この記事は、「高度なバイオレメディエーション技術と合成有機化合物（SOC）リサイクルプロセス」という研究テーマの一部です。全14件の記事を見る
ナフタレンや置換ナフタレン（メチルナフタレン、ナフトエ酸、1-ナフチル-N-メチルカルバメートなど）などの低分子量多環芳香族炭化水素（PAH）は、様々な産業で広く使用されており、生物に対して遺伝毒性、変異原性、および/または発がん性があります。これらの合成有機化合物（SOC）または生体外物質は、優先汚染物質とみなされており、地球環境と公衆衛生に深刻な脅威をもたらします。人間活動（石炭ガス化、石油精製、車両排出ガス、農業用途など）の強度が、これらの遍在性かつ持続的な化合物の濃度、運命、および移動を決定します。物理的および化学的処理/除去方法に加えて、POCを完全に分解するか、無毒の副産物に変換する能力を持つ微生物を利用するバイオレメディエーションなどの環境に優しい技術が、安全で費用対効果が高く、有望な代替手段として浮上しています。土壌微生物叢に生息するプロテオバクテリア門（シュードモナス門、シュードモナス属、コマモナス属、ブルクホルデリア門、ネオスフィンゴバクテリウム門）、フィルミクテス門（バチルス属、パエニバチルス属）、放線菌門（ロドコッカス属、アルスロバクター属）に属する様々な細菌種は、様々な有機化合物を分解する能力を示すことが示されています。代謝研究、ゲノミクス、メタゲノム解析は、これらの単純な生命体における分解の複雑さと多様性を理解するのに役立ち、効率的な生分解に応用することができます。PAHの長期存在は、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、ゲノムアイランド、接合因子などの遺伝要素を用いた水平遺伝子伝播を通じて、新たな分解表現型の出現をもたらしました。特定の分離株またはモデル群集（コンソーシアム）を対象としたシステム生物学および遺伝子工学は、相乗効果を通じてこれらのPAHの包括的、迅速かつ効率的なバイオレメディエーションを可能にします。本レビューでは、ナフタレンおよび置換ナフタレン分解細菌の異なる代謝経路と多様性、遺伝子構成と多様性、そして細胞応答／適応に焦点を当てます。これにより、効率的なバイオレメディエーションのためのフィールド応用と菌株の最適化に必要な生態学的情報が得られます。
産業（石油化学、農業、医薬品、繊維染料、化粧品など）の急速な発展は、世界経済の繁栄と生活水準の向上に貢献してきました。この急速な発展は、様々な製品の製造に使用される大量の合成有機化合物（SOC）の生産をもたらしました。これらの外来化合物またはSOCには、多環芳香族炭化水素（PAH）、殺虫剤、除草剤、可塑剤、染料、医薬品、有機リン化合物、難燃剤、揮発性有機溶剤などが含まれます。これらは大気、水生および陸上生態系に放出され、そこで多面的な影響を及ぼし、物理化学的特性や群集構造の変化を通じて、様々な生物に有害な影響を及ぼします（Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020）。多くの芳香族汚染物質は、多くの無傷の生態系/生物多様性ホットスポット（例：サンゴ礁、北極/南極の氷床、高山の湖、深海堆積物など）に強力かつ破壊的な影響を及ぼします（Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020）。最近の地質微生物学的研究では、合成有機物（例：芳香族汚染物質）とその誘導体が人工構造物（構築環境）（例：花崗岩、石、木、金属でできた文化遺産や記念碑）の表面に沈着すると、それらの劣化が促進されることが示されています（Gadd 2017; Liu et al. 2018）。人間の活動は、大気汚染や気候変動を通じて、記念碑や建物の生物学的劣化を激化させ、悪化させる可能性があります（Liu et al. 2020）。これらの有機汚染物質は大気中の水蒸気と反応して構造物に付着し、材料の物理的および化学的劣化を引き起こします。生分解は、生物によって引き起こされる材料の外観や特性の望ましくない変化であり、保存に影響を与えることが広く認識されています（Pochon and Jaton, 1967）。これらの化合物に対する微生物のさらなる作用（代謝）は、構造の完全性、保存効果、そして文化的価値を低下させる可能性があります（Gadd, 2017; Liu et al., 2018）。一方で、微生物がこれらの構造に適応し、反応することでバイオフィルムなどの保護層が形成され、腐敗／分解速度が低下するため、場合によっては有益であることが分かっています（Martino, 2016）。したがって、石、金属、木造建造物の効果的で長期的な持続可能な保存戦略を策定するには、このプロセスに関わる主要なプロセスを徹底的に理解する必要があります。自然プロセス（地質学的プロセス、森林火災、火山噴火、植物および細菌の反応）と比較して、人間の活動は大量の多環芳香族炭化水素（PAH）やその他の有機炭素（OC）を生態系に放出します。農業（DDT、アトラジン、カルバリル、ペンタクロロフェノールなどの殺虫剤や農薬）、産業（原油、油スラッジ/廃棄物、石油由来プラスチック、PCB、可塑剤、洗剤、消毒剤、燻蒸剤、香料、防腐剤）、パーソナルケア製品（日焼け止め、消毒剤、虫よけ、多環式ムスク）、軍需品（2,4,6-TNTなどの爆発物）で使用される多くのPAHは、地球の健康に影響を及ぼす可能性のある潜在的な生体異物です（Srogi、2007年、Vamsee-KrishnaとPhale、2008年、Petrieら、2015年）。このリストは、石油由来化合物（燃料油、潤滑油、アスファルテン）、高分子量バイオプラスチック、イオン液体などを含むように拡張できます（Amde et al., 2015）。表1は、様々な芳香族汚染物質と、様々な産業におけるその用途を示しています。近年、揮発性有機化合物、二酸化炭素、その他の温室効果ガスの人為的排出量が増加し始めています（Dvorak et al., 2017）。しかし、人為的影響は自然の影響を大幅に上回っています。さらに、多くのSOCが多くの環境に残留し、バイオームに悪影響を及ぼす新興汚染物質として特定されていることもわかりました（図1）。米国環境保護庁（USEPA）などの環境機関は、細胞毒性、遺伝毒性、変異原性、発がん性があるため、これらの汚染物質の多くを優先リストに含めています。したがって、汚染された生態系からの廃棄物処理/除去のための厳格な廃棄規制と効果的な戦略が必要です。熱分解、酸化熱処理、空気曝気、埋め立て、焼却など、様々な物理的・化学的処理方法は効果が低く、費用がかかり、腐食性、毒性があり、処理が難しい副産物を生成します。世界的な環境意識の高まりに伴い、これらの汚染物質とその誘導体（ハロゲン化物、ニトロ基、アルキル化物、メチル化物など）を分解できる微生物への注目が高まっています（Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020）。これらの土着候補微生物を単独または混合培養（コロニー）で芳香族汚染物質の除去に使用することは、環境安全性、コスト、効率、有効性、持続可能性の面で利点があります。研究者らは、微生物プロセスと電気化学的酸化還元法、すなわちバイオ電気化学システム（BES）の統合を、汚染物質の処理/除去のための有望な技術として研究しています（Huang et al., 2011）。BES技術は、その高効率、低コスト、環境安全性、室温での動作、生体適合性材料、そして貴重な副産物（例：電気、燃料、化学物質）を回収する能力により、ますます注目を集めています（Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020）。ハイスループットゲノムシーケンシングおよびオミクスツール/手法の登場により、様々な分解微生物の反応の遺伝子制御、プロテオミクス、フラクソミクスに関する豊富な新情報が得られました。これらのツールをシステム生物学と組み合わせることで、効率的かつ効果的な生分解を達成するための微生物における標的分解経路の選択と微調整（すなわち、代謝設計）に関する理解がさらに深まりました。適切な候補微生物を使用して効果的なバイオレメディエーション戦略を設計するには、微生物の生化学的可能性、代謝の多様性、遺伝的構成、生態（自己生態学/共生態学）を理解する必要があります。
図1. 低分子PAHの発生源と、様々な環境および生物相に影響を与える様々な要因を通じた経路。破線は生態系要素間の相互作用を表す。
本レビューでは、ナフタレンや置換ナフタレンなどの単純PAHの分解に関するデータを、様々な細菌分離株を用いて、代謝経路と多様性、分解に関与する酵素、遺伝子構成・含有量と多様性、細胞応答、そしてバイオレメディエーションの様々な側面を網羅的にまとめようと試みました。生化学レベルおよび分子レベルの理解は、このような優先汚染物質の効果的なバイオレメディエーションに適した宿主株の特定と、それらの遺伝子工学的改良に役立ちます。これは、効果的なバイオレメディエーションのためのサイト特異的な細菌コンソーシアムの構築戦略の策定にも役立つでしょう。
