この記事は、「高度な生物修復技術と合成有機化合物（SOC）リサイクルプロセス」という研究テーマの一部です。全14件の記事を見る
ナフタレンや置換ナフタレン（メチルナフタレン、ナフトエ酸、1-ナフチル-N-メチルカルバメートなど）といった低分子量多環芳香族炭化水素（PAH）は、様々な産業で広く使用されており、生物に対して遺伝毒性、変異原性、および／または発がん性があります。これらの合成有機化合物（SOC）または異種化合物は優先汚染物質とみなされ、地球環境と公衆衛生に深刻な脅威をもたらします。石炭ガス化、石油精製、自動車排出ガス、農業用途などの人間の活動の強度が、これらの遍在し残留する化合物の濃度、運命、および輸送を決定します。物理的および化学的な処理／除去方法に加えて、POCを完全に分解したり、無毒の副産物に変換したりできる微生物を利用するバイオレメディエーションなどの環境に優しいグリーンテクノロジーが、安全で費用対効果が高く、有望な代替手段として登場しました。土壌微生物叢には、プロテオバクテリア門（Pseudomonas、Pseudomonas、Comamonas、Burkholderia、Neosphingobacterium）、フィルミクテス門（Bacillus、Paenibacillus）、アクチノバクテリア門（Rhodococcus、Arthrobacter）に属する様々な細菌種が存在し、これらの細菌は様々な有機化合物を分解する能力を有している。代謝研究、ゲノミクス、メタゲノム解析は、これらの単純な生命体に存在する異化作用の複雑さと多様性を理解するのに役立ち、効率的な生分解にさらに応用できる。PAHの長期的存在は、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、ゲノムアイランド、統合接合性エレメントなどの遺伝要素を用いた水平遺伝子伝達による新たな分解表現型の出現をもたらした。システム生物学と遺伝子工学を用いて特定の分離株またはモデル群集（コンソーシアム）を解析することで、相乗効果によりこれらの多環芳香族炭化水素（PAH）の包括的かつ迅速で効率的な生物修復が可能になります。本レビューでは、ナフタレンおよび置換ナフタレン分解細菌の様々な代謝経路と多様性、遺伝子構成と多様性、そして細胞応答／適応に焦点を当てます。これにより、現場での応用や効率的な生物修復のための菌株最適化に役立つ生態学的情報が得られます。
石油化学、農業、医薬品、繊維染料、化粧品などの産業の急速な発展は、世界経済の繁栄と生活水準の向上に貢献してきました。この指数関数的な発展は、さまざまな製品の製造に使用される多数の合成有機化合物（SOC）の生産をもたらしました。これらの外来化合物、すなわちSOCには、多環芳香族炭化水素（PAH）、殺虫剤、除草剤、可塑剤、染料、医薬品、有機リン化合物、難燃剤、揮発性有機溶剤などが含まれます。これらは大気、水生および陸上生態系に放出され、物理化学的特性や群集構造の変化を通じてさまざまな生物に有害な影響を与えるなど、多次元的な影響を及ぼします（Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020）。多くの芳香族汚染物質は、多くの健全な生態系/生物多様性のホットスポット（例：サンゴ礁、北極/南極の氷床、高山湖、深海堆積物など）に強く破壊的な影響を与えます（Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020）。最近の地質微生物学的研究では、合成有機物（例：芳香族汚染物質）とその誘導体が人工構造物（建造環境）（例：花崗岩、石、木材、金属でできた文化遺産や記念碑）の表面に沈着すると、それらの劣化が加速することが示されています（Gadd 2017; Liu et al. 2018）。人間の活動は、大気汚染や気候変動を通じて、記念碑や建物の生物学的劣化を強め、悪化させる可能性があります（Liu et al. 2020）。これらの有機汚染物質は、大気中の水蒸気と反応して構造物に沈着し、材料の物理的および化学的劣化を引き起こします。生分解は、生物によって引き起こされる材料の外観や特性の望ましくない変化であり、保存に影響を与えるものとして広く認識されています（Pochon and Jaton、1967）。これらの化合物のさらなる微生物作用（代謝）は、構造的完全性、保存効果、および文化的価値を低下させる可能性があります（Gadd、2017; Liu et al.、2018）。一方、場合によっては、微生物がこれらの構造物に適応し、反応することは、バイオフィルムやその他の保護皮膜を形成して腐敗/分解の速度を低下させるため、有益であることがわかっています（Martino、2016）。したがって、石、金属、および木材の記念碑の効果的な長期持続可能な保存戦略の開発には、このプロセスに関与する主要なプロセスを徹底的に理解する必要があります。自然のプロセス（地質学的プロセス、森林火災、火山噴火、植物および細菌の反応）と比較すると、人間の活動は、大量の多環芳香族炭化水素（PAH）およびその他の有機炭素（OC）を生態系に放出します。農業（DDT、アトラジン、カルバリル、ペンタクロロフェノールなどの殺虫剤や農薬）、産業（原油、油スラッジ/廃棄物、石油由来プラスチック、PCB、可塑剤、洗剤、消毒剤、燻蒸剤、香料、防腐剤）、パーソナルケア製品（日焼け止め、消毒剤、虫除け剤、多環式ムスク）、弾薬（2,4,6-TNTなどの爆発物）で使用される多くのPAHは、地球の健康に影響を与える可能性のある異種物質である（Srogi、2007年、Vamsee-KrishnaおよびPhale、2008年、Petrieら、2015年）。このリストは、石油由来化合物（燃料油、潤滑油、アスファルテン）、高分子量バイオプラスチック、イオン液体（Amde et al., 2015）を含むように拡張できます。表 1 には、さまざまな芳香族汚染物質と、さまざまな産業におけるそれらの用途が示されています。近年、揮発性有機化合物、二酸化炭素、その他の温室効果ガスの人為的排出量が増加し始めています（Dvorak et al., 2017）。しかし、人為的影響は自然の影響を大幅に上回っています。さらに、多くの SOC が多くの環境環境に残留し、生物群系に悪影響を及ぼす新興汚染物質として特定されていることがわかりました（図 1）。米国環境保護庁（USEPA）などの環境機関は、これらの汚染物質の多くを、細胞毒性、遺伝毒性、変異原性、発がん性などの特性から優先リストに含めています。したがって、厳格な廃棄規制と、汚染された生態系からの廃棄物処理/除去のための効果的な戦略が必要です。熱分解、酸化熱処理、空気曝気、埋め立て、焼却など、さまざまな物理的および化学的処理方法は非効率的でコストがかかり、腐食性、毒性があり、処理が困難な副産物を生成します。世界的な環境意識の高まりに伴い、これらの汚染物質とその誘導体（ハロゲン化、ニトロ、アルキル、メチルなど）を分解できる微生物がますます注目を集めています（Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020）。これらの在来候補微生物を単独で、または混合培養（コロニー）で使用して芳香族汚染物質を除去することは、環境安全性、コスト、効率、有効性、および持続可能性の点で利点があります。研究者らはまた、微生物プロセスと電気化学的酸化還元法の統合、すなわちバイオ電気化学システム（BES）を汚染物質の処理/除去のための有望な技術として研究している（Huang et al., 2011）。BES技術は、その高い効率、低コスト、環境安全性、室温での操作、生体適合性材料、および貴重な副産物（電気、燃料、化学物質など）を回収できる能力により、ますます注目を集めている（Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020）。ハイスループットゲノムシーケンスとオミクスツール/方法の出現により、さまざまな分解微生物の反応の遺伝子制御、プロテオミクス、およびフラックスオミクスに関する豊富な新しい情報が得られている。これらのツールをシステム生物学と組み合わせることで、効率的かつ効果的な生分解を達成するための微生物の標的異化経路の選択と微調整（すなわち代謝設計）に関する理解がさらに深まった。適切な候補微生物を用いた効果的な生物修復戦略を設計するためには、微生物の生化学的潜在能力、代謝的多様性、遺伝的構成、および生態（自己生態学／群集生態学）を理解する必要がある。
図1．様々な環境環境および生物に影響を与える様々な要因を通じた低分子PAHの発生源と経路。破線は生態系要素間の相互作用を表す。
本レビューでは、ナフタレンや置換ナフタレンなどの単純な多環芳香族炭化水素（PAH）の分解に関するデータを、代謝経路と多様性、分解に関与する酵素、遺伝子構成/含有量と多様性、細胞応答、およびバイオレメディエーションの様々な側面を網羅する形で、様々な細菌株による分解についてまとめることを試みた。生化学的および分子レベルでの理解は、適切な宿主株の特定と、これらの優先汚染物質の効果的なバイオレメディエーションのための遺伝子工学のさらなる発展に役立つだろう。これは、効果的なバイオレメディエーションのための現場特異的な細菌コンソーシアムの構築戦略の開発に役立つだろう。
