現住所: OX11 0DE、英国、Diamond Building、Harwell Science and Innovation Park、Dietcote、Oxfordshire、英国、Diamond Light Source Co., Ltd.、電子生物画像センター。
反応中心集光複合体1（RC-LH1）は、紅色光合成細菌のコア光合成構成要素です。Rhodopseudomonas palustris由来のRC-LH1複合体のクライオ電子顕微鏡構造を2つ紹介しました。RC-LH114-W複合体の2.65Å分解能構造は、RCを囲む14個のサブユニットLH1ループで構成され、タンパク質Wによって中断されています。一方、タンパク質Wを含まない複合体は、RCに囲まれた完全なRC構成です。16個のサブユニットLH1ループが閉じています。これらの構造の比較により、RC-LH1複合体におけるキノンの動態に関する知見が得られ、RCのQB部位にキノンが結合する際のこれまで未解明だった構造変化や、キノンをRCに渡すのに役立つ補助的なキノン結合部位の位置などが明らかになりました。 W タンパク質の独特な構造により、LH1 ループの閉鎖が阻止され、キノン/キノロン交換を促進するチャネルが形成されます。
光合成によって供給されるエネルギーは、地球上のほぼすべての生命を支えることができ、太陽光バイオテクノロジーにとって大きな可能性を秘めています。紅色光栄養細菌は、地球規模の光合成を促進する一方で、多様なエネルギーモードと代謝能力も示しています。例えば、光合成を回避して暗所で従属栄養細菌として増殖し、窒素と二酸化炭素を固定し、水素を生成し、芳香族化合物を分解することができます(1-3)。これらのプロセスに必要なエネルギーを供給するためには、光を迅速かつ効率的に化学エネルギーに変換する必要があります。このプロセスは、光捕捉アンテナ複合体が光を吸収し、捕捉されたエネルギーを反応中心（RC）に伝達することで開始され、電荷分離が開始されます(4-7)。紅色光栄養細菌における光合成の基本単位は、タイプ2 RCと、それを囲む光捕集複合体1（LH1）で構成され、RC-LH1コア複合体を形成します。LH1は、湾曲したαβヘテロ二量体の配列から構成され、各二量体は2つの細菌クロロフィル（BChl）a分子と1つまたは2つのカロテノイドを結合しています(8-12)。最も単純な LH1 アンテナは、RC (9-13) を囲む 16 個または 17 個の αβ ヘテロ二量体から構成され、閉ループを形成していますが、他のコア複合体では、膜貫通ペプチドが周囲の LH1 の連続性を遮断し、RC とシトクロム bc1 複合体間のキノール/キノンの拡散を促進しています (11、13-15)。紫色光合成植物ロドシュードモナス (Rps.) は、光合成を支えるエネルギーと電子の移動を理解できるモデル生物です。Rps. の最初の結晶構造。パルストリス RC-LH1 複合体のモデルは、15 個のヘテロ二量体 LH1 ループに囲まれた RC で、このループは「タンパク質 W」と呼ばれる未知のタンパク質によって遮断されています (14)。その後、タンパク質WはRPA4402として同定されました。これは、3つの膜貫通ヘリックス（TMH）を有する、未解析の10.5kDaタンパク質です（16）。我々は、タンパク質Wをコードするrpa4402遺伝子を、RC-L、M（pufL、pufM）およびLH1α、β（pufA、pufB）サブユニットをコードする遺伝子に使用されている命名法と一致するように、pufWに改名することを提案します。興味深いことに、タンパク質WはRC-LH1の約10%にしか存在せず、Rps. palustrisが2つの異なるRC-LH1複合体を生成することを示しています。本稿では、タンパク質Wと14個のαβヘテロダイマーを含む複合体と、タンパク質Wを含まず、16個のヘテロダイマーLH1閉じループを含む複合体の2つのコア複合体の高解像度クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）構造を報告します。我々の構造は、Rps. palustris の RC-LH1 複合体の理解を大きく前進させるものである。なぜなら、我々は各変異体の均質な集団を分析し、各ペプチドと結合した色素、関連脂質およびキノンを明確に割り当てるのに十分な解像度を有しているからである。これらの構造の比較により、これまで他の RC-LH1 複合体には見つかっていない 3 つの TMH タンパク質-W がキノンチャネルを生成し、キノン/キノロン交換を促進することが示されている。多数の保存された脂質およびキノン結合部位が同定され、キノンと RC の結合後に生じる新しい構造変化が明らかになった。これは、酸素化光合成生物の光化学系 II (PSII) RC に適している可能性がある。我々の研究結果は、紅色光合成細菌の RC-LH1 コア複合体におけるキノン/キノロンの結合および交換の速度論に関する新たな知見をもたらす。
Rps. palustrisに見られる2つの複合体の詳細な研究を容易にするため、生化学的手法を用いてそれぞれのRC-LH1を単離した。タンパク質W欠損複合体（以下、ΔpufWと略す）は、pufW遺伝子を欠損した株（16）から精製され、1つのRC-LH1複合体のみが産生された。タンパク質W含有複合体は、ある株によって産生される。この株のタンパク質Wは、C末端に10倍ヒスチジンタグが修飾されており、金属を固定化することで、タンパク質W含有複合体は、最も欠損しているタンパク質Wと効果的に結合することができる。複合体は、（16）アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）によって効果的に分離される。
図1に示すように、両複合体は3つのサブユニットからなるRC（RC-L、RC-M、RC-H）を含み、その周囲にはLH1アンテナが存在します。タンパク質Wを欠く複合体の2.80Å構造は、16個のαβヘテロダイマーからなり、RCを完全に取り囲む閉じたLH1ループを形成しています。以下、これをRC-LH116複合体と称します。タンパク質Wを含む複合体の2.65Å構造は、タンパク質Wによって分断された14個のヘテロダイマーLH1を有しており、以下、RC-LH114-Wと称します。
(AとB) 化合物の表面表現。 (CとD) 桿体で表現された結合色素。 (EとF) 細胞質表面から観察された複合体は、漫画で表現されたペプチドとLH1サブユニットを有し、タンパク質-Wギャップから時計回りに番号が付けられている[Rba番号付けと一致している。 sphaeroides複合体(13)]。LH1-αの場合、タンパク質サブユニットの色は黄色、LH1-βの場合、タンパク質サブユニットの色は青、タンパク質-Wの場合、タンパク質は赤、RC-Hの場合、それはシアン、RC-Lの場合、それはオレンジ、RC-Mの場合、それはマゼンタである。補因子は桿体で表現され、緑はBChlとBPh a分子、紫はカロテノイド、黄色はUQ10分子を表す。 (GおよびH) RC-LH114-W複合体(G)およびRC-LH116複合体(H)の等価領域におけるタンパク質-Wギャップの拡大図。補因子は空間充填の形で表示され、キレート化キノンは青色で示されている。(G)ではタンパク質-Wギャップが青色の破線で強調表示され、(H)ではキノン／キノロールがLH116リング上で拡散する小さな穴が黒色の破線で強調表示されている。