ヒュッケル則を満たす4n + 2π電子、n = 1、2、3、…）の多数の有毒で有害な芳香族化合物の存在は、大気、土壌、堆積物、表層水、地下水などの様々な環境媒体に深刻な脅威をもたらします（Puglisi et al., 2007）。これらの化合物は、単一のベンゼン環（単環式）または複数のベンゼン環（多環式）が直線状、角状、またはクラスター状に配列しており、高い負の共鳴エネルギーと不活性（不活性）により、環境中で安定性（安定性／不安定性）を示します。これは、疎水性と還元状態によって説明できます。芳香環がメチル基（-CH3）、カルボキシル基（-COOH）、ヒドロキシル基（-OH）、またはスルホン酸基（-HSO3）に置換されると、より安定し、高分子との親和性が高まり、生物系において生体蓄積性を示す（Seo et al., 2009; Phale et al., 2020）。ナフタレンおよびその誘導体（メチルナフタレン、ナフトエ酸、ナフタレンスルホン酸、1-ナフチルN-メチルカルバメート（カルバリル））などの低分子量多環芳香族炭化水素（LMWAH）は、遺伝毒性、変異原性、および／または発がん性を有するとして、米国環境保護庁（EPA）の優先有機汚染物質リストに含まれています（Cerniglia, 1984）。このクラスの NM-PAH が環境中に放出されると、食物連鎖のあらゆるレベルでこれらの化合物が生体内蓄積され、生態系の健全性に影響を及ぼす可能性があります (Binkova 他、2000 年、Srogi、2007 年、Quinn 他、2009 年)。
PAH が生物相に及ぼす発生源および経路は、主に土壌、地下水、表層水、作物、大気などのさまざまな生態系構成要素間の移動および相互作用によるものです (Arey および Atkinson、2003)。図 1 は、生態系におけるさまざまな低分子量 PAH の相互作用と分布、および生物相や人間への曝露への経路を示しています。PAH は、大気汚染、および自動車の排気ガス、産業排ガス (石炭のガス化、燃焼、コークス製造) の移動 (漂流) とそれらの沈着によって表面に沈着します。合成繊維、染料、塗料の製造、木材防腐、ゴム加工、セメント製造活動、農薬製造、農業用途などの産業活動は、陸上および水生システムにおける PAH の主な発生源です (Bamforth および Singleton、2005; Wick ら、2011)。研究によると、郊外や都市部、高速道路付近、大都市の土壌は、発電所、住宅暖房、大気・道路交通負荷、建設活動からの排出により、多環芳香族炭化水素（PAH）の影響を受けやすいことが示されています（Suman et al., 2016）。また、（2008）は、米国ルイジアナ州ニューオーリンズの道路付近の土壌中のPAH濃度が7189 μg/kgにも達したのに対し、オープンスペースでは2404 μg/kgに過ぎないことを示しました。同様に、米国のいくつかの都市の石炭ガス化施設付近では、PAH濃度が300 μg/kgにも達したと報告されています（Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005）。デリー（Sharma et al., 2008）、アグラ（Dubey et al., 2014）、ムンバイ（Kulkarni and Venkataraman, 2000）、ヴィシャーカパトナム（Kulkarni et al., 2014）といったインドの様々な都市の土壌には、高濃度のPAHが含まれていることが報告されています。芳香族化合物は土壌粒子、有機物、粘土鉱物に吸着されやすく、生態系における主要な炭素吸収源となります（Srogi, 2007; Peng et al., 2008）。水生生態系におけるPAHの主な発生源は、降水（湿性降水／乾性降水および水蒸気）、都市流出水、廃水排出、地下水涵養などです（Srogi, 2007）。海洋生態系中のPAHの約80%は、降水、堆積、廃棄物の排出に由来すると推定されています（Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007）。表層水や固形廃棄物処分場からの浸出液に含まれる高濃度のPAHは最終的に地下水に漏れ出し、南アジアと東南アジアの人口の70%以上が地下水を飲んでいることから、大きな公衆衛生上の脅威となります（Duttagupta et al., 2019）。Duttagupta et al.（2020）によるインド西ベンガル州の河川（32）と地下水（235）の分析に関する最近の研究では、都市部居住者の推定53%と農村部居住者の44%（合計2000万人）がナフタレン（4.9～10.6 μg/L）とその誘導体に曝露されている可能性があることがわかりました。土地利用パターンの違いと地下水汲み上げの増加は、地下における低分子量PAHの垂直輸送（移流）を制御する主な要因であると考えられています。農業用排水、都市および産業廃水、固形廃棄物/ゴミの排出は、河川流域および地下堆積物中のPAHの影響を受けることが分かっています。大気降水はPAH汚染をさらに悪化させます。フレーザー川、ルーアン川、デンソー川、ミズーリ川、アナコスティア川、エブロ川、デラウェア川など、世界中の河川/流域で、高濃度のPAHとそのアルキル誘導体（合計51種）が報告されています（Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018）。ガンジス川流域の堆積物では、ナフタレンとフェナントレンが最も多く検出され（サンプルの70%で検出）ました（Duttagupta et al., 2019）。さらに、飲料水の塩素処理により、より毒性の高い酸素化PAHおよび塩素化PAHが生成される可能性があることが研究で示されています（Manoli and Samara, 1999）。PAHは、汚染された土壌、地下水、降水から植物が吸収した結果、穀物、果物、野菜に蓄積されます（Fismes et al., 2002）。魚、ムール貝、アサリ、エビなどの多くの水生生物は、汚染された食物や海水を摂取するだけでなく、組織や皮膚を通してPAHに汚染されています（Mackay and Fraser, 2000）。グリル、ロースト、燻製、揚げ物、乾燥、ベーキング、炭火調理などの調理・加工方法も、食品中に多量のPAHを蓄積させる可能性があります。これは、燻製材料の選択、フェノール／芳香族炭化水素含有量、調理手順、加熱器の種類、水分含有量、酸素供給量、燃焼温度に大きく依存します（Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013）。多環芳香族炭化水素（PAH）は、牛乳中でも様々な濃度（0.75～2.1 mg/L）で検出されています（Girelli et al., 2014）。食品中のこれらのPAHの蓄積は、食品の物理化学的特性にも依存しますが、その毒性作用は、生理機能、代謝活動、吸収、分布、体内分布に関連しています（Mechini et al., 2011）。
多環芳香族炭化水素（PAH）の毒性と有害作用は古くから知られています（Cherniglia, 1984）。低分子量多環芳香族炭化水素（LMW-PAH）（2～3環）は、DNA、RNA、タンパク質などのさまざまな高分子と共有結合し、発がん性があります（Santarelli et al., 2008）。疎水性のため、脂質膜で隔てられています。ヒトでは、シトクロムP450モノオキシゲナーゼがPAHをエポキシドに酸化しますが、その一部は反応性が高く（例：バエジオールエポキシド）、正常細胞を悪性細胞に変換する可能性があります（Marston et al., 2001）。さらに、キノン、フェノール、エポキシド、ジオールなどのPAHの変換生成物は、親化合物よりも毒性が強いです。一部のPAHおよびその代謝中間体は、ホルモンや代謝に関わる様々な酵素に影響を与え、成長、中枢神経系、生殖系、免疫系に悪影響を及ぼす可能性があります（Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008）。低分子量PAHへの短期曝露は、喘息患者の肺機能障害や血栓症、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、消化管がんのリスク増加を引き起こすことが報告されています（Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011）。動物実験では、PAH曝露が生殖機能や発達に悪影響を及ぼし、白内障、腎臓・肝臓障害、黄疸を引き起こす可能性があることも示されています。ジオール、エポキシド、キノン、フリーラジカル（カチオン）など、様々なPAH生体内変換生成物がDNA付加物を形成することが示されている。安定な付加物はDNA複製機構を変化させることが示されており、不安定な付加物はDNAを脱プリン化（主にアデニン、場合によってはグアニンに変換）する可能性があり、どちらも突然変異につながるエラーを生成する可能性がある（Schweigert et al. 2001）。さらに、キノン（ベンゾキノン/パンキノン）は活性酸素種（ROS）を生成し、DNAやその他の高分子に致命的な損傷を与え、組織の機能や生存に影響を及ぼす可能性がある（Ewa and Danuta 2017）。ピレン、ビフェニル、ナフタレンへの低濃度の慢性曝露は、実験動物にがんを引き起こすことが報告されている（Diggs et al. 2012）。これらのPAHは致死的な毒性を有するため、影響を受けた/汚染された場所からこれらのPAHを浄化/除去することが優先課題である。
汚染された場所や環境からPAHを除去するために、様々な物理的・化学的方法が用いられてきました。焼却、脱塩素化、紫外線酸化、固定化、溶媒抽出といったプロセスには、有毒な副産物の生成、プロセスの複雑さ、安全性と規制上の問題、低い効率、高コストなど、多くの欠点があります。しかし、微生物による生分解（バイオレメディエーション）は、純粋培養またはコロニーの形態の微生物を用いる有望な代替アプローチです。物理的・化学的方法と比較して、このプロセスは環境に優しく、非侵襲性で、費用対効果が高く、持続可能です。バイオレメディエーションは、影響を受けた場所（原位置）または特別に準備された場所（原位置外）で実行できるため、従来の物理的および化学的方法よりも持続可能な修復方法であると考えられています（Juhasz and Naidu、2000 年、Andreoni and Gianfreda、2007 年、Megharaj et al.、2011 年、Phale et al.、2020 年、Sarkar et al.、2020 年）。