多数の有毒で危険な芳香族化合物（ヒュッケル則4n + 2π電子、n = 1、2、3、…を満たす）の存在は、空気、土壌、堆積物、地表水、地下水などのさまざまな環境媒体に深刻な脅威をもたらします（Puglisi et al.、2007）。これらの化合物は、直線状、角状、またはクラスター状に配置された単一のベンゼン環（単環式）または複数のベンゼン環（多環式）を持ち、高い負の共鳴エネルギーと不活性（不活性）により環境中で安定性（安定性/不安定性）を示します。これは、それらの疎水性と還元状態によって説明できます。芳香環がさらにメチル基（-CH3）、カルボキシル基（-COOH）、ヒドロキシル基（-OH）、またはスルホン酸基（-HSO3）に置換されると、より安定になり、高分子に対する親和性が高まり、生物系で生物蓄積性を示す（Seo et al., 2009; Phale et al., 2020）。ナフタレンとその誘導体［メチルナフタレン、ナフトエ酸、ナフタレンスルホン酸、および1-ナフチルN-メチルカルバメート（カルバリル）］などの低分子量多環芳香族炭化水素（LMWAH）の一部は、遺伝毒性、変異原性、および/または発がん性があるとして、米国環境保護庁の優先有機汚染物質リストに含まれている（Cerniglia, 1984）。この種のNM-PAHが環境中に放出されると、食物連鎖のあらゆるレベルでこれらの化合物が生物濃縮され、生態系の健全性に影響を与える可能性がある（Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009）。
PAH が生物に流入する主な原因と経路は、土壌、地下水、地表水、作物、大気などのさまざまな生態系構成要素間の移動と相互作用によるものです (Arey および Atkinson、2003)。図 1 は、さまざまな低分子量 PAH の生態系における相互作用と分布、および生物/ヒトへの曝露経路を示しています。PAH は、大気汚染の結果として、また自動車の排出物、産業排ガス (石炭ガス化、燃焼、コークス製造) の移動 (ドリフト) とそれらの沈着によって表面に沈着します。合成繊維、染料、塗料の製造、木材の保存、ゴム加工、セメント製造活動、農薬製造、農業用途などの産業活動は、陸域および水域システムにおける PAH の主要な発生源です (Bamforth および Singleton、2005; Wick ら、2011)。研究によると、郊外や都市部、高速道路付近、大都市の土壌は、発電所、住宅暖房、大気や道路交通の負荷、建設活動からの排出物により、多環芳香族炭化水素（PAH）の影響を受けやすいことが示されています（Suman et al., 2016）。（2008）は、米国ルイジアナ州ニューオーリンズの道路付近の土壌中のPAH濃度が7189 μg/kgにも達するのに対し、開けた場所ではわずか2404 μg/kgであったことを示しました。同様に、米国のいくつかの都市の石炭ガス化施設付近の地域では、300 μg/kgものPAH濃度が報告されています（Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005）。デリー（Sharma et al., 2008）、アグラ（Dubey et al., 2014）、ムンバイ（Kulkarni and Venkataraman, 2000）、ヴィシャカパトナム（Kulkarni et al., 2014）など、インドのさまざまな都市の土壌には、高濃度のPAHが含まれていることが報告されています。芳香族化合物は土壌粒子、有機物、粘土鉱物に容易に吸着されるため、生態系における主要な炭素吸収源となります（Srogi, 2007; Peng et al., 2008）。水生生態系におけるPAHの主な発生源は、降水（湿性/乾性降水および水蒸気）、都市流出、廃水排出、地下水涵養などです（Srogi, 2007）。海洋生態系におけるPAHの約80%は降水、堆積、廃棄物排出に由来すると推定されている（Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007）。地表水や固形廃棄物処分場からの浸出液中の高濃度のPAHは最終的に地下水に漏れ出し、南アジアおよび東南アジアの人口の70%以上が地下水を飲んでいるため、公衆衛生上の大きな脅威となっている（Duttagupta et al., 2019）。Duttagupta et al.（2020）によるインドの西ベンガル州の河川（32）および地下水（235）の分析に関する最近の研究では、都市住民の推定53%と農村住民の44%（合計2000万人）がナフタレン（4.9～10.6 μg/L）とその誘導体に曝露されている可能性があることが判明した。土地利用パターンの違いと地下水取水量の増加は、地下における低分子量PAHの垂直輸送（移流）を制御する主な要因と考えられています。農業排水、都市および産業廃水排出、固形廃棄物/ごみ排出は、河川流域および地下堆積物中のPAHの影響を受けていることがわかっています。大気降水はPAH汚染をさらに悪化させます。フレーザー川、ルーアン川、デンソ川、ミズーリ川、アナコスティア川、エブロ川、デラウェア川など、世界中の河川/流域で、PAHとそのアルキル誘導体（合計51種類）の高濃度が報告されています（Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018）。ガンジス川流域の堆積物では、ナフタレンとフェナントレンが最も顕著であることが判明しました（サンプルの70%で検出）（Duttagupta et al., 2019）。さらに、飲料水の塩素処理により、より毒性の高い酸素化および塩素化PAHが生成される可能性があることが研究で示されています（Manoli and Samara, 1999）。PAHは、汚染された土壌、地下水、降水から植物が吸収した結果として、穀物、果物、野菜に蓄積されます（Fismes et al., 2002）。魚、ムール貝、アサリ、エビなどの多くの水生生物は、汚染された食物や海水の摂取、組織や皮膚を通してPAHに汚染されます（Mackay and Fraser, 2000）。グリル、ロースト、燻製、揚げ物、乾燥、ベーキング、炭火調理などの調理/加工方法によっても、食品中にかなりの量のPAHが生成されることがあります。これは主に、燻製材料の選択、フェノール/芳香族炭化水素含有量、調理手順、ヒーターの種類、水分含有量、酸素供給、燃焼温度に依存します（Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013）。多環芳香族炭化水素（PAH）は、牛乳からもさまざまな濃度（0.75～2.1 mg/L）で検出されています（Girelli et al., 2014）。食品中のこれらのPAHの蓄積は、食品の物理化学的特性にも依存しますが、その毒性影響は、生理機能、代謝活動、吸収、分布、体内分布に関連しています（Mechini et al., 2011）。
多環芳香族炭化水素（PAH）の毒性と有害作用は古くから知られています（Cherniglia、1984）。低分子量多環芳香族炭化水素（LMW-PAH）（2～3環）は、DNA、RNA、タンパク質などの様々な高分子に共有結合することができ、発がん性があります（Santarelli et al.、2008）。疎水性のため、脂質膜によって隔てられています。ヒトでは、シトクロムP450モノオキシゲナーゼがPAHをエポキシドに酸化し、その中には反応性の高いもの（例えば、バエジオールエポキシド）があり、正常細胞を悪性細胞に変化させる可能性があります（Marston et al.、2001）。さらに、キノン、フェノール、エポキシド、ジオールなどのPAHの変換生成物は、元の化合物よりも毒性が強いです。一部のPAHとその代謝中間体は、ホルモンや代謝に関わる様々な酵素に影響を与え、成長、中枢神経系、生殖系、免疫系に悪影響を及ぼす可能性がある（Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008）。低分子量PAHへの短期曝露は、喘息患者の肺機能障害や血栓症を引き起こし、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、消化器がんのリスクを高めることが報告されている（Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011）。動物実験では、PAH曝露が生殖機能や発達に悪影響を及ぼし、白内障、腎臓や肝臓の損傷、黄疸を引き起こす可能性があることも示されている。ジオール、エポキシド、キノン、フリーラジカル（カチオン）などの様々なPAH生体内変換生成物がDNA付加物を形成することが示されている。安定な付加物はDNA複製機構を変化させることが示されている一方、不安定な付加物はDNAを脱プリン化（主にアデニン、場合によってはグアニン）する可能性があり、どちらも突然変異につながるエラーを引き起こす可能性がある（Schweigert et al. 2001）。さらに、キノン（ベンゾ-/パン-）は活性酸素種（ROS）を生成し、DNAやその他の高分子に致命的な損傷を与え、組織の機能/生存能力に影響を与える可能性がある（Ewa and Danuta 2017）。ピレン、ビフェニル、ナフタレンの低濃度への慢性的な曝露は、実験動物に癌を引き起こすことが報告されている（Diggs et al. 2012）。これらのPAHは致死的な毒性を持つため、影響を受けた/汚染された場所からのこれらのPAHの浄化/除去が優先事項である。
汚染された場所や環境からPAHを除去するために、さまざまな物理的および化学的方法が用いられてきました。焼却、脱塩素、紫外線酸化、固定化、溶媒抽出などのプロセスには、有毒な副生成物の生成、プロセスの複雑さ、安全性や規制上の問題、効率の低さ、高コストなど、多くの欠点があります。しかし、微生物による生分解（バイオレメディエーションと呼ばれる）は、純粋培養またはコロニーの形で微生物を利用する有望な代替アプローチです。物理的および化学的方法と比較して、このプロセスは環境に優しく、非侵襲的で、費用対効果が高く、持続可能です。生物修復は、汚染された場所（現場）または特別に準備された場所（現場外）で実施することができ、そのため、従来の物理的および化学的方法よりも持続可能な修復方法と考えられています（Juhasz and Naidu、2000年、Andreoni and Gianfreda、2007年、Megharaj et al.、2011年、Phale et al.、2020年、Sarkar et al.、2020年）。