図 1 (A および B) は、それぞれ 2 つの BChl と 1 つのカロテノイドに結合した LH1αβ ヘテロダイマーのオープンまたはクローズドアレイに囲まれた RC を示しています (図 1、C および D)。以前の研究で、Rps が LH1 複合体であることが示されています。スピルリナ キサンチンの生合成経路では、これらの種にはカロテノイドの混合集団が含まれています (17)。しかし、スピロピロキサンチンが主要なカロテノイドであり、その密度は十分です。したがって、すべての LH1 結合部位でスピロキサンチンをモデル化することを選択しました。アルファおよびベータ ポリペプチドは、短い膜外領域を持つ単一の TMH です (図 1、A、B、E、および F)。C 末端の 17 残基の密度は観察されませんでしたが、両方の複合体でアルファポリペプチドは Met1 から Ala46 に切断されていました。 RC-LH116ではβポリペプチドがGly4からTyr52に、RC-LH114-WではSer5からTyr52に還元された。3つまたは4つのN末端残基、あるいは13のC末端残基の密度は観察されなかった（図S1）。野生型株から調製した混合RC-LH1複合体の質量分析は、失われた領域がこれらのペプチドの異種切断の結果であることを示した（図S1およびS2）。α-Met1のN末端ホルミル化も観察された（f）。分析は、αペプチドが残基fMet1からAsp42/Ala46/Ala47/Ala50で構成され、βペプチドが残基Ser2からAla53で構成されていることを示しており、これは低温EM密度マップとよく一致する。
α-His29とβ-His36の配位により、BChlは向かい合うようになり、各αβヘテロダイマーは近隣のものと集まって、RC励起子結合色素アレイの周りに開ループ（RC-LH114-W）または閉ループ（RC-LH116）を形成します（図1、CおよびD）。RC-LH114-Wの877 nmバンドと比較すると、RC-LH116の880 nm吸収レッドシフトは3 nmです（図2A）。ただし、円偏光二色性スペクトルはほぼ同じであり（図2B）、開ループと閉ループには明らかな違いがあるものの、BChlの局所環境は非常に類似していることを示しています。吸収レッドシフトは、閉ループ上の熱運動の減少と安定性の増加（18、19）、閉ループによって引き起こされる色素結合の変化（20、21）、またはこれら2つの効果の組み合わせ（11）の結果である可能性があります。
(A) 紫外/可視/近赤外吸収スペクトル。ピークは対応する色素でマークされ、775 nmのBPhピークに標準化されています。 (B) 805 nmのBChl吸光度に標準化された円二色性スペクトル。 (CとD) RC-LH114-W複合体 (C) とRC-LH116複合体 (D) の時間分解吸収スペクトルから選択されたΔAスペクトル。比較しやすくするために、すべてのスペクトルは、0.2 psでの−AのΔAに標準化されています。 (E) さまざまな濃度のUQ2存在下での照射後のシトクロムc2酸化速度（生データは図S8を参照）。 (F) 低、中、高強度光（それぞれ10、30、300μMm-2 s-1）下で増殖した細胞における、精製された複合体中のタンパク質WおよびRC-Lサブユニットと分離された膜比。 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫測定によりタンパク質レベルを測定する（生データは図S9を参照）。精製RC-LH114-W複合体に対する比率を決定する。複合体中のRC-Lとタンパク質Wの化学量論比は1:1である。
RC-LH114-W の変形した αβ14 ループの位置 1 にある BChl (図 1、A、C、E) は、RC-LH116 の同等の BChl (図 1、B、D、F、図 S3) よりも RC 一次ドナー (P) に 6.8Å 近くなっています。ただし、2 つの複合体の過渡吸収速度論では、RC-LH114-W と RC-LH116 の場合、LH1 から RC への励起エネルギー移動時間定数はそれぞれ 40 ± 4 ps と 44 ± 3 ps です (図 2、C と D、図 S4 と表 S2)。RC 内の電子移動にも大きな差はありません (図 S5 と関連補足テキスト)。 LH1とRC-P間のエネルギー移動時間の密接な一致は、2つのLH1ループ内のほとんどのBChlの距離、角度、およびポテンシャルエネルギーが類似していることに起因すると考えられます。LH1のエネルギーパターンを探索して最短距離に到達することは、最適ではない部位からRCへの直接エネルギー移動よりも速くないようです。RC-LH114-Wの開ループLH1ループは、構造解析のための低温条件下ではわずかな熱運動を受ける可能性があり、RC 1の位置にあるβBChlの色素沈着距離から室温ではより長いαβ14リング構造が存在します。
RC-LH116複合体は32個のBChlと16個のカロテノイドを含み、その全体的な配列はThermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9)、Thiorhodovibrio (Trv.) 970株 (PDB ID 7C9R) (12)、および緑藻類 (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) から得られたものと同一である。アライメント後、αβヘテロダイマーの位置、特に1-5、15、および16の位置にわずかなずれが観察された（図S6）。タンパク質Wの存在はLH1の構造に大きな影響を与える。その3つのTMHは短いループで接続されており、N末端は複合体の内腔側に、C末端は細胞質側にあります（図1Aおよび3、A～D）。タンパク質Wは大部分が疎水性であり（図3B）、TMH2およびTMH3はLH1αβ-14と相互作用して膜貫通表面を形成します（図3、BおよびE～G）。膜貫通領域の界面は主にフェニルアラニン、ロイシン、およびバリン残基で構成されています。これらの残基は、疎水性アミノ酸およびαβ-14色素と積み重ねられています。複合体キャビティの表面にあるW-Thr68とβ-Trp42の間の水素結合など、いくつかの極性残基も相互作用に寄与しています（図3、FおよびG）。細胞質表面では、Gln34がαβ-14カロテノイドのケト基に隣接しています。さらに、n-ドデシルβ-D-マルトシド（β-DDM）分子が分離され、その疎水性テールはタンパク質Wとαβ-14の界面まで伸びており、脂質テールは体内に位置する可能性があることが明らかになった。また、タンパク質WとRCHのC末端分離領域は非常に近いものの、特異的な相互作用を形成する範囲にはないことも明らかになった（図1、AおよびE）。しかしながら、これら2つのタンパク質の未分離C末端アミノ酸には相互作用が存在する可能性があり、これがRC-LH114-W複合体の組み立て中にタンパク質Wがリクルートされるメカニズムとなる可能性がある。
(A) 漫画形式で LH1αβ14 との界面に面するタンパク質 W は棒状の側鎖 (赤) を持ち、静電ポテンシャル図の一部 (等高線レベル 0.13 の透明な灰色の表面) に表示されています。 (B) 疎水性色の表面で表されたタンパク質 W。極性および荷電領域はシアン色で、疎水性領域は白色で、強い疎水性領域はオレンジ色で表示されます。 (C および D) 漫画形式で表されたタンパク質 W。方向は (A) と同じ (C) で、180° 回転しています (D)。配列内の位置に応じて、識別可能な残基は虹色の配色を採用し、N 末端は青、C 末端は赤です。 (E) (A) と同じビューのタンパク質 W。タンパク質 W:LH1 の界面にある残基は、マークが付いた棒で表されています。 (F) タンパク質Wは、漫画表示では(E)およびLH1αβ14に対して、棒グラフ表示では界面残基に対して90°回転している。βポリペプチドからのオーバーハング残基にはラベルが付けられている。補因子は図1の色と一致する棒グラフで示され、分解されたβ-DDMは灰色で、酸素は赤色で示されている。(G) (F)は180°回転しており、ラベル付けされたαポリペプチドの顕著な残基が示されている。
タンパク質Wはαβヘテロダイマー（図1Fの15番目）を置換し、それによってループの閉鎖を防ぎ、最初の3つのαβヘテロダイマーを傾けます。フィルム法線に対する最初のαβ-1ヘテロダイマーの最大傾斜角は25°～29°（図1、AおよびE）であることが観察されましたが、これはRC A sharp contrast-LH116のαβ-1の2°～8°の傾斜によって形成されました（図1、BおよびF）。2番目と3番目のヘテロダイマーは、それぞれ12°～22°と5°～10°傾斜しています。RCの立体障害により、αβ-1の傾斜には2番目のαβペア（図1Fの16番目のαβに相当）が含まれず、そのためLH1リングに明確なギャップが形成されます（図1、AおよびE）。 2つのαβヘテロダイマーの欠如、それに伴う4つのBChlと2つのカロテノイドの喪失により、いずれのカロテノイドもねじれたαβ-1サブユニットに結合せず、結果として13個のベジタリアンカロテノイドと28個のBChlを含むLH114-Wリングが形成される。αβ1から7領域における2つの複合体の局所分解能の推定値は、LH1ループの残りの部分よりも低く、これはRC QB部位に隣接するLH1サブユニットの固有の可塑性を反映している可能性がある（図4）。