芳香族汚染物質の分解に関与する微生物の代謝過程を理解することは、生態系と環境の持続可能性にとって、科学的にも経済的にも極めて重要な意味を持ちます。世界中で推定2.1×1018グラムの炭素（C）が堆積物や有機化合物（石油、天然ガス、石炭などの化石燃料）に蓄積されており、地球規模の炭素循環に大きく貢献しています。しかし、急速な工業化、化石燃料の採掘、そして人間の活動によって、これらの岩石圏炭素貯蔵庫は枯渇しつつあり、推定5.5×1015グラムの有機炭素（汚染物質として）が年間大気中に放出されています（Gonzalez-Gaya et al., 2019）。この有機炭素の大部分は、堆積、輸送、流出によって陸上および海洋生態系に流入します。さらに、プラスチック、可塑剤、プラスチック安定剤（フタル酸エステルおよびその異性体）などの化石燃料由来の新たな合成汚染物質は、海洋、土壌、水生生態系とその生物相を深刻に汚染し、地球規模の気候リスクを悪化させています。北米と東南アジアの間の太平洋には、ポリエチレンテレフタレート（PET）由来の様々な種類のマイクロプラスチック、ナノプラスチック、プラスチック片、そしてそれらの有毒モノマー生成物が蓄積し、「太平洋ゴミベルト」を形成し、海洋生物に危害を与えています（Newell et al., 2020）。科学的研究により、このような汚染物質／廃棄物を物理的または化学的方法で除去することは不可能であることが証明されています。この文脈において、最も有用な微生物とは、汚染物質を二酸化炭素、化学エネルギー、および最終的に他の栄養循環プロセス（H、O、N、S、P、Feなど）に入るその他の無毒の副産物に酸化代謝できる微生物です。したがって、芳香族汚染物質の鉱化とその環境制御における微生物生態生理学を理解することは、微生物炭素循環、正味炭素収支、そして将来の気候リスクを評価する上で極めて重要です。環境からこのような化合物を除去する必要性が急務となっていることから、クリーンテクノロジーに焦点を当てた様々なエコ産業が台頭しています。また、生態系に蓄積された産業廃棄物／廃化学物質の価値化（すなわち、廃棄物を富に変えるアプローチ）は、循環型経済と持続可能な開発目標の柱の一つと考えられています（Close et al., 2012）。したがって、これらの潜在的分解候補物質の代謝、酵素、遺伝学的側面を理解することは、このような芳香族汚染物質の効果的な除去とバイオレメディエーションにとって極めて重要です。
多くの芳香族汚染物質の中でも、ナフタレンや置換ナフタレンなどの低分子量PAHに特に注目しています。これらの化合物は、石油由来燃料、繊維染料、消費財、殺虫剤（防虫剤や虫よけ剤）、可塑剤、タンニンの主要成分であり、多くの生態系に広く存在しています（Preuss et al., 2003）。最近の報告では、帯水層堆積物、地下水、表層土壌、通気帯、河床におけるナフタレン濃度の蓄積が強調されており、環境中での生物濃縮が示唆されています（Duttagupta et al., 2019, 2020）。表2は、ナフタレンとその誘導体の物理化学的性質、用途、および健康への影響をまとめたものです。ナフタレンおよびその誘導体は、他の高分子PAHと比較して疎水性が低く、水溶性が高く、生態系に広く分布しているため、PAHの代謝、遺伝学、代謝多様性を研究するためのモデル基質としてよく用いられています。多くの微生物がナフタレンおよびその誘導体を代謝することができ、その代謝経路、酵素、調節機能に関する包括的な情報が得られています（Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020）。さらに、ナフタレンおよびその誘導体は、その高い存在量と生物学的利用能から、環境汚染評価のためのプロトタイプ化合物として指定されています。米国環境保護庁は、タバコの煙（主に不完全燃焼）からのナフタレンの平均濃度は1立方メートルあたり5.19μg、副流煙からのナフタレンの平均濃度は7.8～46μgであると推定している一方、クレオソートやナフタレンへの曝露は100～10,000倍高い（Preuss et al. 2003）。特にナフタレンは、種、地域、性別特異的な呼吸器毒性および発がん性を持つことが判明している。動物実験に基づき、国際がん研究機関（IARC）はナフタレンを「ヒトに対する発がん性の可能性がある」（グループ2B）1に分類している。主に吸入または非経口（経口）投与による置換ナフタレンへの曝露は、ラットおよびマウスの肺組織損傷を引き起こし、肺腫瘍の発生率を増加させる（国家毒性プログラム2）。急性影響としては、吐き気、嘔吐、腹痛、下痢、頭痛、錯乱、多量の発汗、発熱、頻脈などが挙げられます。一方、広域スペクトルのカーバメート系殺虫剤であるカルバリル（1-ナフチルN-メチルカルバメート）は、水生無脊椎動物、両生類、ミツバチ、そしてヒトに対して毒性を示すことが報告されており、アセチルコリンエステラーゼを阻害して麻痺を引き起こすことが示されています（Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011）。したがって、微生物による分解、遺伝子制御、酵素反応、細胞反応のメカニズムを理解することは、汚染環境におけるバイオレメディエーション戦略の開発に不可欠です。
表 2. ナフタレンとその誘導体の物理化学的性質、用途、識別方法、および関連する疾患に関する詳細情報。
汚染されたニッチにおいて、疎水性および親油性の芳香族汚染物質は、環境微生物群集（群集）に対して、膜流動性、膜透過性、脂質二重層の膨潤、エネルギー伝達（電子伝達系／プロトン駆動力）の阻害、膜関連タンパク質の活性など、様々な細胞影響を引き起こす可能性がある（Sikkema et al., 1995）。さらに、カテコールやキノンなどの可溶性中間体は、活性酸素種（ROS）を生成し、DNAやタンパク質と付加体を形成する（Penning et al., 1999）。このように、生態系におけるこれらの化合物の豊富さは、微生物群集に選択圧をかけ、取り込み／輸送、細胞内変換、同化／利用、区画化など、様々な生理学的レベルで効率的な分解者となるよう促す。
リボソームデータベースプロジェクトII（RDP-II）の検索により、ナフタレンまたはその誘導体に汚染された培地または増菌培養物から合計926種の細菌が分離されたことが明らかになりました。プロテオバクテリア群の菌数が最も多く（n = 755）、次いでフィルミクテス門（52）、バクテロイデス門（43）、アクチノバクテリア門（39）、テネリクテス門（10）、未分類細菌（8）の順でした（図2）。γ-プロテオバクテリア（シュードモナダ目およびキサントモナダ目）の菌は、G+C含量が高く（54%）、グラム陰性菌群の大部分を占めていました。一方、クロストリジウム目およびバシラ目（30%）は、G+C含量が低く、グラム陽性菌群でした。シュードモナス属（最も多く、338種）は、様々な汚染生態系（コールタール、石油、原油、スラッジ、油流出、廃水、有機廃棄物、埋立地）だけでなく、健全な生態系（土壌、河川、堆積物、地下水）においても、ナフタレンとそのメチル誘導体を分解できることが報告されています（図2）。さらに、これらの地域の一部における集積研究とメタゲノム解析により、培養されていないレジオネラ属およびクロストリジウム属にも分解能力がある可能性があることが明らかになりました。これは、新たな経路と代謝多様性を研究するために、これらの細菌を培養する必要があることを示唆しています。
図2. ナフタレンおよびナフタレン誘導体に汚染された環境における細菌の代表の分類学的多様性と生態学的分布。
芳香族炭化水素を分解する様々な微生物のうち、ほとんどはナフタレンを唯一の炭素源およびエネルギー源として分解することができます。ナフタレン代謝に関わる一連の反応は、Pseudomonas属において既に報告されています。 (株: NCIB 9816-4、G7、AK-5、PMD-1 および CSV86)、Pseudomonas stutzeri AN10、Pseudomonas fluorescens PC20 およびその他の株 (ND6 および AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; 代謝は、ナフタレンの芳香環の 1 つを分子状酸素をもう一方の基質として酸化する反応を触媒する多成分ジオキシゲナーゼ [ナフタレンジオキシゲナーゼ (NDO)、環ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼ] によって開始され、ナフタレンを cis-ナフタレンジオールに変換します (図 3)。シス-ジヒドロジオールは脱水素酵素によって1,2-ジヒドロキシナフタレンに変換される。環開裂ジオキシゲナーゼである1,2-ジヒドロキシナフタレンジオキシゲナーゼ（12DHNDO）は、1,2-ジヒドロキシナフタレンを2-ヒドロキシクロメン-2-カルボン酸に変換する。酵素によるシス-トランス異性化によりトランス-o-ヒドロキシベンジリデンピルビン酸が生成され、これはヒドラターゼアルドラーゼによってサリチルアルデヒドとピルビン酸に分解される。有機酸であるピルビン酸は、ナフタレン炭素骨格から誘導され、中心炭素経路へと導かれる最初のC3化合物である。さらに、NAD+依存性サリチルアルデヒド脱水素酵素は、サリチルアルデヒドをサリチル酸に変換する。この段階の代謝は、ナフタレン分解の「上流経路」と呼ばれる。この経路は、ほとんどのナフタレン分解細菌で非常に一般的である。しかし、いくつかの例外があり、例えば、好熱性バチルス・ハンブルギ2では、ナフタレンの分解はナフタレン2,3-ジオキシゲナーゼによって開始され、2,3-ジヒドロキシナフタレンが形成される (Annweiler et al., 2000)。