芳香族汚染物質の分解に関わる微生物の代謝段階を理解することは、生態学的および環境的持続可能性にとって科学的および経済的に大きな意味を持つ。世界中で推定 2.1×10¹⁸ グラムの炭素 (C) が堆積物および有機化合物 (石油、天然ガス、石炭、すなわち化石燃料) に蓄積されており、地球規模の炭素循環に大きく貢献している。しかし、急速な工業化、化石燃料の採掘、および人間の活動により、これらの岩石圏の炭素貯蔵庫は枯渇しており、推定 5.5×10¹⁵ g の有機炭素 (汚染物質として) が毎年大気中に放出されている (Gonzalez-Gaya et al., 2019)。この有機炭素の大部分は、堆積、輸送、流出によって陸上および海洋生態系に流入する。さらに、化石燃料由来の新たな合成汚染物質、例えばプラスチック、可塑剤、プラスチック安定剤（フタル酸エステル類とその異性体）などが、海洋、土壌、水生生態系とその生物相を深刻に汚染し、地球規模の気候リスクを悪化させている。北米と東南アジアの間の太平洋には、様々な種類のマイクロプラスチック、ナノプラスチック、プラスチック破片​​、ポリエチレンテレフタレート（PET）由来の有毒なモノマー生成物が蓄積し、「太平洋ゴミベルト」を形成して海洋生物に害を与えている（Newell et al., 2020）。科学的研究により、このような汚染物質／廃棄物を物理的または化学的方法で除去することは不可能であることが証明されている。このような状況において、最も有用な微生物は、汚染物質を酸化代謝して二酸化炭素、化学エネルギー、その他の無毒な副産物に変換し、最終的に他の栄養循環プロセス（H、O、N、S、P、Feなど）に取り込むことができる微生物である。したがって、芳香族汚染物質の鉱化作用とその環境制御に関する微生物生態生理学を理解することは、微生物炭素循環、正味炭素収支、および将来の気候リスクを評価する上で極めて重要です。このような化合物を環境から除去する必要性が高まっていることから、クリーンテクノロジーに焦点を当てた様々なエコ産業が出現しています。あるいは、生態系に蓄積された産業廃棄物／廃化学物質の有効活用（すなわち、廃棄物を富に変えるアプローチ）は、循環型経済と持続可能な開発目標の柱の一つと考えられています（Close et al., 2012）。したがって、これらの潜在的な分解候補物質の代謝、酵素、および遺伝的側面を理解することは、このような芳香族汚染物質の効果的な除去とバイオレメディエーションにとって極めて重要です。
数多くの芳香族汚染物質の中でも、ナフタレンや置換ナフタレンなどの低分子量PAHに特に注目しています。これらの化合物は、石油由来燃料、繊維染料、消費財、農薬（防虫剤や虫除け剤）、可塑剤、タンニンなどの主要成分であり、そのため多くの生態系に広く分布しています（Preuss et al., 2003）。最近の報告では、帯水層堆積物、地下水、地下土壌、不飽和帯、河床におけるナフタレン濃度の蓄積が強調されており、環境中での生物濃縮が示唆されています（Duttagupta et al., 2019, 2020）。表2は、ナフタレンとその誘導体の物理化学的特性、用途、健康への影響をまとめたものです。他の高分子量PAHと比較して、ナフタレンとその誘導体は疎水性が低く、水溶性が高く、生態系に広く分布しているため、PAHの代謝、遺伝学、代謝的多様性を研究するためのモデル基質としてよく用いられます。多数の微生物がナフタレンとその誘導体を代謝することができ、それらの代謝経路、酵素、および調節機能に関する包括的な情報が得られています（Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020）。さらに、ナフタレンとその誘導体は、その存在量と生物学的利用能の高さから、環境汚染評価のプロトタイプ化合物として指定されています。米国環境保護庁は、タバコの煙（主に不完全燃焼による）からのナフタレンの平均濃度は1立方メートルあたり5.19μg、副流煙からの濃度は7.8～46μgであると推定しているが、クレオソートとナフタレンへの曝露は100～10,000倍高い（Preuss et al. 2003）。特にナフタレンは、種、地域、性別によって呼吸器毒性と発がん性が異なることがわかっている。国際がん研究機関（IARC）は、動物実験に基づいてナフタレンを「ヒト発がん性物質の可能性あり」（グループ2B）1に分類している。置換ナフタレンへの曝露は、主に吸入または非経口（経口）投与によって、ラットとマウスの肺組織損傷を引き起こし、肺腫瘍の発生率を増加させる（National Toxicology Program 2）。急性症状としては、吐き気、嘔吐、腹痛、下痢、頭痛、錯乱、多汗、発熱、頻脈などが挙げられる。一方、広範囲のカルバメート系殺虫剤であるカルバリル（1-ナフチルN-メチルカルバメート）は、水生無脊椎動物、両生類、ミツバチ、ヒトに対して毒性があると報告されており、アセチルコリンエステラーゼを阻害して麻痺を引き起こすことが示されている（Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011）。したがって、微生物分解のメカニズム、遺伝子制御、酵素反応、細胞反応を理解することは、汚染環境におけるバイオレメディエーション戦略の開発に不可欠である。
表2. ナフタレンとその誘導体の物理化学的性質、用途、識別方法、および関連疾患に関する詳細情報。
汚染された環境では、疎水性および親油性の芳香族汚染物質が、膜流動性、膜透過性、脂質二重層の膨潤、エネルギー伝達（電子伝達系／プロトン駆動力）の阻害、膜結合タンパク質の活性の変化など、環境微生物群集（微生物群集）にさまざまな細胞影響を引き起こす可能性がある（Sikkema et al., 1995）。さらに、カテコールやキノンなどの一部の可溶性中間体は活性酸素種（ROS）を生成し、DNAやタンパク質と付加体を形成する（Penning et al., 1999）。したがって、生態系におけるこれらの化合物の豊富さは、微生物群集に対して、取り込み／輸送、細胞内変換、同化／利用、区画化など、さまざまな生理学的レベルで効率的な分解者となるように選択圧をかける。
リボソームデータベースプロジェクトII（RDP-II）の検索により、ナフタレンまたはその誘導体で汚染された培地または濃縮培養物から合計926種の細菌が分離されたことが明らかになった。プロテオバクテリア群が最も多くの代表種（n = 755）を占め、次いでフィルミクテス（52）、バクテロイデス（43）、アクチノバクテリア（39）、テネリクテス（10）、および分類不能細菌（8）であった（図2）。γ-プロテオバクテリア（シュードモナス目とキサントモナス目）の代表種は、G+C含量の高いグラム陰性群のすべてを占め（54%）、クロストリジウム目とバシラス目（30%）は、G+C含量の低いグラム陽性群であった。シュードモナス属（最多の338種）は、様々な汚染された生態系（コールタール、石油、原油、汚泥、油流出、廃水、有機廃棄物、埋立地）だけでなく、健全な生態系（土壌、河川、堆積物、地下水）においても、ナフタレンとそのメチル誘導体を分解できることが報告されている（図2）。さらに、これらの地域の一部における濃縮研究およびメタゲノム解析により、培養されていないレジオネラ属およびクロストリジウム属の種が分解能力を持つ可能性が明らかになり、新たな経路や代謝的多様性を研究するためにこれらの細菌を培養する必要があることが示された。
図2. ナフタレンおよびナフタレン誘導体で汚染された環境における細菌代表種の分類学的多様性と生態学的分布。
様々な芳香族炭化水素分解微生物の中で、ほとんどの微生物はナフタレンを唯一の炭素源およびエネルギー源として分解することができる。ナフタレン代謝に関わる一連の過程は、Pseudomonas属について記述されている。代謝は、多成分ジオキシゲナーゼ[ナフタレンジオキシゲナーゼ(NDO)、環水酸化ジオキシゲナーゼ]によって開始され、分子状酸素をもう一方の基質として使用してナフタレンの芳香環の1つの酸化を触媒し、ナフタレンをシス-ナフタレンジオールに変換します(図3)。シス-ジヒドロジオールは脱水素酵素によって1,2-ジヒドロキシナフタレンに変換される。環開裂型ジオキシゲナーゼである1,2-ジヒドロキシナフタレンジオキシゲナーゼ（12DHNDO）は、1,2-ジヒドロキシナフタレンを2-ヒドロキシクロメン-2-カルボン酸に変換する。酵素的シス-トランス異性化によりトランス-o-ヒドロキシベンジリデンピルビン酸が生成され、これはヒドラターゼアルドラーゼによってサリチルアルデヒドとピルビン酸に開裂される。有機酸ピルビン酸は、ナフタレン炭素骨格から誘導され、中心炭素経路に導かれた最初のC3化合物である。さらに、NAD+依存性サリチルアルデヒド脱水素酵素はサリチルアルデヒドをサリチル酸に変換する。この段階の代謝は、ナフタレン分解の「上流経路」と呼ばれる。この経路は、ほとんどのナフタレン分解細菌で非常に一般的である。ただし、いくつかの例外がある。例えば、好熱性細菌であるバチルス・ハンブルギー2では、ナフタレン分解はナフタレン2,3-ジオキシゲナーゼによって開始され、2,3-ジヒドロキシナフタレンが生成される（Annweilerら、2000）。