RC-LH114-W（AとB）とRC-LH116（CとD）の写真は、図1と同じ上面図／側面図（AとB）、（AとC）、およびキャビティ面（BとD）から撮影したものです。色分けされたキーは右側に表示されています。
他に化学量論比1:14を示す特徴的なコア複合体は、Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX二量体(13)のみである。しかし、タンパク質WとPufXには明らかな相同性がなく、それぞれのLH1構造に大きな影響を与える。PufXは、Rps. palustris LH116αβ-16に対応する位置でRC-Hサブユニット(13)の細胞質側と相互作用するN末端細胞質ドメインを有する単一のTMHである。PufXは、RC-LH1とシトクロムbcl複合体間のキノン/キノロン交換のためのチャネルを形成し、すべてのRba. sphaeroidesコア複合体(13)に存在する。モノマー間界面はRba.スフェロイデスRC-LH1-PufX二量体は、RC-LH114-Wのタンパク質Wの結合位置に位置しており、PufXとタンパク質Wによって誘導されるギャップは同等の位置にあります（図S7A）。RC-LH114-Wのギャップは、タンパク質WやPufXとは無関係のペプチドによって形成される、シュードモナス・ロゼアLH1の仮説上のキノンチャネル（8）とも一致しています（図S7B）。さらに、Blcのキノンチャネル。1つのγサブユニットを除外して形成されるエメラルドグリーンLH1（7）も同様の位置にあります（図S7C）。異なるタンパク質が媒介しているにもかかわらず、これらのキノン/キノロールチャネルがRC-LH1複合体の共通する位置に出現したことは、収斂進化の一例であると考えられ、タンパク質Wによって作成されたギャップがキノンチャネルとして機能する可能性があることを示唆しています。
LH114-W ループのギャップにより、タンパク質の場合のように 2 つのドメインがタンパク質細孔を介して接続されるのではなく、RC-LH114-W 複合体の内部空間とバルク膜との間に連続した膜領域の形成が可能になります (図 1G)。RC-LH116 複合体は、閉じた Tch. 針状複合体 (22) に似ています (図 1H)。膜を通過するキノンの拡散は狭いタンパク質チャネルを通過する拡散よりも速いため、開いた LH114-W ループでは閉じた LH116 ループよりも RC のターンオーバーが速くなり、RC へのキノンの拡散はより制限される可能性があります。タンパク質 W が RC を介したキノンの変換に影響を与えるかどうかをテストするために、特定の濃度のユビキノン 2 (UQ2) (より短いイソプレン テールを持つ天然 UQ10 の類似体) に対してシトクロム酸化アッセイを実行しました (図 2E)。キレート化キノンの存在により見かけのミカエリス定数の正確な測定が妨げられるものの（RC-LH114-W および RC-LH116 はそれぞれ 0.2±0.1μM および 0.5±0.2μM に適しています）、RC-LH114-W の最大速度（4.6±0.2 e-RC-1 s-1）は RC-LH116（3.6±0.1 e-RC-1 s-1）よりも 28±5% 大きくなります。
我々は当初、タンパク質Wがコア複合体の約10％に存在すると推定した（16）。ここでは、低光量、中光量、および高光量で増殖した細胞の占有率はそれぞれ15±0.6％、11±1％、および0.9±0.5％であった（図2F）。質量分析による定量的な比較では、ヒスチジンタグの付加が野生型株と比較してタンパク質Wの相対的存在量を減少させなかったことが示された（P = 0.59）。したがって、これらのレベルは改変されたタンパク質Wによるアーティファクトではない（図S10）。しかし、RC-LH1複合体におけるタンパク質Wのこの低い占有率は、一部のRCが加速された速度で反転することを可能にし、それによってRC-LH116複合体におけるより遅いキノン/キノロン交換を緩和する可能性がある。高い光占有率は、pufW遺伝子の発現が強光下で増加することを示唆する最近のトランスクリプトミクスデータ（図S11）（23）と矛盾していることに気付きました。pufWの転写とRC-LH1複合体へのタンパク質Wの取り込みの違いは紛らわしく、タンパク質の複雑な制御を反映している可能性があります。
RC-LH114-Wには、6つのカルジオリピン（CDL）、7つのホスファチジルコリン（POPC）、1つのホスファチジルグリセロール（POPG）、および29のβ-DDM分子が割り当てられており、その中に6つのCDL、24のPOPC、2つのPOPG、および12のβDDMがモデル化されています。 RC-LH116（図5、AおよびB）。これら2つの構造では、CDLは複合体の細胞質側にほぼ位置しているのに対し、POPC、POPG、およびβ-DDMは主に内腔側に位置している。 RC-LH114-W複合体のαβ-1からαβ-6領域では2つの脂質分子と洗剤分子が単離され（図5A）、RC-LH116の同等の領域では5つが単離された（図5B）。複合体の反対側にも脂質が多く見られ、主に CDL が RC と αβ-7 ～ αβ-13 の間に蓄積していました (図 5、A および B)。構造が解明されたその他の脂質と洗剤は LH1 リングの外側に位置し、よく解明されたアシル鎖が LH1 サブユニット間に伸びており、RC-LH114-W では暫定的に β-DDM と命名され、RC では β-DDM と POPC-LH116 の混合物として定義されています。我々の構造におけるキレート脂質と洗剤の位置が類似していることから、これらが生理学的に関連する結合部位であることが示されています (図 S12A)。Tch 内の同等の分子の位置も良好な一貫性を示しています。株970 RC-LH1s（図S12、B〜E）（9、12）および脂質ヘッドグループの水素結合残基は、配列アライメントでかなり良好な保存性を示し（図S13）、RCに結合する保存されたCDL（24）を示しており、これらの部位はRC-LH1複合体で保存されている可能性がある。
(A および B) RC-LH114-W (A) および RC-LH116 (B) ペプチドは漫画で表され、色素は図 1 の配色を使用して棒で表されます。脂質は赤、界面活性剤は灰色で表示されます。RC QA および QB 部位に結合した UQ は黄色、孤立した UQ は青です。(C および D) (A) および (B) と同じ図ですが、脂質は省略されています。(E～G) RC-LH116 の Q1(E)、Q2(F)、および Q3(G) の拡大図。側鎖は互いに影響を及ぼします。水素結合は黒の破線で表示されます。