図3. ナフタレン、メチルナフタレン、ナフトエ酸、およびカルバリルの分解経路。丸で囲まれた数字は、ナフタレンおよびその誘導体を後続の生成物へと順次変換する酵素を表す。1 — ナフタレンジオキシゲナーゼ（NDO）、2、シス-ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、3、1,2-ジヒドロキシナフタレンジオキシゲナーゼ、4、2-ヒドロキシクロメン-2-カルボン酸イソメラーゼ、5、トランス-O-ヒドロキシベンジリデンピルビン酸ヒドラターゼアルドラーゼ、6、サリチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、7、サリチル酸1-ヒドロキシラーゼ、8、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ（C23DO）、9、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、10、2-オキソペント-4-エノ酸ヒドラターゼ。 11、4-ヒドロキシ-2-オキソペンタノ酸アルドラーゼ; 12、アセトアルデヒド脱水素酵素; 13、カテコール-1,2-ジオキシゲナーゼ (C12DO); 14、ムコン酸シクロイソメラーゼ; 15、ムコノラクトン デルタ-イソメラーゼ; 16、β-ケトアジパテノラクトン加水分解酵素; 17、β-ケトアジペートスクシニル-CoA トランスフェラーゼ; 18、β-ケトアジペート-CoA チオラーゼ; 19、スクシニル-CoA: アセチル-CoA サクシニルトランスフェラーゼ; 20、サリチル酸 5-ヒドロキシラーゼ; 21 – ゲンチシン酸 1,2-ジオキシゲナーゼ (GDO); 22、マレイルピルビン酸イソメラーゼ; 23、フマリルピルビン酸加水分解酵素; 24、メチルナフタレンヒドロキシラーゼ（NDO）、25、ヒドロキシメチルナフタレンデヒドロゲナーゼ、26、ナフトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、27、3-ホルミルサリチル酸オキシダーゼ、28、ヒドロキシイソフタル酸デカルボキシラーゼ、29、カルバリルヒドロラーゼ（CH）、30、1-ナフトール-2-ヒドロキシラーゼ。
生物とその遺伝子構成に応じて、生成されたサリチル酸は、サリチル酸1-水酸化酵素（S1H）を使用するカテコール経路、またはサリチル酸5-水酸化酵素（S5H）を使用するゲンチシン酸経路のいずれかでさらに代謝されます（図3）。サリチル酸はナフタレン代謝（上流経路）における主要な中間体であるため、サリチル酸からTCA中間体までのステップは下流経路と呼ばれることが多く、遺伝子は単一のオペロンに編成されています。上流経路オペロン（nah）と下流経路オペロン（sal）の遺伝子は共通の制御因子によって制御されるのが一般的です。たとえば、NahRとサリチル酸は誘導因子として作用し、両方のオペロンがナフタレンを完全に代謝できるようにします（Phale et al.、2019、2020）。
さらに、カテコールは、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ（C23DO）（Yen et al., 1988）によってメタ経路を経て2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドへと環状切断され、さらに2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド加水分解酵素によって加水分解されて2-ヒドロキシペント-2,4-ジエン酸が形成される。2-ヒドロキシペント-2,4-ジエン酸は、ヒドラターゼ（2-オキソペント-4-エノエートヒドラターゼ）とアルドラーゼ（4-ヒドロキシ-2-オキソペンタノエートアルドラーゼ）によってピルビン酸とアセトアルデヒドに変換され、中心炭素経路に入る（図3）。あるいは、カテコールは、カテコール1,2-オキシゲナーゼ（C12DO）によってオルト経路を経てシス,シス-ムコン酸へと環状切断される。ムコン酸シクロイソメラーゼ、ムコノラクトンイソメラーゼ、およびβ-ケトアジペート-ノラクトンヒドロラーゼは、シス、シス-ムコン酸を​​3-オキソアジペートに変換し、これはスクシニルCoAとアセチルCoAを介して中心炭素経路に入ります（Nozaki et al.、1968）（図3）。
ゲンチシン酸（2,5-ジヒドロキシ安息香酸）経路では、芳香環がゲンチシン酸1,2-ジオキシゲナーゼ（GDO）によって切断され、マレイルピルビン酸が生成される。この生成物は、直接加水分解されてピルビン酸とリンゴ酸になるか、異性化されてフマリルピルビン酸となり、さらに加水分解されてピルビン酸とフマル酸になる（Larkin and Day, 1986）。この代替経路の選択は、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方において、生化学的および遺伝学的レベルで観察されている（Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997）。グラム陰性細菌（Pseudomonas）は、ナフタレン代謝の誘導物質であるサリチル酸を好んで利用し、サリチル酸1-水酸化酵素を用いて脱炭酸し、カテコールに変換します（Gibson and Subramanian, 1984）。一方、グラム陽性細菌（Rhodococcus）では、サリチル酸5-水酸化酵素がサリチル酸をゲンチシン酸に変換しますが、サリチル酸はナフタレン遺伝子の転写を誘導しません（Grund et al., 1992）（図3）。
Pseudomonas CSV86、Oceanobacterium NCE312、Marinhomonas naphthotrophicus、Sphingomonas paucimobilis 2322、Vibrio cyclotrophus、Pseudomonas fluorescens LP6a、Pseudomonas属、Mycobacterium属などの菌種がモノメチルナフタレンまたはジメチルナフタレンを分解することが報告されています（Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999）。中でも、Pseudomonas sp. CSV86の1-メチルナフタレンおよび2-メチルナフタレン分解経路は、生化学的および酵素的レベルで明確に研究されています（Mahajan et al., 1994）。 1-メチルナフタレンは2つの経路で代謝されます。まず、芳香環（メチルナフタレンの非置換環）が水酸化され、シス-1,2-ジヒドロキシ-1,2-ジヒドロ-8-メチルナフタレンが形成されます。これはさらに酸化されてサリチル酸メチルとメチルカテコールとなり、環開裂後に中心炭素経路に入ります（図3）。この経路は「炭素源経路」と呼ばれます。2つ目の「解毒経路」では、メチル基がNDOによって水酸化され、1-ヒドロキシメチルナフタレンが形成されます。これはさらに酸化されて1-ナフトエ酸となり、最終生成物として培養液中に排出されます。研究により、CSV86株は1-ナフトエ酸および2-ナフトエ酸を唯一の炭素源およびエネルギー源として生育できないことが示されており、解毒経路が確認されています（Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003）。2-メチルナフタレンでは、メチル基がヒドロキシラーゼによって水酸化され、2-ヒドロキシメチルナフタレンが生成されます。さらに、ナフタレン環の非置換環が環ヒドロキシル化されてジヒドロジオールが生成され、これが一連の酵素触媒反応で4-ヒドロキシメチルカテコールに酸化され、メタ環開裂経路を経て中心炭素経路に入ります。同様に、S. paucimobilis 2322はNDOを利用して2-メチルナフタレンを水酸化し、これがさらに酸化されてサリチル酸メチルとメチルカテコールを生成することが報告されています（Dutta et al., 1998）。
ナフトエ酸（置換型／非置換型）は、メチルナフタレン、フェナントレン、およびアントラセンの分解中に生成され、使用済み培養培地中に放出される解毒／生体内変換副産物である。土壌分離株Stenotrophomonas maltophilia CSV89は、1-ナフトエ酸を炭素源として代謝できることが報告されている（Phale et al., 1995）。代謝は芳香環のジヒドロキシ化から始まり、1,2-ジヒドロキシ-8-カルボキシナフタレンを形成する。生成されたジオールは、2-ヒドロキシ-3-カルボキシベンジリデンピルビン酸、3-ホルミルサリチル酸、2-ヒドロキシイソフタル酸、およびサリチル酸を経てカテコールに酸化され、メタ環開裂経路を経て中心炭素経路に入る（図3）。