図 3. ナフタレン、メチルナフタレン、ナフトエ酸、カルバリルの分解経路。丸で囲まれた数字は、ナフタレンとその誘導体を次の生成物に順次変換する酵素を表します。 1 — ナフタレンジオキシゲナーゼ (NDO)； 2、シス-ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ； 3、1,2-ジヒドロキシナフタレンジオキシゲナーゼ； 4、2-ヒドロキシクロメン-2-カルボン酸イソメラーゼ； 5、トランス-O-ヒドロキシベンジリデンピルビン酸ヒドラターゼアルドラーゼ； 6、サリチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ； 7、サリチル酸 1-ヒドロキシラーゼ； 8、カテコール 2,3-ジオキシゲナーゼ (C23DO)； 9、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ； 10、2-オキソペント-4-エノアートヒドラターゼ； 11、4-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸アルドラーゼ; 12、アセトアルデヒド脱水素酵素; 13、カテコール-1,2-ジオキシゲナーゼ (C12DO); 14、ムコン酸シクロイソメラーゼ; 15、ムコノラクトンデルタイソメラーゼ; 16、β-ケトアジパテノラクトンヒドロラーゼ; 17、β-ケトアジペートスクシニル-CoAトランスフェラーゼ; 18、β-ケトアジペート-CoAチオラーゼ; 19、スクシニル-CoA:アセチル-CoAスクシニルトランスフェラーゼ; 20、サリチル酸5-ヒドロキシラーゼ; 21 – ゲンチジン酸1,2-ジオキシゲナーゼ (GDO); 22、マレイルピルビン酸イソメラーゼ; 23、フマリルピルビン酸ヒドロラーゼ; 24、メチルナフタレンヒドロキシラーゼ（NDO）；25、ヒドロキシメチルナフタレンデヒドロゲナーゼ；26、ナフタルデヒドデヒドロゲナーゼ；27、3-ホルミルサリチル酸オキシダーゼ；28、ヒドロキシイソフタレートデカルボキシラーゼ；29、カルバリルヒドロラーゼ（CH）；30、1-ナフトール-2-ヒドロキシラーゼ。
生物の種類や遺伝子構成によって、生成されたサリチル酸は、サリチル酸1-ヒドロキシラーゼ（S1H）を用いたカテコール経路、またはサリチル酸5-ヒドロキシラーゼ（S5H）を用いたゲンチジン酸経路のいずれかを介してさらに代謝される（図3）。サリチル酸はナフタレン代謝（上流経路）の主要な中間体であるため、サリチル酸からTCA中間体までのステップはしばしば下流経路と呼ばれ、遺伝子は単一のオペロンに組織化されている。上流経路オペロン（nah）と下流経路オペロン（sal）の遺伝子は共通の調節因子によって制御されていることが一般的である。例えば、NahRとサリチル酸は誘導物質として働き、両方のオペロンがナフタレンを完全に代謝できるようにする（Phale et al., 2019, 2020）。
さらに、カテコールはカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ（C23DO）（Yenら、1988）によってメタ経路を介して2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドに環状に開裂され、さらに2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド加水分解酵素によって加水分解されて2-ヒドロキシペンタ-2,4-ジエン酸が生成される。2-ヒドロキシペンタ-2,4-ジエン酸は、ヒドラターゼ（2-オキソペンタ-4-エノ酸ヒドラターゼ）とアルドラーゼ（4-ヒドロキシ-2-オキソペンタノ酸アルドラーゼ）によってピルビン酸とアセトアルデヒドに変換され、中心炭素経路に入る（図3）。あるいは、カテコールはカテコール1,2-オキシゲナーゼ（C12DO）によってオルト経路を介してシス,シス-ムコン酸に環状に開裂される。ムコン酸シクロイソメラーゼ、ムコノラクトンイソメラーゼ、およびβ-ケトアジピン酸ノラクトンヒドロラーゼは、シス、シス-ムコン酸を​​3-オキソアジピン酸に変換し、これはスクシニル-CoAおよびアセチル-CoAを介して中心炭素経路に入ります（野崎ら、1968）（図3）。
ゲンチジン酸（2,5-ジヒドロキシ安息香酸）経路では、芳香環がゲンチジン酸1,2-ジオキシゲナーゼ（GDO）によって切断され、マレイルピルビン酸が生成される。この生成物は直接加水分解されてピルビン酸とリンゴ酸になるか、異性化されてフマリルピルビン酸となり、その後加水分解されてピルビン酸とフマル酸になる（Larkin and Day、1986）。代替経路の選択は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方で生化学的および遺伝学的レベルで観察されている（Morawski et al.、1997; Whyte et al.、1997）。グラム陰性菌（Pseudomonas）は、ナフタレン代謝の誘導物質であるサリチル酸を好んで利用し、サリチル酸1-ヒドロキシラーゼを用いてカテコールに脱炭酸する（Gibson and Subramanian、1984）。一方、グラム陽性菌（Rhodococcus）では、サリチル酸5-ヒドロキシラーゼがサリチル酸をゲンチジン酸に変換するが、サリチル酸はナフタレン遺伝子の転写に誘導効果を持たない（Grund et al.、1992）（図3）。
Pseudomonas CSV86、Oceanobacterium NCE312、Marinhomonas naphthotrophicus、Sphingomonas paucimobilis 2322、Vibrio cyclotrophus、Pseudomonas fluorescens LP6a、Pseudomonas属、Mycobacterium属などの種がモノメチルナフタレンまたはジメチルナフタレンを分解できることが報告されている（Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999）。中でも、Pseudomonas sp. CSV86の1-メチルナフタレンおよび2-メチルナフタレンの分解経路は、生化学的および酵素的レベルで明確に研究されている（Mahajan et al., 1994）。 1-メチルナフタレンは2つの経路で代謝されます。まず、芳香環（メチルナフタレンの非置換環）が水酸化されてcis-1,2-ジヒドロキシ-1,2-ジヒドロ-8-メチルナフタレンが生成され、これがさらに酸化されてサリチル酸メチルとメチルカテコールとなり、環開裂後に中心炭素経路に入ります（図3）。この経路は「炭素源経路」と呼ばれます。2番目の「解毒経路」では、メチル基がNDOによって水酸化されて1-ヒドロキシメチルナフタレンが生成され、これがさらに酸化されて1-ナフトエ酸となり、最終生成物として培養培地に排出されます。研究によると、株CSV86は1-および2-ナフトエ酸を唯一の炭素源およびエネルギー源として増殖できないことが示されており、その解毒経路が確認されている（Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003）。2-メチルナフタレンでは、メチル基がヒドロキシラーゼによって水酸化され、2-ヒドロキシメチルナフタレンが生成される。さらに、ナフタレン環の非置換環が環水酸化されてジヒドロジオールが生成され、一連の酵素触媒反応で4-ヒドロキシメチルカテコールに酸化され、メタ環開裂経路を介して中心炭素経路に入る。同様に、S. paucimobilis 2322はNDOを利用して2-メチルナフタレンを水酸化し、さらに酸化されてサリチル酸メチルとメチルカテコールを生成することが報告されている（Dutta et al., 1998）。
ナフトエ酸（置換/非置換）は、メチルナフタレン、フェナントレン、アントラセンの分解中に生成され、使用済み培養培地に放出される解毒/生体変換副産物である。土壌分離株Stenotrophomonas maltophilia CSV89は、炭素源として1-ナフトエ酸を代謝できることが報告されている（Phaleら、1995）。代謝は芳香環のジヒドロキシル化から始まり、1,2-ジヒドロキシ-8-カルボキシナフタレンが生成される。生成したジオールは、2-ヒドロキシ-3-カルボキシベンジリデンピルビン酸、3-ホルミルサリチル酸、2-ヒドロキシイソフタル酸、サリチル酸を経てカテコールに酸化され、メタ環開裂経路を介して中心炭素経路に入る（図3）。