RC-LH116 では、電荷分離プロセスで電子移動に関与する RC QA と QB UQ の両方が、その結合部位で分解されています。 しかし、RC-LH114-W では、QB キノンは分解されておらず、以下で詳しく説明します。 QA および QB キノンに加えて、2 つのキレート化 UQ 分子 (RC リングと LH1 リングの間に位置) が、十分に分解されたヘッド グループ (それぞれ Q1 および Q2 に位置) に従って RC-LH114-W 構造に割り当てられています。 スペース)。 図 5C)。 2 つのイソプレン ユニットが Q1 に割り当てられ、密度マップは Q2 の完全な 10 個のイソプレン テールを分解します。 RC-LH116 の構造では、3 つのキレート化 UQ10 分子 (Q1 ～ Q3、図 5D) が分解され、すべての分子のテール全体で明確な密度があります (図 5、D ～ G)。 2 つの構造において、Q1 および Q2 のキノンヘッドグループの位置は非常に一致しており (図 S12F)、RC とのみ相互作用します。Q1 は RC-LH114-W の W ギャップの入り口に位置し (図 1G および 5、C、D、E)、Q2 は QB 結合部位の近くにあります (図 5、C、D)、F)。保存された L-Trp143 および L-Trp269 残基は Q1 および Q2 に非常に近く、π スタッキング相互作用の可能性を提供します (図 5、E、F、および図 S12)。Q1 の遠位酸素から 3.0 Å 離れた L-Gln88 は強力な水素結合を提供します (図 5E)。 L-Ser91は、他のほとんどのRCにおいてThrと保存的に置換されており（図S13）、Q1のメチル酸素から3.8オングストローム離れており、弱い水素結合を形成する可能性がある（図5E）。Q3は特異的な相互作用を持たないようだが、RC-MサブユニットとLH1-αサブユニット5～6の間の疎水性領域に位置している（図5DおよびG）。Q1、Q2、Q3、または近傍のキレート化キノンは、Tch. Gentle、Trv. Strain 970、Blcにおいても解明されている。虹彩構造（9、10、12）は、RC-LH1複合体において保存された補助的なキノン結合部位を示唆している（図S12G）。 RC-LH116 中の 5 つの分解 UQ は、高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) で測定した各複合体の 5.8±0.7 とよく一致していますが、RC-LH114-W 中の 3 つの分解 UQ は、測定値 6.2±0.3 (図 S14) よりも低く、構造内に未分解の UQ 分子が存在することを示しています。
擬対称性のLポリペプチドとMポリペプチドはそれぞれ5つのTMHを含み、1つのBChl二量体、2つのBChl単量体、2つのバクテリオファージ（BPh）単量体、1つの非ヘム鉄、および1つまたは2つのUQ10分子を組み合わせたヘテロ二量体を形成します。末端ケトン基の水素結合の存在とRpsへの蓄積により、カロテノイドはシス-3,4-デヒドロオルドピンと名付けられたMサブユニットに組み込まれます。種（25）。RC-Hの外膜ドメインは、単一のTMHによって膜に固定されています。RC全体の構造は、近縁種（Rbaなど）の3つのサブユニットRCに類似しています。sphaeroides（PDB ID：3I4D）。これらの構造の解像度範囲内では、BChl と BPh の大環状分子、カロテノイド骨格、非ヘム鉄が重なり合っており、QA 部位の UQ10 ヘッド グループや RC-LH116 の QB キノンも同様です (図 S15)。
異なる QB サイト占有率を持つ 2 つの RC 構造が利用できることで、QB キノンの結合に伴う一貫した立体配座の変化を調べる新たな機会が得られます。RC-LH116 複合体では、QB キノンは完全に結合した「近位」位置 (26) にありますが、RC-LH114-W の分離には QB キノンがありません。RC-LH114-W には QB キノンが存在しませんが、これは、構造が解明された QB キノンを持つ RC-LH116 複合体よりも複合体が活性であるため意外です。2 つの LH1 リングは約 6 個のキノンをキレートしますが、5 個は閉じた RC-LH116 リングで構造的に解明されているのに対し、3 個だけが開いた RC-LH114-W リングで構造的に制限されています。この構造的無秩序性の増加は、RC-LH114-WのQB部位の置換の高速化、複合体中のキノンの動態の高速化、そしてLH1ループを横断する可能性の増加を反映している可能性がある。RC-LH114-WのRC QB部位におけるUQの欠損は、複合体がより複雑で活性が高まった結果である可能性があり、RC-LH114-WのQB部位はUQのターンオーバーにおいて直ちに固定化されていると考えられる。この特定の段階（QB部位への入り口が閉じられている）は、この活性の立体構造を反映している。
QBがなければ、L-Phe217はUQ10の結合と互換性のない位置に回転します。これは、尾部の最初のイソプレンユニットとの空間衝突を引き起こすためです（図6A）。さらに、明らかな主要な立体配座の変化、特にヘリックスde（TMH DとEの間のループにある短いヘリックス）では、L-Phe217がQB結合ポケットにシフトし、L-Tyr223が回転します（図6A）。M-Asp45フレームワークとの水素結合を切断し、QB結合部位の入り口を閉じます（図6B）。ヘリックスdeは基部で回転し、L-Ser209のCαは0.33Åシフトし、L-Val221Cαは3.52Åシフトします。両方の構造で重ね合わせることができるTMH DとEには観察可能な変化はありません（図6A）。私たちの知る限り、これは天然RCにおいてQB部位を閉じる初めての構造です。完全な（QB結合）構造と比較すると、キノンが還元される前に、キノンに取り込まれるための構造変化が必要であることがわかります。L-Phe217は回転してキノンの頭部とπスタッキング相互作用を形成し、ヘリックスが外側にシフトすることで、L-Gly222の骨格とL-Tyr223の側鎖が安定な水素結合構造を持つ水素結合ネットワークを形成します（図6、AおよびC）。
(A) ホログラム（L鎖、オレンジ色／M鎖、マゼンタ色）とアポ（灰色）構造の重ね合わせた図。主要な残基は棒状の表現で示されている。UQ10は黄色のバーで示されている。点線は構造全体で形成された水素結合を示している。(BおよびC) アポリポタンパク質の表面表現とリング構造全体。それぞれL-Phe217の側鎖酸素を青色、L-Tyr223の側鎖酸素を赤色で強調表示している。Lサブユニットはオレンジ色で、MサブユニットとHサブユニットは色付けされていない。(DおよびE) アポリポタンパク質（D）と全体の（E）RC QB部位［それぞれ（A）の色］およびThermophilus thermophilus PSII（緑、プラスチックキノンの場合は青、PDB ID：3WU2）をアラインメント（58）。
意外なことに、LH1を欠くQB欠損RCの構造はいくつか入手可能であるが、本研究で観察された立体構造の変化はこれまで報告されていなかった。これらには、Blc. viridis（PDB ID：3PRC）（27）、Tch. tepidum（PDB ID：1EYS）（28）、およびRba. sphaeroides（PDB ID：1OGV）（29）からのQB欠損構造が含まれ、これらはすべて全体的なQB構造とほぼ同じである。3PRCを詳しく調べたところ、LDAO（ラウリルジメチルアミンオキシド）界面活性剤分子がQB位置の入り口に結合し、閉じた立体構造への再配置を妨げている可能性があることが明らかになった。LDAOは1EYSまたは1OGVの同じ位置で分解しないが、これらのRCは同じ界面活性剤を使用して調製されているため、同じ効果を生み出す可能性がある。Rbaの結晶構造。シトクロム c2 と共結晶化した Sphaeroides RC (PDB ID: 1L9B) も、閉じた QB サイトを持つように見える。しかし、この場合、RC-M ポリペプチドの N 末端領域 (Q ヘリックス上の Tyr 残基の H 結合を介して QB 結合部位と相互作用する) は不自然な立体構造をとっており、QB の立体構造変化はそれ以上調査されていない (30 )。安心できるのは、RC-LH116 RC の N 末端領域とほぼ同じ RC-LH114-W 構造では、M ポリペプチドのこのような変形が見られなかったことである。また、洗剤ベースの LH1 アンテナを除去した後、PDB のアポリポタンパク質 RC が分解され、RC と周囲の LH1 リングの内面との間の隙間にある内部キノンプールと脂質が除去されたことも注目すべきである (31, 32)。 RCは、分解しやすいQBキノンを除く全ての補因子を保持しているため、機能性を維持します。QBキノンは安定性が低く、調製過程で失われることが多いです（33）。さらに、RCからLH1や天然環状脂質を除去すると、電荷分離したP+QB状態の寿命が短くなるなど、機能に影響を与えることが知られています（31, 34, 35）。したがって、RCを取り囲む局所的なLH1リングの存在が、QB部位を「閉じた」状態に維持し、QB近傍の局所環境を保全しているのではないかと推測されます。
