現住所：ドイツ、ケルン 50931、ケルン・エクセレンス・クラスター「加齢関連疾患における細胞ストレス応答の研究」（CECAD）。
ミトコンドリア病による神経変性は、ニューロンの代謝可塑性が限られているため不可逆的であると考えられているが、体内のニューロン代謝の細胞自律性に対するミトコンドリア機能不全の影響は十分に理解されていない。本研究では、ミトコンドリア融合ダイナミクスの障害によって引き起こされる進行性のOXPHOS欠損を有するプルキンエニューロンの細胞特異的プロテオームを紹介する。ミトコンドリア機能不全はプロテオミクスの分野に大きな変化をもたらし、最終的には細胞死の前に精密な代謝プログラムの連続的な活性化につながることがわかった。予想外にも、ピルビン酸カルボキシラーゼ（PCx）およびTCAサイクルの中間体を補う他の抗老化酵素の明らかな誘導が確認された。PCxの阻害は酸化ストレスと神経変性を悪化させ、アテローム性動脈硬化症がOXPHOSを欠くニューロンに対して保護効果を持つことを示唆している。末期変性した神経細胞におけるミトコンドリア融合の回復は、これらの代謝特性を完全に逆転させ、細胞死を防ぐ。我々の研究結果は、ミトコンドリア機能不全に対する耐性を与えるこれまで知られていなかった経路を明らかにし、神経変性が疾患の末期段階であっても逆転可能であることを示している。
神経細胞のエネルギー代謝の維持におけるミトコンドリアの中心的な役割は、ヒトのミトコンドリア病に伴う広範な神経学的症状によって強調されている。これらの疾患のほとんどは、ミトコンドリア遺伝子発現を調節する遺伝子変異（1、2）またはミトコンドリアダイナミクスに関連する遺伝子破壊によって引き起こされ、間接的にミトコンドリアDNA（mtDNA）の安定性に影響を与える（3、4）。動物モデルを用いた研究では、周囲組織のミトコンドリア機能不全に応答して、保存的代謝経路（5-7）が活性化されることが示されており、これはこれらの複雑な疾患の病因を深く理解するための重要な情報を提供する。対照的に、脳ミトコンドリアのアデノシン三リン酸（ATP）産生の全般的な不全によって引き起こされる特定の細胞型の代謝変化についての理解は基礎的であり（8）、疾患の予防または神経変性の予防に使用できる治療標的を特定する必要性を強調している（9）。情報が不足しているのは、神経細胞は周囲の組織の細胞型に比べて代謝の柔軟性が非常に限られていると広く考えられているためである（10）。これらの細胞は、シナプス伝達を促進し、損傷や疾患状態に対応するためにニューロンへの代謝物の供給を調整する上で中心的な役割を果たしていることを考えると、脳組織の厳しい条件に細胞代謝を適応させる能力は、ほぼグリア細胞に限られている（11-14）。さらに、脳組織の固有の細胞の不均一性は、特定のニューロンサブグループで発生する代謝変化の研究を大きく妨げている。その結果、ニューロンにおけるミトコンドリア機能不全の正確な細胞的および代謝的影響についてはほとんどわかっていない。
ミトコンドリア機能不全の代謝的影響を理解するために、ミトコンドリア外膜融合（Mfn2）の破壊によって引き起こされる神経変性のさまざまな段階にあるプルキンエニューロン（PN）を分離しました。ヒトのMfn2変異は、シャルコー・マリー・トゥース病2A型（15）として知られる遺伝性運動感覚ニューロパチーの一種と関連していますが、マウスにおけるMfn2の条件付き破壊は、酸化リン酸化（OXPHOS）機能不全の誘導法としてよく知られています。さまざまなニューロンサブタイプ（16-19）と結果として生じる神経変性表現型には、運動障害（18、19）や小脳失調症（16）などの進行性の神経学的症状が伴います。ラベルフリー定量（LFQ）プロテオミクス、メタボロミクス、イメージング、およびウイルス学的方法を組み合わせることにより、進行性神経変性がピルビン酸カルボキシラーゼ（PCx）および生体内のPNの動脈硬化に関与する他の因子を強く誘導することを示しました。酵素の発現。この発見の関連性を確認するために、Mfn2欠損PNでPCxの発現を特異的にダウンレギュレーションしたところ、この操作により酸化ストレスが悪化し、神経変性が加速され、無精子症が細胞死をもたらすことが証明されました。代謝適応性。MFN2の重度の発現は、重度のOXPHOS欠損、大量のミトコンドリアDNA消費、および明らかに壊れたミトコンドリアネットワークを伴う末期変性PNを完全に救済することができ、この形態の神経変性は細胞死​​前の疾患の進行段階でも回復できることをさらに強調しています。