カルバリルはナフチルカルバメート系農薬です。1970年代のインドの緑の革命以来、化学肥料と農薬の使用により、農業非点源からの多環芳香族炭化水素（PAH）排出量が増加しています（Pingali、2012年、Duttaguptaら、2020年）。インドの耕作地の約55％（85,722,000ヘクタール）が化学農薬で処理されていると推定されています。過去5年間（2015～2020年）に、インドの農業部門は年間平均55,000～60,000トンの農薬を使用してきました（インド政府農業省協同組合・農民福祉局、2020年8月）。ガンジス川北部および中部平野（人口と人口密度が最も高い州）では、農作物への農薬の使用が広く行われており、殺虫剤が主流となっています。カルバリル（1-ナフチル-N-メチルカルバメート）は、広範囲に作用する中程度から高毒性のカルバメート系殺虫剤で、インドの農業では平均100～110トン使用されています。一般的にセビンという商品名で販売されており、さまざまな作物（トウモロコシ、大豆、綿、果物、野菜）に被害を与える昆虫（アブラムシ、ヒアリ、ノミ、ダニ、クモ、その他多くの屋外害虫）の防除に使用されます。シュードモナス（NCIB 12042、12043、C4、C5、C6、C7、Pseudomonas putida XWY-1）、ロドコッカス（NCIB 12038）、スフィンゴバクテリウム属（CF06）、ブルクホルデリア（C3）、ミクロコッカス、アルスロバクターなどの微生物も、他の害虫の防除に使用できます。 RC100はカルバリルを分解できることが報告されている（Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017）。カルバリルの分解経路は、土壌分離株であるPseudomonas sp.株C4、C5、C6において、生化学的、酵素的、遺伝的レベルで広範に研究されている（Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016）（図3）。代謝経路は、カルバリル加水分解酵素（CH）によるエステル結合の加水分解から始まり、1-ナフトール、メチルアミン、二酸化炭素が生成される。 1-ナフトールは、1-ナフトールヒドロキシラーゼ（1-NH）によって1,2-ジヒドロキシナフタレンに変換され、さらにサリチル酸とゲンチジン酸を経由して中心炭素経路で代謝される。カルバリル分解細菌の中には、カテコールオルト環の開裂を介してサリチル酸に代謝するものもあると報告されている（Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991）。注目すべきは、ナフタレン分解細菌は主にカテコール経路を介してサリチル酸を代謝するのに対し、カルバリル分解細菌はゲンチジン酸経路を介してサリチル酸を代謝することを好む点である。
ナフタレンスルホン酸/ジスルホン酸およびナフチルアミンスルホン酸誘導体は、アゾ染料、湿潤剤、分散剤などの製造の中間体として使用できます。これらの化合物はヒトに対する毒性は低いものの、細胞毒性評価では魚類、ミジンコ、藻類に対して致死性であることが示されています（Greim et al., 1994）。Pseudomonas属の代表株（A3株、C22株）は、スルホン酸基を含む芳香環の二重水酸化によって代謝を開始し、ジヒドロジオールを形成し、さらに亜硫酸基の自発的開裂によって1,2-ジヒドロキシナフタレンに変換されることが報告されています（Brilon et al., 1981）。生成した1,2-ジヒドロキシナフタレンは、古典的なナフタレン経路、すなわちカテコール経路またはゲンチジン酸経路を介して異化されます（図4）。アミノナフタレンスルホン酸とヒドロキシナフタレンスルホン酸は、相補的な異化経路を持つ混合細菌コンソーシアムによって完全に分解されることが示されている（Nortemann et al., 1986）。コンソーシアムの1つのメンバーが1,2-ジオキシゲナーゼによってアミノナフタレンスルホン酸またはヒドロキシナフタレンスルホン酸を脱硫し、アミノサリチル酸またはヒドロキシサリチル酸がデッドエンド代謝物として培養培地に放出され、その後コンソーシアムの他のメンバーに取り込まれることが示されている。ナフタレンジスルホン酸は比較的極性があるが生分解性が低く、そのためさまざまな経路で代謝される可能性がある。最初の脱硫は芳香環とスルホン酸基の位置選択的ジヒドロキシル化中に起こる。 2回目の脱硫は、サリチル酸5-ヒドロキシラーゼによる5-スルホサリチル酸の水酸化によってゲンチジン酸が生成され、これが中心炭素経路に入る過程で起こる（Brilon et al., 1981）（図4）。ナフタレン分解に関与する酵素は、ナフタレンスルホン酸代謝にも関与している（Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006）。
図4. ナフタレンスルホン酸分解の代謝経路。円の中の数字は、ナフチルスルホン酸代謝に関与する酵素を表しており、図3で説明した酵素と同様または同一である。
低分子量PAH（LMW-PAH）は還元性、疎水性、難溶性であるため、自然分解を受けにくい。しかし、好気性微生物は分子状酸素（O2）を吸収することでこれを酸化することができる。これらの酵素は主に酸化還元酵素のクラスに属し、芳香環水酸化（モノヒドロキシル化またはジヒドロキシル化）、脱水素、芳香環開裂などのさまざまな反応を行うことができる。これらの反応から得られる生成物はより高い酸化状態にあり、中心炭素経路を介してより容易に代謝される（Phale et al., 2020）。分解経路の酵素は誘導性であることが報告されている。細胞がグルコースや有機酸などの単純な炭素源で培養されている場合、これらの酵素の活性は非常に低いか、無視できる程度である。表3は、ナフタレンとその誘導体の代謝に関与する様々な酵素（オキシゲナーゼ、ヒドロラーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼなど）をまとめたものである。
表3．ナフタレンおよびその誘導体の分解に関与する酵素の生化学的特性。
放射性同位体研究（18O2）により、オキシゲナーゼによる芳香環への分子状酸素の取り込みが、化合物のさらなる生分解を活性化する上で最も重要なステップであることが示されています（Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955）。基質への分子状酸素（O2）からの酸素原子（O）の1つは、内因性または外因性のモノオキシゲナーゼ（ヒドロキシラーゼとも呼ばれる）によって開始されます。もう1つの酸素原子は水に還元されます。外因性モノオキシゲナーゼはフラビンをNADHまたはNADPHで還元しますが、内因性モノオキシゲナーゼではフラビンは基質によって還元されます。水酸化の位置によって生成物の形成に多様性が生じます。たとえば、サリチル酸1-ヒドロキシラーゼはサリチル酸をC1位で水酸化してカテコールを生成します。一方、多成分サリチル酸5-ヒドロキシラーゼ（還元酵素、フェレドキシン、オキシゲナーゼのサブユニットを含む）は、サリチル酸のC5位を水酸化してゲンチジン酸を生成する（山本ら、1965）。
ジオキシゲナーゼは基質に2つのO2原子を取り込む。生成物に応じて、環状ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼと環状開裂ジオキシゲナーゼに分類される。環状ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼは芳香族基質をシス-ジヒドロジオール（ナフタレンなど）に変換し、細菌に広く分布している。現在までに、環状ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼを持つ生物は様々な芳香族炭素源で生育できることが示されており、これらの酵素はNDO（ナフタレン）、トルエンジオキシゲナーゼ（TDO、トルエン）、ビフェニルジオキシゲナーゼ（BPDO、ビフェニル）に分類される。 NDOとBPDOはどちらも、様々な多環芳香族炭化水素（トルエン、ニトロトルエン、キシレン、エチルベンゼン、ナフタレン、ビフェニル、フルオレン、インドール、メチルナフタレン、ナフタレンスルホン酸、フェナントレン、アントラセン、アセトフェノンなど）の二重酸化と側鎖水酸化を触媒することができる（Boyd and Sheldrake、1998年；Phale et al.、2020年）。NDOは、酸化還元酵素、フェレドキシン、および活性部位を含むオキシゲナーゼ成分からなる多成分システムである（Gibson and Subramanian、1984年；Resnick et al.、1996年）。NDOの触媒ユニットは、大きなαサブユニットと小さなβサブユニットがα3β3の配置で配置されている。 NDOはオキシゲナーゼの大きなファミリーに属し、そのαサブユニットにはリースケ部位[2Fe-2S]と単核非ヘム鉄が含まれており、これがNDOの基質特異性を決定する（Paralesら、1998）。通常、1回の触媒サイクルで、ピリジンヌクレオチドの還元から2つの電子が、還元酵素、フェレドキシン、およびリースケ部位を介して活性部位のFe(II)イオンに伝達される。還元当量によって分子状酸素が活性化され、これが基質のジヒドロキシル化の前提条件となる（Ferraroら、2005）。現在までに、さまざまな株から精製され詳細に特性評価されたNDOはごくわずかであり、ナフタレン分解に関与する経路の遺伝的制御が詳細に研究されている（Resnickら、1996; Paralesら、1998; Karlssonら、2003）。環開裂ジオキシゲナーゼ（エンド環開裂酵素またはオルト環開裂酵素、およびエキソジオール環開裂酵素またはメタ環開裂酵素）は、水酸化芳香族化合物に作用します。例えば、オルト環開裂ジオキシゲナーゼはカテコール-1,2-ジオキシゲナーゼであり、メタ環開裂ジオキシゲナーゼはカテコール-2,3-ジオキシゲナーゼです（Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968）。様々なオキシゲナーゼに加えて、NAD+/NADP+を電子受容体として用いて芳香族ジヒドロジオール、アルコール、アルデヒドの脱水素化を担う様々な脱水素酵素もあり、これらは代謝に関わる重要な酵素の一部です（Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020）。