アポリポタンパク質（QB キノンなし）と完全な構造は、一連のイベントではなく、QB サイトのターンオーバーの 2 つのスナップショットにすぎませんが、基質阻害を阻害するために、ヒドロキノンによる再結合を防ぐために結合をゲートできるという兆候があります。アポリポタンパク質の QB サイト付近のキノロールとキノンの相互作用は異なる可能性があり、それが RC による拒絶につながります。構造変化がキノンの結合と還元に役割を果たしていると長い間提案されてきました。暗順応後にキノンを還元する凍結 RC の能力は損なわれています (36)。X 線結晶構造解析により、この損傷は、活性な近位位置から約 4.5 Å 離れた「遠位」構造に QB キノンが捕捉されているためであることが示されています (26)、37)。この遠位結合構造は、キノンとの最初の相互作用および QB 部位の開口に続く、アポリポタンパク質と完全な環構造との間の中間状態のスナップショットであると私たちは考えています。
特定の光合成細菌およびシアノバクテリア、藻類、植物のPSII複合体に見られるタイプII RCは、構造的にも機能的にも保存されている（38）。図6（DおよびE）に示す構造アラインメントは、PSII RCと細菌RC複合体のQB部位との類似性を強調している。この比較は、キノンの結合と還元という密接に関連するシステムを研究するためのモデルとして長年用いられてきた。過去の論文では、PSIIにおけるキノンの還元に伴って構造変化が起こることが示唆されている（39, 40）。したがって、RCの進化的保存を考慮すると、これまで観察されていなかったこの結合機構は、酸素化光合成植物のPSII RCのQB部位にも適用できる可能性がある。
Rps ΔpufW（非標識 pufW 欠失）および PufW-His（天然の pufW 遺伝子座から発現した C 末端 10x His タグ付きタンパク質 W）株。palustris CGA009 については、以前の研究（16）で説明しました。これらの株および同質遺伝子の野生型親株は、少数の細胞を PYE（各 5 g リットル -1）（-80 °C で LB に保存、50%（w/v）グリセロール）タンパク質、酵母エキスおよびコハク酸）寒天 [1.5%（w/v）] プレートに画線塗布することで冷凍庫から回収しました。プレートを暗所、室温、嫌気条件下で一晩インキュベートし、その後、OSRAM 116-W ハロゲン電球（RS Components、英国）から供給される白色光（約 50 μmol/L）で 3 ～ 5 日間、単一コロニーが現れるまで照射しました。単一コロニーを用いて、0.1% (w/v) カザミノ酸を添加した M22+ 培地 (41) 10 ml （以下、M22 と略す）に接種した。培養物は、暗所、34°C、180 rpm で振盪培養しながら低酸素条件下で 48 時間培養した後、培養物 70 ml を同じ条件下で 24 時間接種した。1 ml 容量の半好気培養物を用いて、30 ml ユニバーサルスクリュートップ透明ガラス瓶に入れた M22 培地 30 ml に接種し、滅菌磁力撹拌棒を用いて 48 時間撹拌（~50μmol/s）した。次に、培養液30mlに同じ条件下で培養した培養液約1Lを接種し、これを約200μmol/sで72時間光照射した培養液約9Lに接種した。細胞は7132 RCFで30分間遠心分離して回収し、約10mlの20 mMトリス塩酸（pH 8.0）に再懸濁し、必要になるまで-20℃で保存した。
解凍後、再懸濁した細胞にデオキシリボヌクレアーゼI（Merck社、英国）、リゾチーム（Merck社、英国）、およびロシュ社製ホロ酵素プロテアーゼ阻害剤錠剤（Merck社、英国）2錠の結晶を加える。20,000 psiのフレンチプレスセル（Aminco社、米国）で、細胞を8～12回破砕する。破砕されていない細胞と不溶性の残骸を18,500 RCF、4℃で15分間遠心分離した後、113,000 RCF、43,000℃で2時間遠心分離し、着色した溶解液から膜を沈殿させる。可溶性画分を捨て、着色した膜を100～200 mlの20 mMトリス塩酸（pH 8.0）に再懸濁し、目に見える凝集物がなくなるまでホモジナイズする。懸濁した膜を、2% (w/v) β-DDMを含む20 mMトリス塩酸 (pH 8.0) (Anatrace、米国) 溶液中で、暗所、4℃で1時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。その後、70℃で150,000 RCF、4℃で1時間遠心分離し、残留不溶性物質を除去した。
ΔpufW株の可溶化膜を、カラム容量（CV）の3倍の結合緩衝液（0.03%（w / v）β-DDMを含む20 mMトリス-HCl（pH 8.0））を添加した50 ml DEAEセファロースイオン交換カラムに塗布した。カラムを2種類のCV結合緩衝液で洗浄し、さらに50 mM NaClを含む2種類の結合緩衝液で洗浄した。RC-LH116複合体は、1.75 CVで150～300 mM NaCl（結合緩衝液中）の直線勾配で溶出させ、残りの結合複合体は0.5 CVで300 mM NaClを含む結合緩衝液で溶出した。 250～1000 nmの吸収スペクトルを収集し、880～280 nmにおける吸光度比（A880/A280）が1を超える画分を分離せず、結合バッファーで2倍希釈し、DEAEカラムで同様の手順で精製する。A880/A280比が1.7以上、A880/A805比が3.0以上の画分を希釈し、3回目のイオン交換を行い、A880/A280比が2.2以上、A880/A805比が5.0以上の画分を分離しない。部分精製した複合体は、Amicon 100,000分子量カットオフ（MWCO）遠心フィルター（Merck、英国）で約2 mlに濃縮し、200 mM NaCl緩衝液を含むSuperdex 200 16/600サイズ排除カラム（GE Healthcare、米国）にロードし、同緩衝液で1.5 CVで溶出させた。サイズ排除画分の吸収スペクトルを収集し、A880/A280比が2.4以上、A880/A805比が5.8以上の吸収スペクトルを100 A880に濃縮し、直ちにクライオTEMグリッドの作成または保管に使用した。必要になるまで-80℃で保管した。
PufW-His株由来の可溶化膜を、IMAC緩衝液（GE Healthcare）中の20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharoseカラム（20 mMトリス-HCl（pH 8.0）、200 mM NaCl、0.03%（w/w）含有）に添加した。v) β-DDM]。カラムをIMAC緩衝液5 CVで洗浄し、次に10 mMヒスチジンを含むIMAC緩衝液5 CVで洗浄した。コア複合体は、100 mMヒスチジンを含む5種類のIMAC緩衝液でカラムから溶出した。 RC-LH114-W複合体を含む画分を、Amicon 100,000 MWCOフィルター（Merck、英国）を備えた撹拌タンクで約10 mlに濃縮し、結合バッファーで20倍に希釈した後、25 mlのDEAE Sepharoseカラムに加えます。バッファーに結合した4つのCVをあらかじめ使用します。カラムを 4 CV 結合バッファーで洗浄し、0 ～ 100 mM NaCl (結合バッファー内) の直線勾配で 8 CV で複合体を溶出し、残りの 4 CV には 100 mM 結合バッファーを含めました。塩化ナトリウムで溶出された残留複合体は、A880/A280 比が 2.4 を超え、A880/A805 比が 4.6 を超える画分と組み合わされ、Amicon 100,000 MWCO 遠心フィルターで約 2 ml に濃縮され、1.5 CV IMAC で事前にバッファー平衡化した Superdex 200 16/600 サイズ排除カラムが充填され、その後同じバッファーで 1.5 CV で溶出されました。サイズ排除分画の吸収スペクトルを収集し、A880/A280 比が 2.1 以上、A880/A805 比が 4.6 以上の吸収スペクトルを 100 A880 に濃縮します。これを凍結 TEM グリッドの作成にすぐに使用するか、必要になるまで -80°C で保存します。
