngを、前述のシステムパラメータを用いて、質量分析計と組み合わせたナノフロー逆相クロマトグラフィーにより分析した。
Rps. palustrisのプロテオームデータベース（www.uniprot.org/proteomes/UP000001426）を検索するためのタンパク質同定および定量には、MaxQuant v.1.5.3.30（56）を使用してください。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子PXD020402の下、PRIDEパートナーリポジトリ（http://proteomecentral.proteomexchange.org）を通じてProteomeXchange Allianceに登録されています。
エレクトロスプレーイオン化質量分析法と組み合わせたRPLCによる分析のために、RC-LH1複合体は野生型Rpsから調製した。以前に発表された方法（16）を使用して、palustris細胞で生成されたタンパク質濃度は、20 mM Hepes（pH 7.8）、100 mM NaCl、および0.03%（w/v）β-（Bio-Rad分析）DDMで2 mg ml-1であった。製造元のプロトコルに従って、2D精製キット（GE Healthcare、米国）を使用して沈殿法により10 μgのタンパク質を抽出し、沈殿物を20 μlの60%（v/v）ギ酸（FA）、20%（v/v）アセトニトリル、および20%（v/v）水に溶解した。5マイクロリットルを質量分析法（Maxis UHR-TOF、Bruker）と組み合わせたRPLC（Dionex RSLC）で分析した。 60℃、100μlmin -1 の条件で、MabPac 1.2×100 mm カラム (Thermo Fisher Scientific、英国) を使用して、85% (v / v) 溶媒 A [0.1% (v / v) FA および 0.02% (v/v) TFA 水溶液] から 85% (v/v) 溶媒 B [0.1% (v/v) FA および 0.02% (v/v) を 90% (v/v) アセトニトリル TFA に溶解] へのグラジエントで分離します。標準のエレクトロスプレーイオン化源とデフォルトパラメータを使用して 60 分以上、質量分析計は 100 ～ 2750 m/z (質量電荷比) を取得します。ExPASy バイオインフォマティクス リソース ポータル FindPept ツール (https://web.expasy.org/findpept/) を使用して、質量スペクトルを複合体のサブユニットにマッピングします。
細胞は、100 mlのNF低（10μMm-2 s-1）、中（30μMm-2 s-1）または高（300μMm-2 s-1）光の下で72時間培養した。M22培地（硫酸アンモニウムを省略し、コハク酸ナトリウムを酢酸ナトリウムに置き換えたM22培地）を100 mlのスクリューキャップボトル（23）に入れた。5回の30秒サイクルで、0.1ミクロンのガラスビーズを体積比1:1でビーズ化して細胞を溶解し、氷上で5分間冷却した。不溶性物質、未破壊細胞、およびガラスビーズは、卓上マイクロ遠心機で16,000 RCFで10分間遠心分離して除去した。膜は、20 mMトリス-HCl（pH 8.0）溶液中で、40/15%（w/w）のスクロース濃度勾配を用いて、100,000 RCFのTi 70.1ローターで10時間分離した。
以前の研究で説明したように、PufW の His タグの免疫検出 (16)。簡単に言うと、精製されたコア複合体 (11.8 nM) または同じ濃度の RC (還元差スペクトルを酸化して染色ゲル上の負荷と一致させることで決定) を含む膜を 2 倍希釈した 2x SDS ローディングバッファー (Merck、英国) に溶解した。タンパク質はレプリカ 12% ビス-トリス NuPage ゲル (Thermo Fisher Scientific、英国) で分離した。ゲルを Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad、英国) で染色し、RC-L サブユニットをロードして可視化した。2 番目のゲル上のタンパク質をメタノール活性化ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Thermo Fisher Scientific、英国) に転写し、免疫測定を行った。 PVDFメンブレンを50 mMトリス-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、0.2%（v/v）Tween-20、5%（w/v）脱脂粉乳でブロッキングし、その後抗His一次抗体（抗体バッファー[50 mMトリス-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、0.05%（v/v）Tween-20]で1:1000に希釈したA190-114A、Bethyl Laboratories、USA）と4時間インキュベートした。抗体バッファーで5分間ずつ3回洗浄した後、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich、英国）抗マウス二次抗体（抗体バッファーで1:10,000に希釈）と混合し、WESTAR ETA C 2.0化学発光基質（Cyanagen、イタリア）とAmersham Imager 600（GE Healthcare、英国）を使用して検出できるようにインキュベートした（抗体バッファーで3回洗浄後5分間）。
ImageJ (57) で、染色ゲルまたは免疫アッセイレーンごとの強度分布を描画し、ピーク下の面積を積分して、RC-L (染色ゲル) と Protein-W (免疫アッセイ) の強度比を計算し、画像を処理します。これらの比率は、純粋な RC-LH114-W サンプル中の RC-L と protein-W の比率が 1:1 であると仮定し、データセット全体をそれに応じて正規化することにより、モル比に変換されました。
本記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 を参照してください。
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反応中心における光トラップ1複合体の高解像度構造は、キノンのダイナミクスに関する新たな知見をもたらす。
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