加水分解酵素（エステラーゼ、アミダーゼ）などの酵素は、水を用いて共有結合を切断し、幅広い基質特異性を示す、2番目に重要な酵素群です。カルバリル加水分解酵素およびその他の加水分解酵素は、グラム陰性細菌のペリプラズム（膜貫通領域）の構成要素であると考えられています（Kamini et al., 2018）。カルバリルはアミド結合とエステル結合の両方を持つため、エステラーゼまたはアミダーゼのいずれかによって加水分解されて1-ナフトールを生成できます。Rhizobium rhizobium株AC10023およびArthrobacter株RC100のカルバリルは、それぞれエステラーゼおよびアミダーゼとして機能することが報告されています。Arthrobacter株RC100のカルバリルはアミダーゼとしても機能します。 RC100は、カルバリル、メソミル、メフェナム酸、XMCなどの4種類のN-メチルカルバメート系殺虫剤を加水分解することが示されている（Hayaatsu et al., 2001）。Pseudomonas sp. C5ppのCHは、カルバリル（100%活性）と1-ナフチルアセテート（36%活性）に作用するが、1-ナフチルアセトアミドには作用しないことから、エステラーゼであることが報告されている（Trivedi et al., 2016）。
生化学的研究、酵素調節パターン、および遺伝子解析により、ナフタレン分解遺伝子は、2 つの誘導性調節ユニットまたは「オペロン」、すなわち nah (「上流経路」、ナフタレンをサリチル酸に変換する) と sal (「下流経路」、サリチル酸をカテコールを介して中心炭素経路に変換する) から構成されていることが示されています。サリチル酸とその類似体は誘導物質として作用することができます (Shamsuzzaman および Barnsley、1974)。グルコースまたは有機酸が存在すると、オペロンは抑制されます。図 5 は、ナフタレン分解の完全な遺伝子構成 (オペロン形式) を示しています。nah 遺伝子 (ndo/pah/dox) のいくつかの命名された変異体/形態が記載されており、すべての Pseudomonas 種間で高い配列相同性 (90%) があることがわかっています (Abbasian ら、2016)。ナフタレン上流経路の遺伝子は、図 5A に示すように、一般的に共通の順序で配置されていた。別の遺伝子 nahQ もナフタレン代謝に関与していると報告されており、通常は nahC と nahE の間に位置していたが、その実際の機能はまだ解明されていない。同様に、ナフタレン感受性走化性に関与する nahY 遺伝子は、一部のメンバーでは nah オペロンの末端に位置していた。Ralstonia sp. では、グルタチオン S-トランスフェラーゼ (gsh) をコードする U2 遺伝子が nahAa と nahAb の間に位置していたが、ナフタレン利用特性には影響しなかった (Zylstra et al., 1997)。
図5. 細菌種間でナフタレン分解中に観察された遺伝子構成と多様性。（A）ナフタレン上流経路、ナフタレンからサリチル酸への代謝。（B）ナフタレン下流経路、カテコールを介してサリチル酸から中心炭素経路へ。（C）ゲンチジン酸を介してサリチル酸から中心炭素経路へ。
「下位経路」（salオペロン）は通常nahGTHINLMOKJからなり、カテコールメタ環開裂経路を介してサリチル酸をピルビン酸とアセトアルデヒドに変換する。nahG遺伝子（サリチル酸ヒドロキシラーゼをコードする）は、オペロンの近位端で保存されていることがわかった（図5B）。他のナフタレン分解菌株と比較すると、P. putida CSV86ではnahオペロンとsalオペロンはタンデムで非常に密接に関連している（約7.5 kb）。Ralstonia sp. U2、Polaromonas naphthalenivorans CJ2、P. putida AK5などのグラム陰性細菌では、ナフタレンはゲンチジン酸経路（sgp/nagオペロンの形）を介して中心炭素代謝物として代謝される。遺伝子カセットは通常、nagAaGHAbAcAdBFCQEDJIの形式で表され、nagR（LysR型調節因子をコードする）は上端に位置します（図5C）。
カルバリルは、1-ナフトール、1,2-ジヒドロキシナフタレン、サリチル酸、ゲンチジン酸の代謝を経て、中心炭素循環に入ります（図3）。遺伝学的および代謝学的研究に基づき、この経路は「上流」（カルバリルからサリチル酸への変換）、「中間」（サリチル酸からゲンチジン酸への変換）、および「下流」（ゲンチジン酸から中心炭素経路の中間体への変換）に分けられることが提案されています（Singh et al., 2013）。 C5pp（スーパーコンティグA、76.3 kb）のゲノム解析により、mcbACBDEF遺伝子がカルバリルからサリチル酸への変換に関与し、続いてmcbIJKLがサリチル酸からゲンチジン酸への変換に関与し、mcbOQPがゲンチジン酸から中心炭素中間体（フマル酸とピルビン酸、Trivedi et al., 2016）への変換に関与することが明らかになった（図6）。
芳香族炭化水素（ナフタレンやサリチル酸を含む）の分解に関与する酵素は、対応する化合物によって誘導され、グルコースや有機酸などの単純な炭素源によって阻害されることが報告されている（Shingler、2003年；Phaleら、2019年、2020年）。ナフタレンとその誘導体のさまざまな代謝経路の中で、ナフタレンとカルバリルの調節特性はある程度研究されている。ナフタレンの場合、上流および下流経路の両方の遺伝子は、LysR型トランス作用正調節因子であるNahRによって調節される。これは、サリチル酸によるnah遺伝子の誘導とその後の高レベル発現に必要である（YenおよびGunsalus、1982年）。さらに、統合宿主因子（IHF）とXylR（シグマ54依存性転写調節因子）もナフタレン代謝における遺伝子の転写活性化に重要であることが研究で示されている（Ramos et al., 1997）。カテコールメタ環開裂経路の酵素、すなわちカテコール2,3-ジオキシゲナーゼは、ナフタレンおよび/またはサリチル酸の存在下で誘導されることが研究で示されている（Basu et al., 2006）。カテコールオルト環開裂経路の酵素、すなわちカテコール1,2-ジオキシゲナーゼは、安息香酸およびシス、シス-ムコン酸の存在下で誘導されることが研究で示されている（Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001）。
株C5ppでは、mcbG、mcbH、mcbN、mcbR、mcbSの5つの遺伝子が、カルバリル分解の制御に関与する転写調節因子LysR/TetRファミリーに属する調節因子をコードしている。相同遺伝子mcbGは、Burkholderia RP00725におけるフェナントレン代謝に関与するLysR型調節因子PhnS（アミノ酸配列同一性58%）に最も近縁であることがわかった（Trivediら、2016）。mcbH遺伝子は中間経路（サリチル酸からゲンチジン酸への変換）に関与しており、Pseudomonas属およびBurkholderia属のLysR型転写調節因子NagR/DntR/NahRに属することがわかった。このファミリーのメンバーは、サリチル酸を分解遺伝子誘導のための特異的なエフェクター分子として認識することが報告されている。一方、下流経路（ゲンチジン酸-中心炭素経路代謝産物）では、LysR型およびTetR型転写調節因子に属するmcbN、mcbR、mcbSの3つの遺伝子が同定された。
原核生物では、プラスミド、トランスポゾン、プロファージ、ゲノムアイランド、統合型接合性エレメント（ICE）を介した水平遺伝子伝達プロセス（獲得、交換、または伝達）が細菌ゲノムの可塑性の主な原因であり、特定の機能/形質の獲得または喪失につながります。これにより、細菌はさまざまな環境条件に迅速に適応することができ、芳香族化合物の分解など、宿主に潜在的な適応的代謝上の利点をもたらします。代謝の変化は、多くの場合、分解オペロン、その制御機構、および酵素の特異性の微調整によって達成され、より広範囲の芳香族化合物の分解を促進します（Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020）。ナフタレン分解遺伝子カセットは、プラスミド（接合型および非接合型）、トランスポゾン、ゲノム、ICE、および異なる細菌種の組み合わせなど、さまざまな可動性要素上に存在することがわかっています（図5）。Pseudomonas G7では、プラスミドNAH7のnahオペロンとsalオペロンは同じ方向に転写され、トランスポザーゼTn4653を必要とする欠陥トランスポゾンの一部となっています（Sota et al., 2006）。Pseudomonas株NCIB9816-4では、この遺伝子は接合型プラスミドpDTG1上に、逆方向に転写される2つのオペロン（約15kb離れている）として見つかりました（Dennis and Zylstra, 2004）。 Pseudomonas putida株AK5では、非接合型プラスミドpAK5がゲンチジン酸経路を介してナフタレン分解に関与する酵素をコードしている（Izmalkova et al., 2013）。Pseudomonas株PMD-1では、nahオペロンは染色体上にあり、salオペロンは接合型プラスミドpMWD-1上に存在する（Zuniga et al., 1981）。しかし、Pseudomonas stutzeri AN10では、すべてのナフタレン分解遺伝子（nahおよびsalオペロン）は染色体上にあり、転移、組換え、および再編成イベントによって取り込まれたと考えられる（Bosch et al., 2000）。Pseudomonas sp. CSV86では、nahおよびsalオペロンはICE（ICECSV86）の形でゲノム中に存在する。この構造は、tRNAGlyに続いて組換え/付着部位を示す直接反復配列（attRおよびattL）と、tRNAGlyの両端に位置するファージ様インテグラーゼによって保護されており、構造的にはICEclcエレメント（クロロカテコール分解のためのPseudomonas knackmusiiのICEclcB13）と類似している。ICE上の遺伝子は、極めて低い伝達頻度（10⁻⁸）で接合によって伝達され、それによって分解特性が受容者に伝達されることが報告されている（BasuおよびPhale、2008年；Phaleら、2019年）。