Leica EM GP液浸凍結装置を用いて低温TEMグリッドを作製した。複合体をIMAC緩衝液でA880 50に希釈し、5μlをグロー放電処理したばかりのQUANTIFOIL 1.2/1.3カーボンコーティング銅メッシュ（Agar Scientific、英国）にロードした。グリッドを20℃、相対湿度60%で30秒間インキュベートし、3秒間乾燥させた後、-176℃の液体エタンで急冷した。
RC-LH114-W複合体のデータは、加速電圧300kV、公称倍率130,000倍、エネルギー-20eVで動作するTitan Krios顕微鏡を使用して、eBIC（Electronic Bioimaging Center）（英国ダイヤモンド光源）で記録されました。ギャップは20eVを選択しました。K2ピーク検出器を備えたGatan 968 GIF Quantumを使用して、カウントモードで画像を記録し、データを収集しました。較正済みピクセルサイズは1.048Å、線量率は3.83 e-Å-2s-1です。11秒間に動画を収集し、40の部分に分割しました。カーボンコーティングされた領域を使用して顕微鏡の再焦点を合わせ、穴ごとに3つの動画を収集しました。合計で3130本の動画が収集され、焦点外れの値は-1〜-3μmでした。
RC-LH116複合体のデータは、英国リーズ大学アスターベリー生物構造研究所の同じ顕微鏡を用いて収集されました。データはカウンティングモード、倍率130kで収集され、ピクセルサイズは1.065Å、線量4.6e-Å-2s-1で調整されました。動画は12秒間記録され、48の部分に分割されました。合計3359枚のフィルムが収集され、焦点ずれは-1～-3μmでした。
すべてのデータ処理はRelion 3.0パイプライン（42）で実行されます。Motioncorr 2（43）を使用して線量加重によってビームモーションを補正し、CTFFIND 4.1（44）を使用してCTF（コントラスト伝達関数）パラメータを決定します。これらの初期処理段階後の典型的な顕微鏡写真を図2に示します。S16。自動選択テンプレートは、250ピクセルのフレームで約250ピクセルの1000個の粒子を手動で選択し、参照2次元（2D）分類がないことで生成され、サンプルの汚染に該当する分類や識別可能な特性がない分類は拒否されます。次に、すべての顕微鏡写真に対して自動選択を実行し、RC-LH114-Wは849,359個の粒子、RC-LH116複合体は476,547個の粒子でした。選択された粒子はすべて、2回の非参照2D分類を受け、各実行後に、炭素領域、サンプル汚染、明らかな特徴がない、または強く重なり合う粒子が拒否され、結果として772,033個（90.9％）と359,678個（75.5％）の粒子がそれぞれRC-LH114-WとRC-LH116の3D分類に使用されます。初期の3D参照モデルは、確率的勾配降下法を使用して生成されました。初期モデルを基準として使用して、選択された粒子は3Dで4つのカテゴリに分類されます。このカテゴリのモデルを基準として使用して、最大カテゴリの粒子に対して3D精製を実行し、最初の15Åローパスフィルタを使用して溶媒領域をカバーし、6ピクセルのソフトエッジを追加し、ピクセルを後処理して、上部検出器のGatan K2ピーク変調伝達関数を補正します。 RC-LH114-Wデータセットの場合、この初期モデルは、マスクの端にある強い密度（UCSF Chimeraのコア複合体密度から切断されている）を削除することによって修正されました。結果として得られたモデル（RC-LH114-WとRC-LH116の解像度はそれぞれ3.91Åと4.16Å）は、2回目の3D分類の参照として使用されます。使用された粒子は、初期の3Dクラスにグループ化され、近傍との強い相関は含まれていません。重複または明らかな構造的特徴の欠如。2回目の3D分類の後、解像度が最も高いカテゴリが選択されました[RC-LH114-Wの場合、1つのカテゴリは377,703個の粒子（44.5％）であり、RC-LH116の場合、2つのカテゴリがあり、合計260,752個の粒子（54.7％）であり、最初の回転後にわずかな違いで整列した場合のみ同じです]。選択された粒子は400ピクセルのボックスで再抽出され、3Dリファインメントによってリファインされます。溶媒マスクは、初期の15Åローパスフィルタ、3ピクセルマップ拡張、および3ピクセルソフトマスクを使用して生成されます。粒子ごとのCTFリファインメント、粒子ごとのモーション補正、および2回目の粒子ごとのCTFリファインメント、3Dリファインメント、溶媒マスク、および後処理が各ステップの後に実行され、結果として得られるテクスチャがさらにリファインされます。FSC（フーリエ殻相関係数）カットオフ値0.143を使用した場合、RC-LH114-WとRC-LH116の最終モデルの解像度はそれぞれ2.65Åと2.80Åです。最終モデルのFSC曲線を図2に示します。S17。
すべてのタンパク質配列はUniProtKBからダウンロードしました：LH1-β（PufB; UniProt ID: Q6N9L5）、LH1-α（PufA; UniProt ID: Q6N9L4）、RC-L（PufL; UniProt ID: O83005）、RC-M（PufM; UniProt ID: A0A4Z7）、RC-H（PuhA; UniProt ID: A0A4Z9）、Protein-W（PufW; UniProt ID: Q6N1K3）。SWISS-MODEL（45）を用いてRCの相同性モデルを構築しました。このモデルには、RC-L、RC-M、RC-Hのタンパク質配列とRbaの結晶構造が含まれています。sphaeroides RCをテンプレートとして使用しました（PDB ID: 5LSE）（46）。 UCSF Chimeraの「フィットマップ」ツールを使用して、生成されたモデルをマップ（47）に適合させ、タンパク質構造を改善し、Coot（48）を用いて補因子[4×BChl a（モノマーライブラリ残基名 = BCL）、2×BPh a（BPH）、1種類または2種類のUQ10（U10）、1種類の非ヘム鉄（Fe）、および1種類の3,4-ジヒドロヘキサカルボニルコリン（QAK）]を付加した。QAKはモノマーライブラリでは利用できないため、PHENIX（49）のeLBOWツールを使用してパラメータ化した。
次に、LH1サブユニットを構築しました。最初に、PHENIX（49）の自動構築ツールを使用して、マップとLH1-αおよびLH1-βタンパク質配列を入力として使用して、LH1配列の一部を自動的に構築しました。最も完全なLH1サブユニットを選択し、それを抽出してCootに読み込み、その中に欠けている配列を手動で追加し、2つのBCl a（BCL）とスピリロキサンチン（CRT）を追加する前に全体の構造を手動で改良しました[関連するRpsに応じてLH1複合体の密度と既知のカロテノイド含有量。種（17）]。完全なLH1サブユニットをコピーし、UCSFキメラの「ドッキングマップツール」を使用して、LH1密度の隣接する非モデル領域にドッキングしてから、Cootで改良します。すべてのLH1サブユニットがモデル化されるまでこのプロセスを繰り返します。 RC-LH114-Wの構造については、Cootの未割り当て密度を抽出することにより、USCFキメラマップで残りの非タンパク質成分からタンパク質をセグメント化し、Autobuildツールを使用して初期モデルを確立し、残りのサブユニット（タンパク質W）をPHENIX（49）でモデリングします。Coot（48）で得られたモデルに不足している配列を追加し、サブユニット全体を手動で改良します。残りの未割り当て密度は、脂質（PDBモノマーライブラリIDがCDL = CDL、POPC = 6PL、POPG = PGT）、β-DDM洗剤（LMT）、およびUQ10分子（U10）の組み合わせに適合します。PHENIX最適化（49）とCoot（48）の手動最適化を使用して、モデル統計と適合の視覚的な品質がこれ以上改善できなくなるまで、完全な初期モデルを完成させます。最後に、LocScale(50)を使用してローカルマップをシャープにし、未割り当て密度のモデリングと自動および手動の最適化のサイクルをいくつか実行します。