カルバリルはナフチルカルバメート系農薬です。1970年代のインドにおける緑の革命以降、化学肥料と農薬の使用により、農業における非点源からの多環芳香族炭化水素（PAH）排出量が増加しています（Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020）。インドの耕作地全体の推定55%（85,722,000ヘクタール）が化学農薬で処理されています。過去5年間（2015～2020年）のインドの農業部門では、年間平均55,000～60,000トンの農薬が使用されています（インド政府農業省協同組合・農家福祉局、2020年8月）。ガンジス平原の北部および中部（人口および人口密度が最も高い州）では、作物に対する農薬の使用が広範で、殺虫剤が主流です。カルバリル（1-ナフチル-N-メチルカルバメート）は、広範囲に及ぶ、中程度から高度に毒性のあるカルバメート系殺虫剤で、インドの農業では平均 100～110 トン使用されています。一般にセビンという商標で販売されており、さまざまな作物（トウモロコシ、大豆、綿花、果物、野菜）に影響を及ぼす昆虫（アブラムシ、ヒアリ、ノミ、ダニ、クモ、その他多くの屋外害虫）の駆除に使用されています。Pseudomonas（NCIB 12042、12043、C4、C5、C6、C7、Pseudomonas putida XWY-1）、Rhodococcus（NCIB 12038）、Sphingobacterium spp などの微生物は、カルバリルによく見られます。 (CF06)、Burkholderia (C3)、Micrococcus、Arthrobacterなどの殺菌剤も、他の害虫の防除に使用できます。RC100はカルバリルを分解できることが報告されています（Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017）。カルバリルの分解経路は、Pseudomonas sp.株C4、C5、C6の土壌分離株において、生化学的、酵素的、遺伝学的レベルで広範囲に研究されています（Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016）（図3）。代謝経路は、カルバリル加水分解酵素（CH）によるエステル結合の加水分解から始まり、1-ナフトール、メチルアミン、二酸化炭素が生成されます。 1-ナフトールは、1-ナフトールヒドロキシラーゼ（1-NH）によって1,2-ジヒドロキシナフタレンに変換され、さらに中心炭素経路を経てサリチル酸およびゲンチジン酸へと代謝される。一部のカルバリル分解細菌は、カテコールオルト環の切断を介してサリチル酸へと代謝することが報告されている（Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991）。特に、ナフタレン分解細菌は主にカテコールを介してサリチル酸を代謝するのに対し、カルバリル分解細菌はゲンチジン酸経路を介してサリチル酸を代謝することを好む。
ナフタレンスルホン酸／ジスルホン酸およびナフチルアミンスルホン酸誘導体は、アゾ染料、湿潤剤、分散剤などの製造における中間体として用いることができる。これらの化合物はヒトに対する毒性は低いものの、細胞毒性評価では魚類、ミジンコ、藻類に対して致死性を示すことが示されている（Greim et al., 1994）。Pseudomonas属（A3株、C22株）の代表株は、スルホン酸基を含む芳香環の二重水酸化によって代謝を開始し、ジヒドロジオールを形成することが報告されている。ジヒドロジオールはさらに亜硫酸基の自発的分解によって1,2-ジヒドロキシナフタレンへと変換される（Brilon et al., 1981）。得られた1,2-ジヒドロキシナフタレンは、古典的なナフタレン経路、すなわちカテコール経路またはゲンチシン経路によって異化される（図4）。アミノナフタレンスルホン酸およびヒドロキシナフタレンスルホン酸は、相補的な分解経路を持つ混合細菌コンソーシアムによって完全に分解されることが示されている (Nortemann et al., 1986)。コンソーシアムの1つのメンバーが1,2-二酸素化によってアミノナフタレンスルホン酸またはヒドロキシナフタレンスルホン酸を脱硫する一方で、アミノサリチル酸またはヒドロキシサリチル酸が最終代謝産物として培地中に放出され、その後コンソーシアムの他のメンバーに取り込まれることが示されている。ナフタレンジスルホン酸は比較的極性が高いが生分解性が低いため、異なる経路で代謝される。最初の脱硫は、芳香環とスルホン酸基の位置選択的ジヒドロキシル化中に起こる。 2番目の脱硫反応は、サリチル酸5-ヒドロキシラーゼによる5-スルホサリチル酸の水酸化中に起こり、ゲンチシン酸が生成され、これが中心炭素経路に入ります（Brilon et al., 1981）（図4）。ナフタレンの分解に関与する酵素は、ナフタレンスルホン酸の代謝にも関与しています（Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006）。
図4. ナフタレンスルホン酸分解の代謝経路。円内の数字はナフチルスルホン酸代謝に関与する酵素を表し、図3で説明した酵素と類似／同一である。
低分子量PAH（LMW-PAH）は還元可能で疎水性で難溶性であるため、自然に分解/分解されにくい。しかし、好気性微生物は分子状酸素（O2）を吸収して酸化することができる。これらの酵素は主に酸化還元酵素のクラスに属し、芳香環水酸化（モノまたはジヒドロキシル化）、脱水素、芳香環切断などのさまざまな反応を実行できます。これらの反応で得られる生成物はより高い酸化状態にあり、中心炭素経路を介してより容易に代謝されます（Phale et al.、2020）。分解経路の酵素は誘導性であると報告されています。細胞がグルコースや有機酸などの単純な炭素源で増殖した場合、これらの酵素の活性は非常に低いか無視できます。表 3 は、ナフタレンとその誘導体の代謝に関与するさまざまな酵素（オキシゲナーゼ、加水分解酵素、脱水素酵素、オキシダーゼなど）をまとめたものです。
表3. ナフタレンおよびその誘導体の分解に関与する酵素の生化学的特性。
放射性同位元素研究 (18O2) により、分子状酸素 (O2) がオキシゲナーゼによって芳香環に取り込まれることが、化合物のさらなる生分解を活性化する上で最も重要なステップであることが示されています (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955)。分子状酸素 (O2) から 1 つの酸素原子 (O) が基質に取り込まれるのは、内因性または外因性のモノオキシゲナーゼ (ヒドロキシラーゼとも呼ばれる) によって開始されます。もう 1 つの酸素原子は水に還元されます。外因性モノオキシゲナーゼは NADH または NADPH を使用してフラビンを還元しますが、エンドモノオキシゲナーゼでは、フラビンは基質によって還元されます。水酸化の位置によって、生成物の形成に多様性が生じます。たとえば、サリチル酸 1-ヒドロキシラーゼはサリチル酸の C1 位を水酸化してカテコールを形成します。一方、多成分サリチル酸 5-ヒドロキシラーゼ（還元酵素、フェレドキシン、およびオキシゲナーゼサブユニットを含む）は、サリチル酸の C5 位をヒドロキシル化し、ゲンチシン酸を形成します（山本ら、1965）。
ジオキシゲナーゼは基質に2つのO2原子を組み込みます。生成する生成物の種類によって、環水酸化ジオキシゲナーゼと環切断ジオキシゲナーゼに分類されます。環水酸化ジオキシゲナーゼは芳香族基質をシス-ジヒドロジオール（例：ナフタレン）に変換し、細菌に広く分布しています。現在までに、環水酸化ジオキシゲナーゼを有する生物は様々な芳香族炭素源上で生育できることが示されており、これらの酵素はNDO（ナフタレン）、トルエンジオキシゲナーゼ（TDO、トルエン）、およびビフェニルジオキシゲナーゼ（BPDO、ビフェニル）に分類されます。 NDOとBPDOはともに、様々な多環芳香族炭化水素（トルエン、ニトロトルエン、キシレン、エチルベンゼン、ナフタレン、ビフェニル、フルオレン、インドール、メチルナフタレン、ナフタレンスルホン酸、フェナントレン、アントラセン、アセトフェノンなど）の二重酸化および側鎖水酸化を触媒します（Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020）。NDOは、酸化還元酵素、フェレドキシン、および活性部位を含むオキシゲナーゼ成分からなる多成分系です（Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996）。NDOの触媒ユニットは、α3β3構造に配置された大きなαサブユニットと小さなβサブユニットで構成されています。 NDOは、オキシゲナーゼの大きなファミリーに属し、そのαサブユニットにはリースケ部位[2Fe-2S]と単核非ヘム鉄が含まれており、これがNDOの基質特異性を決定します（Parales et al., 1998）。典型的には、1回の触媒サイクルで、ピリジンヌクレオチドの還元によって得られた2つの電子が、還元酵素、フェレドキシン、そしてリースケ部位を介して活性部位のFe(II)イオンに伝達されます。還元当量は、基質のジヒドロキシ化の前提条件である分子状酸素を活性化します（Ferraro et al., 2005）。現在までに、異なる株から精製され、詳細に特徴付けられたNDOはごくわずかであり、ナフタレン分解に関与する経路の遺伝的制御については詳細に研究されています（Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003）。環開裂ジオキシゲナーゼ（エンド環またはオルト環開裂酵素、およびエキソジオール環またはメタ環開裂酵素）は、ヒドロキシル化された芳香族化合物に作用します。例えば、オルト環開裂ジオキシゲナーゼはカテコール-1,2-ジオキシゲナーゼであり、メタ環開裂ジオキシゲナーゼはカテコール-2,3-ジオキシゲナーゼです（Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968）。様々なオキシゲナーゼに加えて、芳香族ジヒドロジオール、アルコール、アルデヒドの脱水素反応を担い、NAD+/NADP+を電子受容体として用いる様々な脱水素酵素も存在し、これらは代謝に関与する重要な酵素の一つです（Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020）。