カルバリル分解に関与する遺伝子のほとんどはプラスミド上に存在する。Arthrobacter sp. RC100 は 3 つのプラスミド (pRC1、pRC2、pRC300) を含み、そのうち接合性プラスミドである pRC1 と pRC2 はカルバリルをゲンチジン酸に変換する酵素をコードしている。一方、ゲンチジン酸を中央炭素代謝物に変換する酵素は染色体上に存在する (Hayaatsu et al., 1999)。カルバリルを 1-ナフトールに変換するために使用される Rhizobium 属の細菌株 AC100 は、挿入要素様配列 (istA および istB) に囲まれた Tnceh トランスポゾンの一部として CH をコードする cehA 遺伝子を持つプラスミド pAC200 を含む (Hashimoto et al., 2002)。 Sphingomonas株CF06では、カルバリル分解遺伝子は5つのプラスミド（pCF01、pCF02、pCF03、pCF04、pCF05）に存在すると考えられている。これらのプラスミドのDNA相同性は高く、遺伝子重複イベントの存在を示している（Fengら、1997）。2つのPseudomonas種からなるカルバリル分解共生体では、株50581はmcdカルバリル加水分解酵素遺伝子をコードする接合プラスミドpCD1（50 kb）を含み、一方、株50552の接合プラスミドは1-ナフトール分解酵素をコードしている（ChapalamaduguおよびChaudhry、1991）。Achromobacter株WM111では、mcdフラダン加水分解酵素遺伝子は100 kbのプラスミド（pPDL11）上に存在する。この遺伝子は、異なる地理的地域の異なる細菌の異なるプラスミド（100、105、115、または124 kb）上に存在することが示されている（Parekh et al., 1995）。Pseudomonas sp. C5ppでは、カルバリル分解に関与するすべての遺伝子が、76.3 kbの配列にわたるゲノムに位置している（Trivedi et al., 2016）。ゲノム解析（6.15 Mb）により、42個のMGEと36個のGEIの存在が明らかになり、そのうち17個のMGEは、平均非対称G+C含量（54～60 mol%）を持つスーパーコンティグA（76.3 kb）に位置しており、水平遺伝子伝達イベントの可能性を示唆している（Trivedi et al., 2016）。 P. putida XWY-1はカルバリル分解遺伝子の同様の配置を示すが、これらの遺伝子はプラスミド上に位置している（Zhu et al., 2019）。
生化学的およびゲノムレベルでの代謝効率に加えて、微生物は走化性、細胞表面修飾特性、区画化、優先的利用、バイオサーファクタント産生など、汚染された環境における芳香族汚染物質をより効率的に代謝するのに役立つ他の特性や応答も示します（図7）。
図7．外来汚染物質を効率的に生分解するための理想的な芳香族炭化水素分解細菌の様々な細胞応答戦略。
化学走性応答は、不均一に汚染された生態系における有機汚染物質の分解を促進する要因と考えられている。(2002)は、Pseudomonas sp. G7のナフタレンに対する化学走性が水系におけるナフタレン分解速度を増加させることを実証した。野生型株G7は、化学走性欠損変異株よりもはるかに速くナフタレンを分解した。NahYタンパク質(膜トポロジーを持つ538アミノ酸)は、NAH7プラスミド上のメタ切断経路遺伝子と共転写されることがわかっており、化学走性トランスデューサーと同様に、このタンパク質はナフタレン分解の化学受容体として機能するようである(Grimm and Harwood 1997)。Hanselら(2009)による別の研究では、このタンパク質は化学走性であるが、その分解速度は高いことが示された。 （2011）は、気体ナフタレンに対するシュードモナス（P. putida）の走化性応答を実証し、気相拡散によって細胞へのナフタレンの安定した流れが生じ、それが細胞の走化性応答を制御した。研究者らはこの走化性行動を利用して、分解速度を高める微生物を設計した。研究によると、化学感覚経路は細胞分裂、細胞周期制御、バイオフィルム形成などの他の細胞機能も制御し、それによって分解速度の制御に役立つことが示されている。しかし、この特性（走化性）を効率的な分解に利用することは、いくつかのボトルネックによって妨げられている。主な障害は次のとおりである。（a）異なるパラログ受容体が同じ化合物/リガンドを認識する。（b）代替受容体の存在、すなわちエネルギー指向性。（c）同じ受容体ファミリーの感覚ドメインにおける配列の大きな違い。 （d）主要な細菌センサータンパク質に関する情報が不足していること（Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018）。芳香族炭化水素の生分解では、複数の代謝物/中間体が生成されることがあり、これらはある細菌群に対しては走化性を示すが、他の細菌群に対しては忌避性を示す場合があり、プロセスをさらに複雑にする。リガンド（芳香族炭化水素）と化学受容体との相互作用を特定するために、芳香族酸、TCA中間体、ナフタレンの受容体をそれぞれ標的とするPseudomonas putidaとEscherichia coliのセンサー領域とシグナル伝達領域を融合させて、ハイブリッドセンサータンパク質（PcaY、McfR、NahY）を構築した（Luu et al., 2019）。
ナフタレンやその他の多環芳香族炭化水素（PAH）の影響下では、細菌膜の構造と微生物の完全性に大きな変化が生じる。研究によると、ナフタレンは疎水性相互作用を介してアシル鎖の相互作用を阻害し、膜の膨潤と流動性を増加させることが示されている（Sikkema et al., 1995）。この有害な影響に対抗するため、細菌はイソ/アンテイソ分岐鎖脂肪酸の比率と脂肪酸組成を変化させ、シス不飽和脂肪酸を対応するトランス異性体に異性化することによって膜の流動性を調節する（Heipieper and de Bont, 1994）。ナフタレン処理で培養した Pseudomonas stutzeri では、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比率が 1.1 から 2.1 に増加したが、Pseudomonas JS150 ではこの比率が 7.5 から 12.0 に増加した (Mrozik et al., 2004)。ナフタレンで培養した Achromobacter KAs 3–5 細胞は、ナフタレン結晶の周囲に細胞凝集を示し、細胞表面電荷の減少 (-22.5 mV から -2.5 mV へ) と細胞質凝縮および液胞化を伴い、細胞構造および細胞表面特性の変化を示した (Mohapatra et al., 2019)。細胞/表面の変化は芳香族汚染物質の取り込みの向上に直接関係しているが、関連するバイオエンジニアリング戦略は十分に最適化されていない。細胞形状の操作は、生物学的プロセスの最適化にはほとんど使用されていない (Volke and Nikel, 2018)。細胞分裂に影響を与える遺伝子の欠失は、細胞形態の変化を引き起こします。細胞分裂に影響を与える遺伝子の欠失は、細胞形態の変化を引き起こします。枯草菌では、細胞隔壁タンパク質SepFが隔壁形成に関与し、細胞分裂のその後の段階に必要であることが示されていますが、必須遺伝子ではありません。枯草菌のペプチドグリカン加水分解酵素をコードする遺伝子の欠失は、細胞の伸長、比増殖速度の増加、および酵素生産能力の向上をもたらしました（Cui et al., 2018）。
カルバリル分解経路の区画化は、Pseudomonas株C5ppおよびC7の効率的な分解を達成するために提案されている（Kamini et al., 2018）。カルバリルは外膜隔壁および/または拡散性ポリンを介してペリプラズム空間に輸送されると考えられている。CHは、カルバリルをより安定で疎水性が高く毒性の高い1-ナフトールに加水分解する反応を触媒するペリプラズム酵素である。CHはペリプラズムに局在し、カルバリルに対する親和性が低いため、1-ナフトールの生成を制御し、細胞内への蓄積を防ぎ、細胞への毒性を低減する（Kamini et al., 2018）。生成された1-ナフトールは、分配および/または拡散によって内膜を介して細胞質に輸送され、その後、高親和性酵素1NHによって1,2-ジヒドロキシナフタレンに水酸化され、中心炭素経路でさらに代謝される。
微生物は、異種炭素源を分解する遺伝的および代謝的能力を持っているが、その利用の階層構造（つまり、複雑な炭素源よりも単純な炭素源を優先的に使用すること）が、生分解の大きな障害となっている。単純な炭素源の存在と利用は、PAHなどの複雑な/好ましくない炭素源を分解する酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する。よく研究されている例として、大腸菌にグルコースとラクトースを同時に与えると、ラクトースよりもグルコースの方が効率的に利用される（Jacob and Monod、1965）。Pseudomonasは、炭素源としてさまざまなPAHや異種化合物を分解することが報告されている。Pseudomonasにおける炭素源利用の階層は、有機酸 > グルコース > 芳香族化合物である（Hylemon and Phibbs、1972; Collier et al.、1996）。しかし、例外がある。興味深いことに、Pseudomonas sp. CSV86は、グルコースよりも芳香族炭化水素（安息香酸、ナフタレンなど）を優先的に利用し、芳香族炭化水素と有機酸を共代謝するという独自の階層構造を示します（Basu et al., 2006）。この細菌では、グルコースや有機酸などの第二の炭素源が存在する場合でも、芳香族炭化水素の分解と輸送に関わる遺伝子はダウンレギュレーションされません。グルコースと芳香族炭化水素を含む培地で培養すると、グルコースの輸送と代謝に関わる遺伝子がダウンレギュレーションされ、最初の対数増殖期には芳香族炭化水素が利用され、2番目の対数増殖期にはグルコースが利用されることが観察されました（Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017）。一方、有機酸の存在は芳香族炭化水素代謝の発現に影響を与えなかったため、この細菌は生分解研究の候補株になると期待されています（Phale et al., 2020）。