Mfn2ノックアウトPNにおけるミトコンドリアを可視化するために、Cre依存性ミトコンドリアが黄色蛍光タンパク質（YFP）（mtYFP）（20）Cre発現を標的とするマウス系統を使用し、生体内でミトコンドリアの形態を調べた。PNにおけるMfn2遺伝子の破壊はミトコンドリアネットワークの段階的な分裂につながることがわかり（図S1A）、最も早い変化は生後3週齢で見られた。対照的に、カルビンジン免疫染色の消失によって示されるPN細胞層の著しい変性は、生後12週齢まで始まらなかった（図1、AおよびB）。ミトコンドリア形態の最も早い変化と神経細胞死の目に見える開始時期のずれから、細胞死の前にミトコンドリア機能不全によって引き起こされる代謝変化を調査することにした。我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）に基づく戦略を開発し、YFP（YFP+）を発現するPNを分離した（図1C）。対照マウス（Mfn2+/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre）では、以下CTRLと呼ぶ（図S1B）。YFPシグナルの相対強度に基づくゲーティング戦略の最適化により、PNのYFP+ボディ（YFPhigh）を非PN（YFPneg）（図S1B）または推定蛍光軸索/樹状突起断片（YFPlow；図S1D、左）から精製することができ、共焦点顕微鏡で確認した（図S1D、右）。分類された集団の同一性を確認するために、LFQプロテオミクスと主成分分析を実施し、YFPhigh細胞とYFPneg細胞の間に明確な分離があることを発見した（図S1C）。 YFPhigh細胞は既知のPNマーカー（Calb1、Pcp2、Grid2、Itpr3など）の純増を示したが（21、22）、ニューロンや他の細胞型で一般的に発現するタンパク質の増増は見られなかった（図1D）。独立した実験で収集された分類済みYFPhigh細胞のサンプル間の比較では相関係数>0.9を示し、生物学的複製間の良好な再現性を示した（図S1E）。要約すると、これらのデータは、実行可能なPNの急性かつ特異的な分離に関する我々の計画を検証した。使用したL7-creドライバーシステムは、投与後最初の週にモザイク組換えを誘導するため（23）、CTRLおよび条件付き（Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre）マウスからニューロンを選別し始めた。組換えが完了したら、4週齢でMfn2cKOと呼ぶ。終点として、明らかなミトコンドリアの断片化にもかかわらずPN層が無傷である8週齢を選択しました（図1Bおよび図S1A）。合計で3013個のタンパク質を定量し、そのうち約22%はミトコンドリアプロテオームに基づくMitoCarta 2.0の注釈に基づいてミトコンドリアとして分類されました（図1E）（図1E）（24）。8週目に実施した遺伝子発現差解析では、全タンパク質の10.5%のみが有意な変化を示し（図1Fおよび図S1F）、そのうち195個のタンパク質が下方制御され、120個のタンパク質が上方制御されました（図1F）。このデータセットの「革新的な経路解析」では、差次的に発現した遺伝子は主に特定の代謝経路の限られたセットに属していることが示されています（図1G）。興味深いことに、OXPHOSおよびカルシウムシグナル伝達に関連する経路のダウンレギュレーションは、融合欠損PNにおけるミトコンドリア機能不全の誘導を裏付けていますが、主にアミノ酸代謝に関与する他のカテゴリーは有意にアップレギュレーションされており、これはミトコンドリアPNの再配線で起こる代謝と一致しています。
(A) CTRL マウスと Mfn2cKO マウスの小脳切片の代表的な共焦点写真。PN (カルビンジン、灰色) の進行性喪失を示している。核は DAPI で対比染色した。(B) (A) の定量化 (一元配置分散分析、***P<0.001; n = 3 匹のマウスからの 4 ～ 6 つの円)。(C) 実験ワークフロー。(D) プルキンエ細胞 (上) およびその他の細胞型 (中) に特異的なマーカーのヒートマップ分布。(E) 分類された PN で同定されたミトコンドリアタンパク質の数を示すベン図。(F) 8 週間の Mfn2cKO ニューロンにおける差次的発現タンパク質のボルケーノプロット (有意性カットオフ値 1.3)。(G) 創造性経路分析は、8 週間に分類された Mfn2cKO PN における 5 つの最も重要なアップレギュレーション (赤) およびダウンレギュレーション (青) 経路を示している。検出された各タンパク質の平均発現レベルを示します。グレースケールヒートマップ：調整済みP値。ns：有意差なし。