加水分解酵素（エステラーゼ、アミダーゼ）などの酵素は、水を利用して共有結合を切断し、幅広い基質特異性を示す、2番目に重要な酵素クラスです。カルバリル加水分解酵素およびその他の加水分解酵素は、グラム陰性細菌のペリプラズム（膜貫通型）の構成要素であると考えられています（Kamini et al., 2018）。カルバリルはアミド結合とエステル結合の両方を持っているため、エステラーゼまたはアミダーゼのいずれかによって加水分解され、1-ナフトールを形成します。Rhizobium rhizobium株AC10023およびArthrobacter株RC100のカルバリルは、それぞれエステラーゼおよびアミダーゼとして機能することが報告されています。Arthrobacter株RC100のカルバリルはアミダーゼとしても機能します。 RC100は、カルバリル、メトミル、メフェナム酸、XMCといった4種類のN-メチルカルバメート系殺虫剤を加水分解することが示されている（Hayaatsu et al., 2001）。Pseudomonas sp. C5ppのCHはカルバリル（100%活性）および1-ナフチルアセテート（36%活性）に作用するが、1-ナフチルアセトアミドには作用しないことが報告されており、これはRC100がエステラーゼであることを示唆している（Trivedi et al., 2016）。
生化学的研究、酵素調節パターン、および遺伝子解析により、ナフタレン分解遺伝子は、2つの誘導性調節単位または「オペロン」、すなわちnah（ナフタレンをサリチル酸に変換する「上流経路」）とsal（カテコールを経由してサリチル酸を中心炭素経路に変換する「下流経路」）で構成されることが示されています。サリチル酸とその類似体は誘導剤として作用します（Shamsuzzaman and Barnsley, 1974）。グルコースまたは有機酸の存在下では、オペロンは抑制されます。図5は、ナフタレン分解の完全な遺伝子構成（オペロン形式）を示しています。nah遺伝子のいくつかの命名された変異体/形態（ndo/pah/dox）が記載されており、すべてのPseudomonas種間で高い配列相同性（90％）が見出されています（Abbasian et al., 2016）。ナフタレン上流経路の遺伝子は、図5Aに示すように、概ねコンセンサス順序で配列している。nahQという別の遺伝子もナフタレン代謝に関与することが報告されており、通常はnahCとnahEの間に位置するが、その実際の機能は未だ解明されていない。同様に、ナフタレン感受性走化性を担うnahY遺伝子は、一部の菌株においてnahオペロンの遠位端に位置することが確認されている。Ralstonia属においては、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（gsh）をコードするU2遺伝子がnahAaとnahAbの間に位置することが確認されているが、ナフタレンの利用特性には影響を与えない（Zylstra et al., 1997）。
図 5. 細菌種間でのナフタレン分解中に観察される遺伝子構成と多様性。(A) ナフタレンの上部経路、ナフタレンからサリチル酸への代謝。(B) ナフタレンの下部経路、サリチル酸からカテコールを経て中心炭素経路へ。(C) サリチル酸からゲンチシン酸を経て中心炭素経路へ。
「下流経路」（salオペロン）は典型的にはnahGTHINLMOKJから構成され、カテコールメタリング分解経路を介してサリチル酸をピルビン酸とアセトアルデヒドに変換する。nahG遺伝子（サリチル酸水酸化酵素をコードする）は、オペロンの近位端に保存されていることが明らかになった（図5B）。他のナフタレン分解菌株と比較して、P. putida CSV86ではnahオペロンとsalオペロンが縦列しており、非常に近縁である（約7.5 kb）。Ralstonia sp. U2、Polaromonas naphthalenivorans CJ2、P. putida AK5などの一部のグラム陰性細菌では、ナフタレンはゲンチジン酸経路（sgp/nagオペロンの形態）を介して中心炭素代謝物として代謝される。遺伝子カセットは通常、nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI の形式で表され、nagR (LysR 型調節因子をエンコード) は上端に位置します (図 5C)。
カルバリルは、1-ナフトール、1,2-ジヒドロキシナフタレン、サリチル酸、ゲンチシン酸の代謝を介して中心炭素循環に入ります（図3）。遺伝学的および代謝学的研究に基づき、この経路は「上流」（カルバリルからサリチル酸への変換）、「中間」（サリチル酸からゲンチシン酸への変換）、「下流」（ゲンチシン酸から中心炭素経路中間体への変換）の3つに分けられることが提唱されています（Singh et al., 2013）。 C5pp（スーパーコンティグA、76.3 kb）のゲノム解析により、mcbACBDEF遺伝子がカルバリルからサリチル酸への変換に関与し、続いてmcbIJKLがサリチル酸からゲンチシン酸への変換に、mcbOQPがゲンチシン酸から中心炭素中間体（フマル酸およびピルビン酸、Trivediら、2016）への変換に関与していることが明らかになりました（図6）。
芳香族炭化水素（ナフタレンやサリチル酸を含む）の分解に関与する酵素は、対応する化合物によって誘導され、グルコースや有機酸などの単純な炭素源によって阻害されることが報告されている（Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020）。ナフタレンおよびその誘導体の様々な代謝経路のうち、ナフタレンとカルバリルの調節特性はある程度研究されている。ナフタレンの場合、上流経路と下流経路の両方の遺伝子は、LysR型トランスアクティング正調節因子であるNahRによって制御されている。これは、サリチル酸によるnah遺伝子の誘導とそれに続く高レベル発現に必要である（Yen and Gunsalus, 1982）。さらに、統合宿主因子（IHF）とXylR（シグマ54依存性転写制御因子）も、ナフタレン代謝における遺伝子の転写活性化に重要であることが研究で示されています（Ramos et al., 1997）。また、カテコールメタ環開環経路の酵素、すなわちカテコール2,3-ジオキシゲナーゼは、ナフタレンおよび／またはサリチル酸の存在下で誘導されることが研究で示されています（Basu et al., 2006）。さらに、カテコールオルト環開環経路の酵素、すなわちカテコール1,2-ジオキシゲナーゼは、安息香酸およびcis,cis-ムコン酸の存在下で誘導されることが研究で示されています（Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001）。
C5pp株では、5つの遺伝子（mcbG、mcbH、mcbN、mcbR、mcbS）が、カルバリル分解を制御する転写制御因子LysR/TetRファミリーに属する制御因子をコードしている。相同遺伝子mcbGは、Burkholderia RP00725におけるフェナントレン代謝に関与するLysR型制御因子PhnS（アミノ酸相同性58%）と最も近縁であることが判明した（Trivedi et al., 2016）。mcbH遺伝子は中間経路（サリチル酸からゲンチシン酸への変換）に関与することが判明しており、PseudomonasおよびBurkholderiaにおいてLysR型転写制御因子NagR/DntR/NahRに属する。このファミリーのメンバーは、サリチル酸を分解遺伝子誘導のための特異的エフェクター分子として認識することが報告されている。一方、下流経路（ゲンチジン酸-中心炭素経路代謝物）では、LysRおよびTetR型転写調節因子に属する3つの遺伝子、mcbN、mcbR、およびmcbSが同定されました。
原核生物において、プラスミド、トランスポゾン、プロファージ、ゲノムアイランド、接合因子（ICE）を介した水平遺伝子伝達（獲得、交換、または転移）は、細菌ゲノムの可塑性の主要な要因であり、特定の機能／形質の獲得または喪失につながります。これにより、細菌は異なる環境条件に迅速に適応することができ、宿主に芳香族化合物の分解といった潜在的な適応代謝上の利点をもたらします。代謝変化は、分解オペロン、その制御機構、および酵素特異性の微調整を通じて達成されることが多く、より広範な芳香族化合物の分解を促進します（Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020）。ナフタレン分解遺伝子カセットは、プラスミド（接合性および非接合性）、トランスポゾン、ゲノム、ICE、そして異なる細菌種の組み合わせなど、様々な可動性因子上に局在することが分かっています（図5）。Pseudomonas G7では、プラスミドNAH7のnahオペロンとsalオペロンは同じ方向に転写され、移動にトランスポザーゼTn4653を必要とする欠陥トランスポゾンの一部となっています（Sota et al., 2006）。Pseudomonas株NCIB9816-4では、この遺伝子は接合性プラスミドpDTG1上に、約15 kb離れた2つのオペロンとして存在し、それぞれが反対方向に転写されていました（Dennis and Zylstra, 2004）。 Pseudomonas putida AK5株では、非接合プラスミドpAK5がゲンチシン酸経路を介したナフタレン分解酵素をコードする（Izmalkova et al., 2013）。Pseudomonas PMD-1株では、nahオペロンは染色体上に、salオペロンは接合プラスミドpMWD-1上に存在する（Zuniga et al., 1981）。しかし、Pseudomonas stutzeri AN10では、すべてのナフタレン分解遺伝子（nahオペロンとsalオペロン）が染色体上に存在し、転座、組換え、および再編成によってリクルートされると考えられる（Bosch et al., 2000）。Pseudomonas sp. CSV86では、nahオペロンとsalオペロンはICE（ICECSV86）の形でゲノム上に存在している。この構造はtRNAGlyによって保護されており、その後に組換え/接着部位（attRとattL）を示す直接反復配列と、tRNAGlyの両端に位置するファージ様インテグラーゼが続くため、ICEclcエレメント（クロロカテコール分解におけるPseudomonas knackmusiiのICEclcB13）と構造的に類似しています。ICE上の遺伝子は、極めて低い移動頻度（10-8）で接合によって転移され、それによって受容体に分解特性が転移されることが報告されています（Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019）。