炭化水素の生体変換が微生物に酸化ストレスと抗酸化酵素のアップレギュレーションを引き起こすことはよく知られている。定常期細胞および毒性化合物の存在下でのナフタレンの生分解効率の低さは、活性酸素種（ROS）の生成につながる（Kang et al. 2006）。ナフタレン分解酵素は鉄硫黄クラスターを含むため、酸化ストレス下ではヘムおよび鉄硫黄タンパク質中の鉄が酸化され、タンパク質の不活性化につながる。フェレドキシン-NADP+還元酵素（Fpr）は、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）とともに、NADP+/NADPHと2分子のフェレドキシンまたはフラボドキシンとの間の可逆的な酸化還元反応を媒介し、それによってROSを除去し、酸化ストレス下で鉄硫黄中心を回復させる（Li et al. 2006）。 Pseudomonas の Fpr と SodA (SOD) の両方が酸化ストレスによって誘導されることが報告されており、ナフタレン添加条件下での増殖中に 4 つの Pseudomonas 株 (O1、W1、As1、および G1) で SOD およびカタラーゼ活性の増加が観察されました (Kang et al., 2006)。アスコルビン酸や二価鉄 (Fe2+) などの抗酸化物質の添加により、ナフタレンの増殖速度が増加することが研究で示されています。Rhodococcus erythropolis がナフタレン培地で増殖すると、sodA (Fe/Mn スーパーオキシドジスムターゼ)、sodC (Cu/Zn スーパーオキシドジスムターゼ)、および recA を含む酸化ストレス関連のシトクロム P450 遺伝子の転写が増加しました (Sazykin et al., 2019)。ナフタレン中で培養したシュードモナス細胞の比較定量的プロテオミクス解析により、酸化ストレス応答に関連する様々なタンパク質のアップレギュレーションはストレス対処戦略であることが示された（Herbst et al., 2013）。
微生物は疎水性炭素源の作用によりバイオサーファクタントを生成することが報告されている。これらの界面活性剤は、油水界面または空気水界面で凝集体を形成できる両親媒性表面活性化合物である。これにより擬似溶解が促進され、芳香族炭化水素の吸着が容易になり、効率的な生分解が実現する（Rahman et al., 2002）。これらの特性により、バイオサーファクタントは様々な産業で広く利用されている。細菌培養に化学界面活性剤またはバイオサーファクタントを添加すると、炭化水素分解の効率と速度が向上する。バイオサーファクタントの中でも、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）によって産生されるラムノリピドは、広範囲にわたって研究され、特性が明らかにされている（Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002）。さらに、他の種類のバイオ界面活性剤には、リポペプチド（Pseudomonas fluorescens由来のムチン）、乳化剤378（Pseudomonas fluorescens由来）（Rosenberg and Ron、1999）、Rhodococcus由来のトレハロース二糖類脂質（Ramdahl、1985）、Bacillus由来のリケニン（Saraswathy and Hallberg、2002）、Bacillus subtilis由来の界面活性剤（Siegmund and Wagner、1991）、およびBacillus amyloliquefaciens由来の界面活性剤（Zhi et al.、2017）などがあります。これらの強力な界面活性剤は、表面張力を72 dynes/cmから30 dynes/cm未満に低下させ、炭化水素の吸収を向上させることが示されています。 Pseudomonas、Bacillus、Rhodococcus、Burkholderiaなどの細菌種は、ナフタレンおよびメチルナフタレン培地で培養すると、さまざまなラムノリピドおよびグリコリピドベースのバイオサーファクタントを産生することが報告されている（Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005）。Pseudomonas maltophilia CSV89は、ナフトエ酸などの芳香族化合物上で培養すると、細胞外バイオサーファクタントBiosur-Pmを産生する（Phale et al., 1995）。Biosur-Pm形成の速度論は、その合成が成長およびpH依存プロセスであることを示した。中性pHで細胞が産生するBiosur-Pmの量は、pH 8.5で産生する量よりも多いことがわかった。pH 8.5で培養した細胞は、pH 7.0で培養した細胞よりも疎水性が高く、芳香族化合物および脂肪族化合物に対する親和性が高かった。 Rhodococcus spp. N6 では、炭素窒素比 (C:N) が高く、鉄が制限されていることが細胞外バイオサーファクタントの生産に最適な条件である (Mutalik et al., 2008)。菌株と発酵を最適化することでバイオサーファクタント (サーファクチン) の生合成を改善しようとする試みがなされてきた。しかし、培養培地中の界面活性剤の力価は低く (1.0 g/L)、大規模生産の課題となっている (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019)。そのため、遺伝子工学的手法を用いて生合成を改善しようと試みられてきた。しかし、オペロンのサイズが大きい (約 25 kb) ことと、クオラムセンシングシステムの生合成制御が複雑であることから、遺伝子工学的改変は困難である (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019)。バチルス属細菌では、プロモーター（srfAオペロン）の置換、サーファクチン輸送タンパク質YerPの過剰発現、および調節因子ComXとPhrCの過剰発現などにより、サーファクチン生産量を増加させることを主な目的とした遺伝子工学的改変が数多く行われてきた（Jiaoら、2017）。しかしながら、これらの遺伝子工学的手法は、1つまたは少数の遺伝子改変しか実現しておらず、商業生産にはまだ至っていない。したがって、知識ベースの最適化手法に関するさらなる研究が必要である。
PAHの生分解に関する研究は、主に標準的な実験室条件下で行われています。しかし、汚染された場所や環境では、多くの非生物的要因および生物的要因（温度、pH、酸素、栄養素の利用可能性、基質の生物学的利用能、その他の異種物質、最終生成物の阻害など）が微生物の分解能力を変化させ、影響を与えることが示されています。
温度はPAHの生分解に大きな影響を与える。温度が上昇すると溶存酸素濃度が低下し、好気性微生物の代謝に影響を与える。好気性微生物は、ヒドロキシル化反応や環開裂反応を行うオキシゲナーゼの基質の一つとして分子状酸素を必要とするためである。高温によって親PAHがより毒性の高い化合物に変化し、生分解が阻害されることがよく指摘されている（Muller et al., 1998）。
PAH汚染サイトの多くは、酸性鉱山排水汚染サイト（pH 1～4）やアルカリ性浸出液で汚染された天然ガス/石炭ガス化サイト（pH 8～12）など、極端なpH値を示すことが指摘されている。これらの条件は、生物分解プロセスに深刻な影響を与える可能性がある。そのため、微生物を用いた生物修復を行う前に、アルカリ性土壌の場合は硫酸アンモニウムや硝酸アンモニウムなどの適切な化学物質（酸化還元電位が中程度から非常に低いもの）を添加してpHを調整するか、酸性サイトの場合は炭酸カルシウムや炭酸マグネシウムで石灰処理を行うことが推奨される（Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020）。
汚染された領域への酸素供給は、PAH の生分解の律速因子です。環境の酸化還元条件のため、原位置バイオレメディエーションプロセスでは通常、外部からの酸素導入 (耕起、エアースパージング、化学薬品の添加) が必要です (Pardieck et al., 1992)。Odenkranz et al. (1996) は、過酸化マグネシウム (酸素放出化合物) を汚染された帯水層に添加すると、BTEX 化合物を効果的にバイオレメディエーションできることを実証しました。別の研究では、硝酸ナトリウムを注入し、抽出井戸を構築して効果的なバイオレメディエーションを達成することにより、汚染された帯水層でのフェノールと BTEX の原位置分解を調査しました (Bewley and Webb, 2001)。