それぞれの密度にドッキングされたペプチド、補因子、その他の脂質およびキノンは、図1および図2のS18～S23に示されています。最終モデルの統計情報は表S1に示されています。
特に指定がない限り、UV/Vis/NIR 吸収スペクトルは、Cary60 分光光度計 (Agilent、米国) を使用して、250 nm から 1000 nm まで 1 nm 間隔で、積分時間 0.1 秒で収集されました。
試料を2mm光路長の石英キュベットでA880が1になるまで希釈し、400～1000nmの吸収スペクトルを測定する。円二色性スペクトルは、Jasco 810分光偏光計（日本分光社製）を用いて、400～950nmの範囲で1nm間隔、走査速度20nm/分で測定した。
モル吸光係数は、コア複合体を A880 が約 50 になるように希釈することによって決定されます。10μl の容量を 990μl の結合バッファーまたはメタノールで希釈し、BChl の分解を最小限に抑えるためにすぐに吸収スペクトルを収集します。各メタノールサンプルの BChl 含有量は、771 nm での吸光係数 54.8 mM-1 cm-1 によって計算され、吸光係数が決定されました (51)。測定された BChl 濃度を 32 (RC-LH114-W) または 36 (RC-LH116) で割ってコア複合体濃度を決定し、次にバッファー吸光係数で収集された同じサンプルの吸収スペクトルを決定するために使用します。各サンプルについて 3 回繰り返し測定を行い、BChl Qy 最大値の平均吸光度を使用して計算しました。 RC-LH114-W の 878 nm で測定した吸光係数は 3280±140 mM-1 cm-1 であり、RC-LH116 の 880 nm で測定した吸光係数は 3800±30 mM-1 cm-1 である。
UQ10は（52）の方法に従って定量した。簡単に説明すると、Agilent 1200 HPLCシステムを用いて逆相HPLC（RP-HPLC）を実施した。0.02%（w/v）塩化第二鉄を含む50:50メタノール：クロロホルム50μlにRC-LH116またはRC-LH114-W約0.02nmolを溶解し、予め平衡化したBeckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6mmを×25cmカラムに注入し、HPLC溶媒（80:20メタノール：2-プロパノール）中で1ml-1分-1の速度で40℃で溶出させた。HPLC溶媒でアイソクラティック溶出を行い、275nm（UQ10）、450nm（カロテノイド）、780nm（BChl）の吸光度を1時間測定した。 275 nmクロマトグラムの25.5分のピークを積分しましたが、このピークには他に検出可能な化合物は含まれていませんでした。積分された面積は、0～5.8 nmolの純標準試料を注入して算出した検量線を参照して、抽出されたUQ10のモル量を計算するために用いられます（図S14）。各サンプルは3回繰り返し分析され、報告された誤差は平均値の標準偏差に対応しています。
最大 Qy 吸光度 0.1 の RC-LH1 複合体を含む溶液を、30 μM 還元型ウマ心臓シトクロム c2 (Merck、英国) と 0～50 μMUQ2 (Merck、英国) で調製した。各 UQ2 濃度で 1 ml サンプルを 3 つ調製し、測定前に暗所で 4°C で一晩インキュベートして、暗所に完全に順応させた。溶液を、300 nm フレーム/500 ライン回折格子、1.24 mm 入口スリット、0.12 mm 中間スリット、0.6 mm 出口スリットを備えた OLIS RSM1000 モジュラー分光光度計にロードした。励起光を除外するために、600 nm ロングパスフィルターをサンプル光電管と参照光電子増倍管の入口に配置した。吸光度は 550 nm で、積分時間 0.15 秒でモニタリングした。励起光は、880 nm M880F2 LED（発光ダイオード）（Thorlabs Ltd.、英国）から光ファイバーケーブルを介して90%の強度で放出され、DC2200コントローラ（Thorlabs Ltd.、英国）を介して光源に90°の角度で照射されます。測定ビームはミラーと対向しており、サンプルに吸収されなかった光は反射されます。50秒間の照射の10秒間前に吸光度を測定します。その後、暗所でさらに60秒間吸光度を測定し、キノロールがシトクロムc23 +を自発的に還元する程度を評価しました（生データは図S8を参照）。
データは、UQ2濃度に応じて0.5～10秒の範囲で線形初期速度をフィッティングし、各UQ2濃度における3つのサンプルすべての速度を平均化することで処理されました。それぞれの吸光係数から算出されたRC-LH1濃度を用いて速度を触媒効率に変換し、Origin Pro 2019（OriginLab、米国）でプロットした後、ミカエリス・メンテンモデルにフィッティングして見かけのKm値とKcat値を決定しました。
過渡吸収測定のために、RC-LH1サンプルを、50 mMアスコルビン酸ナトリウム（Merck社、米国）と0.4 mMテルブチン（Merck社、米国）を含むIMAC緩衝液で約2μMに希釈しました。アスコルビン酸は犠牲電子供与体として、tert-ブタクロフェンはQB阻害剤として使用され、測定プロセス全体を通して主要なRC供与体が還元状態（つまり光酸化されない状態）を維持することが保証されます。約3 mlのサンプルを、光路長2 mmのカスタム回転セル（直径約0.1 m、回転数350 RPM）に添加し、レーザー光路内のサンプルが励起パルス間の暗順応に十分な時間を確保します。約100 fsのレーザーパルスを使用してTi:サファイアレーザーシステム（Spectra Physics、米国）を増幅し、繰り返し周波数1 kHz（NIRの場合は20 nJ、Visの場合は100 nJ）でサンプルを880 nmで励起します。データ収集前に、サンプルを励起光に約30分間さらします。曝露によりQAが不活性化されます（QAが1～2回減少する可能性があります）。ただし、このプロセスは可逆的であるため、長期間の暗順応の後、RCはゆっくりとQA活性に戻ります。Helios分光計（Ultrafast Systems、米国）を使用して、遅延時間-10～7000 ps​​で過渡スペクトルを測定しました。Surface Xplorerソフトウェア（Ultrafast Systems、米国）を使用してデータセットのグループを解除し、マージして標準化します。 CarpetView ソフトウェア パッケージ (Light Conversion Ltd.、リトアニア) を使用して結合データ セットから減衰に関連する差分スペクトルを取得するか、複数の指数を機器応答と畳み込む関数を使用して Origin (OriginLab、米国) の単一波長スペクトル進化に適合させます。
前述の通り（53）、RCと末梢LH2アンテナの両方を欠損したLH1複合体を含む光合成膜を作製した。膜を20 mMトリス（pH 8.0）で希釈し、光路長2 mmの石英キュベットに装填した。30 nJのレーザーパルスを用いて、-10～7000 psの遅延時間で540 nmでサンプルを励起した。データセットはRps. palサンプルと同様に処理した。