カルバリル分解に関与する遺伝子のほとんどはプラスミド上に存在する。Arthrobacter sp. RC100は3つのプラスミド（pRC1、pRC2、pRC300）を含み、そのうち2つの接合プラスミドpRC1とpRC2はカルバリルをゲンチセートに変換する酵素をコードする。一方、ゲンチセートから中心炭素代謝物への変換に関与する酵素は染色体上に存在する（Hayaatsu et al., 1999）。カルバリルから1-ナフトールへの変換に使用されるRhizobium属細菌株AC100は、挿入要素様配列（istAおよびistB）に囲まれたTncehトランスポゾンの一部としてCHをコードするcehA遺伝子を含むプラスミドpAC200を含む（Hashimoto et al., 2002）。スフィンゴモナスCF06株では、カルバリル分解遺伝子は5つのプラスミド（pCF01、pCF02、pCF03、pCF04、pCF05）に存在すると考えられています。これらのプラスミドのDNA相同性は高く、遺伝子重複が起こっていることを示しています（Feng et al., 1997）。2種のシュードモナス属細菌からなるカルバリル分解共生菌において、50581株はmcdカルバリル加水分解酵素遺伝子をコードする接合プラスミドpCD1（50 kb）を有し、一方、50552株の接合プラスミドはl-ナフトール分解酵素をコードしています（Chapalamadugu and Chaudhry, 1991）。アクロモバクターWM111株では、mcdフラダン加水分解酵素遺伝子は100 kbのプラスミド（pPDL11）上に存在します。この遺伝子は、異なる地理的地域に生息する異なる細菌において、異なるプラスミド（100、105、115、または124 kb）上に存在することが示されている（Parekh et al., 1995）。Pseudomonas sp. C5ppでは、カルバリル分解に関与するすべての遺伝子が76.3 kbに及ぶゲノム配列に存在する（Trivedi et al., 2016）。ゲノム解析（6.15 Mb）では、42個のMGEと36個のGEIが存在することが明らかになった。そのうち17個のMGEは、平均非対称G+C含量（54～60 mol%）のスーパーコンティグA（76.3 kb）に位置しており、水平遺伝子伝播の可能性が示唆されている（Trivedi et al., 2016）。 P. putida XWY-1 はカルバリル分解遺伝子の同様の配置を示しますが、これらの遺伝子はプラスミド上に位置しています (Zhu et al.、2019)。
微生物は、生化学レベルおよびゲノムレベルでの代謝効率に加えて、走化性、細胞表面修飾特性、区画化、優先的利用、バイオサーファクタント生成などの他の特性や反応も示し、汚染された環境における芳香族汚染物質をより効率的に代謝するのに役立ちます (図 7)。
図 7. 外来汚染化合物の効率的な生分解のための理想的な芳香族炭化水素分解細菌のさまざまな細胞応答戦略。
走化性反応は、不均一に汚染された生態系における有機汚染物質の分解を促進する要因であると考えられています。Grimmら（2002）は、シュードモナス属G7のナフタレンに対する走化性により、水系におけるナフタレン分解速度が上昇することを実証しました。野生型G7株は、走化性欠損変異株よりもはるかに速くナフタレンを分解しました。NahYタンパク質（膜トポロジーを持つ538アミノ酸）は、NAH7プラスミド上のメタ切断経路遺伝子と共転写されることが判明しており、走化性トランスデューサーと同様に、このタンパク質はナフタレン分解の化学受容体として機能すると考えられます（Grimm and Harwood 1997）。Hanselら（2009）による別の研究では、このタンパク質は走化性を示すものの、分解速度は速いことが示されました。 (2011) は、ガス状ナフタレンに対する Pseudomonas (P. putida) の走化性反応を実証しました。この反応では、気相拡散によって細胞へのナフタレンの定常流が生じ、これが細胞の走化性反応を制御しました。研究者らはこの走化性行動を利用して、分解速度を高める微生物を設計しました。研究により、化学感覚経路は細胞分裂、細胞周期調節、バイオフィルム形成など他の細胞機能も調節し、それによって分解速度の制御に役立つことが示されています。しかし、この特性 (走化性) を効率的な分解に利用することは、いくつかのボトルネックによって妨げられています。主なハードルは、(a) 異なるパラロガス受容体が同じ化合物/リガンドを認識すること、(b) 代替受容体の存在、すなわちエネルギー向性、(c) 同じ受容体ファミリーの感覚ドメインにおける配列の大幅な違いです。 (d) 主要な細菌センサータンパク質に関する情報不足（Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018）。芳香族炭化水素の生分解では、複数の代謝物／中間体が生成される場合があり、これらはあるグループの細菌には走化性を示すものの、他のグループの細菌には反発性を示す場合があり、プロセスをさらに複雑化させる。リガンド（芳香族炭化水素）と化学受容体との相互作用を同定するため、我々はPseudomonas putidaとEscherichia coliのセンサードメインとシグナル伝達ドメインを融合させたハイブリッドセンサータンパク質（PcaY、McfR、NahY）を構築した。これらのタンパク質は、それぞれ芳香族酸、TCA中間体、ナフタレンの受容体を標的とする（Luu et al., 2019）。
ナフタレンなどの多環芳香族炭化水素（PAH）の影響下では、細菌膜の構造と微生物の完全性は著しく変化します。研究によると、ナフタレンは疎水性相互作用を介してアシル鎖の相互作用を阻害し、膜の膨潤と流動性を高めることが示されています（Sikkema et al., 1995）。この有害な影響を打ち消すため、細菌はイソ型/アンテイソ型の分岐鎖脂肪酸の比率と脂肪酸組成を変化させ、シス型不飽和脂肪酸を対応するトランス型異性体に異性化することで、膜の流動性を調節します（Heipieper and de Bont, 1994）。ナフタレン処理で増殖したPseudomonas stutzeriでは、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比が1.1から2.1に増加したのに対し、Pseudomonas JS150ではこの比が7.5から12.0に増加した（Mrozik et al., 2004）。ナフタレンで増殖したAchromobacter KAs 3～5細胞は、ナフタレン結晶の周りに細胞凝集を示し、細胞表面電荷の減少（-22.5 mVから-2.5 mV）と細胞質凝縮および液胞化を伴い、細胞構造および細胞表面特性の変化を示した（Mohapatra et al., 2019）。細胞／表面の変化は芳香族汚染物質のより良い吸収に直接関連しているが、関連するバイオエンジニアリング戦略は十分に最適化されていない。細胞形状の操作が生物学的プロセスの最適化に使用されたことはほとんどない（Volke and Nikel, 2018）。細胞分裂に影響を及ぼす遺伝子の欠失は、細胞形態の変化を引き起こします。細胞分裂に影響を及ぼす遺伝子の欠失は、細胞形態の変化を引き起こします。枯草菌（Bacillus subtilis）において、細胞隔壁タンパク質SepFは隔壁形成に関与し、細胞分裂のその後の段階に必要であることが示されていますが、必須遺伝子ではありません。枯草菌においてペプチドグリカン加水分解酵素をコードする遺伝子を欠失させると、細胞の伸長、比増殖速度の上昇、酵素生産能の向上が見られました（Cui et al., 2018）。
カルバリル分解経路の区画化は、シュードモナス属細菌C5pp株およびC7株の効率的な分解を実現するために提案されている（Kamini et al., 2018）。カルバリルは外膜隔壁および／または拡散性ポリンを介してペリプラズム空間へ輸送されると考えられている。CHは、カルバリルをより安定で疎水性が高く、より毒性の高い1-ナフトールへと加水分解するペリプラズム酵素である。CHはペリプラズムに局在し、カルバリルに対する親和性が低いため、1-ナフトールの生成を制御し、細胞内への蓄積を防ぎ、細胞への毒性を低減する（Kamini et al., 2018）。得られた 1-ナフトールは、分配および/または拡散によって内膜を通過して細胞質に輸送され、その後、高親和性酵素 1NH によって 1,2-ジヒドロキシナフタレンにヒドロキシ化され、中心炭素経路でさらに代謝されます。
微生物は、異物炭素源を分解する遺伝的および代謝的能力を持っているが、その利用の階層構造（すなわち、単純な炭素源が複雑な炭素源よりも優先的に使用される）が、生分解の大きな障害となっている。単純な炭素源の存在と利用は、PAH などの複雑/非優先炭素源を分解する酵素をコードする遺伝子を下方制御する。よく研究されている例として、グルコースとラクトースを大腸菌に共給すると、グルコースがラクトースよりも効率的に利用されることがあげられる（Jacob and Monod, 1965）。Pseudomonas は、さまざまな PAH や異物化合物を炭素源として分解することが報告されている。Pseudomonas における炭素源利用の階層は、有機酸 > グルコース > 芳香族化合物である（Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996）。しかし、例外がある。興味深いことに、Pseudomonas sp. CSV86は、グルコースよりも芳香族炭化水素（安息香酸、ナフタレンなど）を優先的に利用し、芳香族炭化水素を有機酸と共代謝する独特の階層構造を示す（Basu et al., 2006）。この細菌では、グルコースや有機酸などの第二の炭素源が存在しても、芳香族炭化水素の分解および輸送に関する遺伝子の発現が低下しない。グルコースおよび芳香族炭化水素培地で培養すると、グルコース輸送および代謝に関する遺伝子の発現が低下し、第一対数増殖期に芳香族炭化水素が、第二対数増殖期にグルコースが利用されることが観察された（Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017）。一方、有機酸の存在は芳香族炭化水素代謝の発現に影響を与えなかったため、この細菌は生分解研究の候補株となることが期待される（Phale et al., 2020）。
炭化水素の生体内変換は、微生物において酸化ストレスと抗酸化酵素の活性化を引き起こすことがよく知られています。定常期細胞内および毒性化合物存在下におけるナフタレンの分解が不十分な場合、活性酸素種（ROS）の生成につながります（Kang et al. 2006）。ナフタレン分解酵素は鉄硫黄クラスターを含むため、酸化ストレス下ではヘムおよび鉄硫黄タンパク質中の鉄が酸化され、タンパク質の不活性化につながります。フェレドキシン-NADP+還元酵素（Fpr）は、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）とともに、NADP+/NADPHとフェレドキシンまたはフラボドキシン2分子との間の可逆的な酸化還元反応を媒介し、酸化ストレス下でROSを除去し、鉄硫黄中心を修復します（Li et al. 2006）。 Pseudomonas属細菌において、FprとSodA（SOD）はともに酸化ストレスによって誘導されることが報告されており、ナフタレン添加条件下での増殖中に4種類のPseudomonas株（O1、W1、As1、G1）においてSODおよびカタラーゼ活性の上昇が観察された（Kang et al., 2006）。研究では、アスコルビン酸や第一鉄（Fe2+）などの抗酸化物質を添加すると、ナフタレンの増殖速度が上昇することが示されています。Rhodococcus erythropolisをナフタレン培地で増殖させたところ、sodA（Fe/Mnスーパーオキシドディスムターゼ）、sodC（Cu/Znスーパーオキシドディスムターゼ）、recAなどの酸化ストレス関連シトクロムP450遺伝子の転写が増加しました（Sazykin et al., 2019）。ナフタレンで培養されたシュードモナス細胞の比較定量的プロテオーム解析により、酸化ストレス反応に関連するさまざまなタンパク質の上方制御がストレス対処戦略であることが示されました (Herbst et al.、2013)。
微生物は疎水性炭素源の作用を受けてバイオサーファクタントを産生することが報告されています。これらの界面活性剤は両親媒性界面活性化合物であり、油水界面または気水界面で凝集体を形成します。これにより擬似可溶化が促進され、芳香族炭化水素の吸着が促進され、効率的な生分解が促進されます（Rahman et al., 2002）。これらの特性から、バイオサーファクタントは様々な産業で広く利用されています。化学界面活性剤またはバイオサーファクタントを細菌培養物に添加することで、炭化水素の分解効率と分解速度を向上させることができます。バイオサーファクタントの中でも、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が産生するラムノリピドは、広く研究され、その特性が明らかにされています（Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002）。さらに、他の種類のバイオサーファクタントとしては、リポペプチド（Pseudomonas fluorescens由来のムチン）、乳化剤378（Pseudomonas fluorescens由来）（Rosenberg and Ron, 1999）、ロドコッカス由来のトレハロース二糖脂質（Ramdahl, 1985）、バチルス由来のリケニン（Saraswathy and Hallberg, 2002）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）（Siegmund and Wagner, 1991）およびバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来の界面活性剤（Zhi et al., 2017）などがあります。これらの強力な界面活性剤は、表面張力を72 dynes/cmから30 dynes/cm未満に低下させ、炭化水素の吸収を向上させることが示されています。 Pseudomonas、Bacillus、Rhodococcus、Burkholderiaなどの細菌種は、ナフタレンやメチルナフタレン培地で増殖すると、さまざまなラムノリピドや糖脂質ベースのバイオサーファクタントを生産できることが報告されています（Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005）。Pseudomonas maltophilia CSV89は、ナフトエ酸などの芳香族化合物で増殖すると、細胞外バイオサーファクタントBiosur-Pmを生産できます（Phale et al., 1995）。Biosur-Pm形成の速度論は、その合成が増殖およびpH依存プロセスであることを示しています。中性pHでの細胞によるBiosur-Pm生産量は、pH 8.5での生産量よりも高いことがわかりました。pH 8.5で増殖した細胞は、pH 7.0で増殖した細胞よりも疎水性が高く、芳香族化合物と脂肪族化合物に対する親和性が高かったです。 Rhodococcus spp. N6では、高い炭素対窒素（C:N）比と鉄制限が細胞外バイオサーファクタントの生産に最適な条件です（Mutalik et al., 2008）。株と発酵を最適化することでバイオサーファクタント（サーファクチン）の生合成を改善する試みがなされてきました。しかし、培養培地中のサーファクタントの力価が低い（1.0 g/L）ため、大規模生産には課題があります（Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019）。そのため、遺伝子工学的手法を用いてその生合成を改善してきました。しかし、オペロンのサイズが大きい（∼25 kb）ことと、クオラムセンシングシステムの生合成制御が複雑なため、その工学的改変は困難です（Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019）。バチルス属細菌において、サーファクチン産生量の増加を目的とした遺伝子工学的改変が数多く行われてきました。主な目的は、プロモーター（srfAオペロン）の置換、サーファクチン輸出タンパク質YerPの過剰発現、そして調節因子ComXおよびPhrCの過剰発現です（Jiao et al., 2017）。しかし、これらの遺伝子工学的手法では、1つあるいは少数の遺伝子改変しか達成されておらず、商業生産には至っていません。そのため、知識に基づく最適化手法のさらなる研究が必要です。
PAHの生分解研究は主に標準的な実験室条件下で行われています。しかし、汚染された場所や汚染された環境では、多くの非生物的および生物的要因（温度、pH、酸素、栄養素の利用可能性、基質の生物学的利用能、その他の生体異物、最終生成物の阻害など）が微生物の分解能力を変化させ、影響を与えることが示されています。
温度はPAHの生分解に大きな影響を与えます。温度が上昇すると溶存酸素濃度が低下し、好気性微生物の代謝に影響を与えます。好気性微生物は、水酸化反応や環開裂反応を行うオキシゲナーゼの基質の一つとして分子状酸素を必要とするためです。温度上昇はPAHの親化合物をより毒性の高い化合物に変換し、生分解を阻害することがしばしば指摘されています（Muller et al., 1998）。
PAH汚染地の多くは、酸性鉱山排水汚染地（pH 1～4）やアルカリ性浸出液汚染地（pH 8～12）など、極端なpH値を示すことが指摘されています。これらの条件は、生分解プロセスに深刻な影響を及ぼす可能性があります。そのため、微生物を用いたバイオレメディエーションを行う前に、適切な化学物質（酸化還元電位が中程度から非常に低いもの）を添加してpHを調整することが推奨されます。例えば、アルカリ性土壌の場合は硫酸アンモニウムや硝酸アンモニウム、酸性土壌の場合は炭酸カルシウムや炭酸マグネシウムなどの石灰施用が挙げられます（Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020）。
PAHの生分解における律速因子は、汚染地域への酸素供給です。環境の酸化還元状態により、原位置バイオレメディエーションプロセスでは通常、外部からの酸素供給（耕起、空気散布、化学物質の添加）が必要となります（Pardieckら、1992年）。Odenkranzら（1996年）は、汚染された帯水層に過酸化マグネシウム（酸素放出化合物）を添加することで、BTEX化合物を効果的にバイオレメディエーションできることを実証しました。別の研究では、硝酸ナトリウムを注入し、抽出井戸を建設することで、汚染された帯水層におけるフェノールとBTEXの原位置分解を調査し、効果的なバイオレメディエーションを実現しました（BewleyとWebb、2001年）。