膜を150,000 RCFで2時間、4℃で遠心分離し、ペレット化した。その後、880 nmでの吸光度を測定した結果を20 mMトリス-HCl（pH 8.0）および200 mM NaClに再懸濁した。膜を2%（w/v）β-DDM中で暗所、4℃で1時間ゆっくりと撹拌して溶解した。サンプルを100 mMトリエチルアンモニウムカーボネート（pH 8.0）（TEAB、Merck、英国）で希釈し、タンパク質濃度を2.5 mg ml-1（Bio-Rad分析）とした。その後の処理は、以前に発表された方法（54）に基づき、まずタンパク質50 μgを1%（w/v）ラウリン酸ナトリウム（Merck、英国）を含むTEAB 50 μlに希釈することから始めた。 60秒間超音波処理した後、5 mMトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（Merck、英国）を用いて37°Cで30分間還元した。S-アルキル化を行うために、サンプルを10 mMメチルS-メチルチオメタンスルホネート（Merck、英国）と共にインキュベートし、200 mMイソプロパノールストック溶液から添加し、室温で10分間インキュベートした。タンパク質分解は、2 μgトリプシン/エンドプロテアーゼLys-C混合物（Promega、英国）を添加し、37°C​​で3時間インキュベートすることにより行った。ラウリン酸界面活性剤は、50 μlの酢酸エチルと10%（v/v）LCグレードトリフルオロ酢酸（TFA、Thermo Fisher Scientific、英国）10 μlを加え、60秒間ボルテックスすることにより抽出した。 15,700 RCFで5分間遠心分離することにより、相分離を促進した。製造元のプロトコルに従い、C18スピンカラム（Thermo Fisher Scientific、英国）を用いて、ペプチドを含む下相を慎重に吸引・脱塩した。真空遠心分離により乾燥後、サンプルを0.5% TFAおよび3%アセトニトリルに溶解し、500 ngを前述のシステムパラメータを用いてナノフローRPクロマトグラフィーと質量分析計で分析した。
Rps. palustrisプロテオームデータベース（www.uniprot.org/proteomes/UP000001426）の検索には、タンパク質同定および定量のためのMaxQuant v.1.5.3.30 (56) を使用しました。質量分析プロテオミクスデータは、PRIDEパートナーリポジトリ（http://proteomecentral.proteomexchange.org）を通じて、ProteomeXchange Allianceにデータセット識別子PXD020402で登録されています。
RPLCとエレクトロスプレーイオン化質量分析法を組み合わせた分析のために、野生型RpsからRC-LH1複合体を調製した。以前公開された方法（16）を使用して、palustris細胞で生成されたタンパク質濃度は、20 mM Hepes（pH 7.8）、100 mM NaCl、0.03％（w / v）β-（Bio-Rad分析）DDMで2 mg ml-1であった。製造元のプロトコルに従って、2D精製キット（GE Healthcare、米国）を使用して沈殿法で10μgのタンパク質を抽出し、沈殿物を20μlの60％（v / v）ギ酸（FA）、20％（v / v）アセトニトリル、20％（v / v）水に溶解した。5マイクロリットルをRPLC（Dionex RSLC）と質量分析（Maxis UHR-TOF、Bruker）を組み合わせて分析した。 MabPac 1.2×100 mmカラム（Thermo Fisher Scientific、英国）を用いて、60℃、100μl/minで分離し、85%(v/v)溶媒A[0.1%(v/v)ギ酸および0.02%(v/v)TFA水溶液]から85%(v/v)溶媒B[90%(v/v)アセトニトリルTFA中0.1%(v/v)ギ酸および0.02%(v/v)]のグラジエントで分析しました。標準エレクトロスプレーイオン化源とデフォルトパラメータを用いて60分以上反応させたところ、質量分析計は100～2750 m/z（質量電荷比）のスペクトルを取得しました。ExPASyバイオインフォマティクスリソースポータルのFindPeptツール（https://web.expasy.org/findpept/）を用いて、質量スペクトルを複合体のサブユニットにマッピングしました。
細胞は、100 mlのNF低光量（10μMm-2 s-1）、中光量（30μMm-2 s-1）、または高光量（300μMm-2 s-1）光下で72時間培養した。M22培地（硫酸アンモニウムを省略し、コハク酸ナトリウムを酢酸ナトリウムに置き換えたM22培地）を100 mlスクリューキャップボトル（23）に入れた。30秒サイクルを5回繰り返し、0.1ミクロンのガラスビーズを体積比1:1でビーズ状にして細胞を溶解し、氷上で5分間冷却した。不溶性物質、未破砕細胞、およびガラスビーズは、卓上型マイクロ遠心機で16,000 RCF、10分間遠心分離することにより除去した。膜は、Ti 70.1 ローターを使用して、20 mM トリス-HCl (pH 8.0) 中、40/15% (w/w) ショ糖勾配で 10 時間、100,000 RCF で分離されました。
以前の研究で述べたように、PufW (16) 上の His タグの免疫検出を行いました。簡単に説明すると、精製したコア複合体 (11.8 nM)、または同濃度の RC (還元された差スペクトルを差し引いて酸化し、染色ゲルへのロード量を一致させることで決定) を含む膜を 2 倍希釈した 2x SDS ローディングバッファー (Merck、英国) で処理しました。タンパク質はレプリカ 12% ビス-トリス NuPage ゲル (Thermo Fisher Scientific、英国) で分離しました。ゲルをクマシーブリリアントブルー (Bio-Rad、英国) で染色し、RC-L サブユニットをロードして可視化しました。2 枚目のゲル上のタンパク質をメタノール活性化ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Thermo Fisher Scientific、英国) に転写し、免疫測定を行いました。 PVDF膜を50 mMトリス-HCl（pH 7.6）、150 mM NaCl、0.2％（v / v）Tween-20および5％（w / v）脱脂粉乳でブロックし、抗His一次抗体（抗体緩衝液[50 mMトリス-HCl（pH 7.6）、150 mM NaClおよび0.05％（v / v）Tween-20]を1:1000 A190-114Aに希釈、Bethyl Laboratories、米国）で4時間インキュベートしました。抗体緩衝液で 5 分間 3 回洗浄した後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ (Sigma-Aldrich、英国) 抗マウス二次抗体 (抗体緩衝液で 1:10,000 に希釈) と混合し、WESTAR ETA C 2.0 化学発光基質 (Cyanagen、イタリア) および Amersham Imager 600 (GE Healthcare、英国) を使用して検出できるようにインキュベートしました (抗体緩衝液で 3 回洗浄してから 5 分後)。
各染色ゲルまたは免疫アッセイレーンの強度分布を描画し、ピーク下の面積を積分してRC-L（染色ゲル）とProtein-W（免疫アッセイ）の強度比を計算し、ImageJ（57）で画像を処理します。これらの比は、純粋なRC-LH114-Wサンプル中のRC-LとProtein-Wの比が1:1であると仮定し、データセット全体をそれに応じて正規化することでモル比に変換されました。
この記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1をご覧ください。
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David JK Swainsbury、Park Qian、Philip J. Jackson、Kaitlyn M. Faries、Dariusz M. Niedzwiedzki、Elizabeth C. Martin、David A. Farmer、Lorna A. Malone、Rebecca F. Thompson、Neil A. Ranson、Daniel P Canniffe、Mark J. Dickman、Dewey Holten、Christine Kirmaier、Andrew Hitchcock、C. Neil Hunter
反応中心の光トラップ 1 複合体の高解像度構造は、キノンのダイナミクスに関する新たな知見をもたらします。
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