プロテオミクスデータによると、複合体I、III、IVのタンパク質発現は徐々に減少した。複合体I、III、IVはすべて必須のmtDNAコードサブユニットを含んでいたが、核コードのみの複合体IIは基本的に影響を受けなかった（図2Aおよび図S2A）。プロテオミクスの結果と一致して、小脳組織切片の免疫組織化学では、PNにおける複合体IVのMTCO1（ミトコンドリアシトクロムcオキシダーゼサブユニット1）サブユニットレベルが徐々に減少したことが示された（図2B）。mtDNAコードサブユニットMtatp8は有意に減少したが（図S2A）、核コードATPシンターゼサブユニットの定常状態レベルは変化せず、これはmtDNA発現が安定しているときに既知の安定したATPシンターゼサブアセンブリF1複合体の形成と一致している。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）による選別されたMfn2cKO PNのmtDNAレベルの評価により、mtDNAコピー数の段階的な減少が確認された。対照群と比較して、8週齢ではmtDNAレベルの約20%しか保持されていなかった（図2C）。これらの結果と一致して、Mfn2cKO PNの共焦点顕微鏡染色を用いてDNAを検出したところ、ミトコンドリアヌクレオチドの時間依存的な消費が示された（図2D）。ミトコンドリアタンパク質分解とストレス応答に関与する候補のうち、Lonp1、Afg3l2、Clpx、およびOXPHOS複合体アセンブリ因子を含む一部のみの発現が上昇していることがわかった。アポトーシスに関与するタンパク質のレベルに有意な変化は検出されなかった（図S2B）。同様に、カルシウム輸送に関与するミトコンドリアおよび小胞体チャネルにもわずかな変化しか見られなかった（図S2C）。さらに、オートファジー関連タンパク質の評価では有意な変化は見られず、これは免疫組織化学および電子顕微鏡で観察された生体内でのオートファゴソームの目に見える誘導と一致している（図S3）。しかし、PNにおける進行性のOXPHOS機能不全は、明らかなミトコンドリアの超微細構造変化を伴う。5週齢および8週齢のMfn2cKO PNの細胞体および樹状突起にはミトコンドリアクラスターが見られ、内膜構造は著しい変化を遂げている（図S4、AおよびB）。これらの超微細構造変化およびmtDNAの有意な減少と一致して、テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）を用いた急性脳小脳切片の解析では、Mfn2cKO PNのミトコンドリア膜電位が有意に低下していることが示された（図S4C）。
(A) OXPHOS複合体の発現レベルの時間経過分析。8週目にP<0.05のタンパク質のみを考慮する（二元配置分散分析）。点線：CTRLと比較して調整なし。(B) 左：抗MTCO1抗体で標識した小脳切片の例（スケールバー、20μm）。プルキンエ細胞体が存在する領域は黄色で覆われている。右：MTCO1レベルの定量化（一元配置分散分析、n = 7～20個の細胞を3匹のマウスから分析）。(C) 選別したPNにおけるmtDNAコピー数のqPCR分析（一元配置分散分析、n = 3～7匹のマウス）。(D) 左：抗DNA抗体で標識した小脳切片の例（スケールバー、20μm）。プルキンエ細胞体が存在する領域は黄色で覆われている。右: mtDNA 損傷の定量化 (一元配置分散分析; n = 3 匹のマウスから 5 ～ 9 個の細胞)。 (E) 全細胞パッチクランプ記録で mitoYFP + プルキンエ細胞 (矢印) を示す急性小脳切片の例。 (F) IV 曲線の定量化。 (G) CTRL および Mfn2cKO プルキンエ細胞への脱分極電流注入の代表的な記録。上段のトレース: AP を誘発した最初のパルス。下段のトレース: 最大 AP 頻度。 (H) シナプス後自発入力 (sPSP) の定量化。代表的な記録トレースとその拡大率は (I) に示されている。一元配置分散分析は、3 匹のマウスから n = 5 ～ 20 個の細胞を解析した。データは平均±SEM で表す。*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。 （J）パーフォレーテッドパッチクランプモードを使用して記録された自発性活動電位の代表的なトレース。上段のトレース：最大活動電位頻度。下段のトレース：単一の活動電位の拡大図。（K）（J）に従って平均および最大活動電位頻度を定量化する。マン・ホイットニー検定。n = 5個の細胞を4匹のマウスから分析した。データは平均±SEMで表す。重要ではない。
8週齢のMfn2cKO PNでは明らかなOXPHOS障害が検出され、ニューロンの生理機能が著しく異常であることが示された。そこで、急性小脳スライスでホールセルパッチクランプ記録を行い、4～5週齢および7～8週齢のOXPHOS欠損ニューロンの受動電気特性を解析した（図2E）。意外なことに、Mfn2cKOニューロンの平均静止膜電位と入力抵抗は、細胞間にわずかな違いはあったものの、コントロールと同様であった（表1）。同様に、4～5週齢では、電流-電圧関係（IV曲線）に有意な変化は見られなかった（図2F）。しかし、7～8週齢のMfn2cKOニューロンはIVレジメン（過分極ステップ）に耐えられず、この後期段階では過分極電位に対する明らかな感受性があることが示された。対照的に、Mfn2cKO ニューロンでは、反復的な活動電位 (AP) 放電を引き起こす脱分極電流はよく許容され、全体的な放電パターンは 8 週間齢のコントロール ニューロンのものと有意に異ならないことが示された (表 1 および図 2G)。同様に、自発性シナプス後電流 (sPSC) の頻度と振幅はコントロール群と同程度であり、イベントの頻度は 4 週間から 5 週間、7 週間、8 週間へと同様の増加で増加した (図 2、H および I)。PN におけるシナプス成熟期間 (25)。穿孔 PN パッチ後も同様の結果が得られた。この構成は、ホールセル パッチ クランプ記録で起こりうる細胞 ATP 欠陥の補償を防止します。特に、Mfn2cKO ニューロンの静止膜電位と自発発火頻度は影響を受けなかった (図 2、J および K)。要約すると、これらの結果は、明らかなOXPHOS機能障害を持つPNが高周波放電パターンにうまく対処できることを示しており、ほぼ正常な電気生理学的応答を維持することを可能にする補償メカニズムが存在することを示唆している。
データは平均値±標準誤差（一元配置分散分析、Holm-Sidakの多重比較検定；*P<0.05）で表す。単位数は括弧で示す。
我々は、プロテオミクスデータセット（図1G）のいずれかのカテゴリーに、重度のOXPHOS欠乏に対抗できる経路が含まれているかどうかを調査し、それによって影響を受けたPNがほぼ正常な電気生理学を維持できる理由を説明できるかどうかを検討した（図2、E～K）。プロテオミクス解析では、分岐鎖アミノ酸（BCAA）の異化に関与する酵素が有意に上方制御されていることが示され（図3Aおよび図S5A）、最終産物であるアセチルCoA（CoA）またはスクシニルCoAは、動脈硬化のTCAサイクルでトリカルボン酸を補うことができる。BCAAトランスアミナーゼ1（BCAT1）とBCAT2の両方の含有量が増加していることがわかった。これらは、α-ケトグルタル酸からグルタミン酸を生成することによって、BCAA異化の最初のステップを触媒する（26）。分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（BCKD）複合体を構成するすべてのサブユニットが上方制御されている（この複合体は、結果として生じるBCAA炭素骨格のその後の不可逆的な脱炭酸を触媒する）（図3Aおよび図S5A）。しかし、選別されたPNではBCAA自体に明らかな変化は見られなかった。これは、これらの必須アミノ酸の細胞内取り込みの増加、またはTCAサイクルを補うための他の供給源（グルコースまたは乳酸）の使用によるものと考えられる（図S5B）。OXPHOSを欠くPNは、8週齢でグルタミン分解およびトランスアミノ化活性の増加も示しており、これはミトコンドリア酵素グルタミナーゼ（GLS）およびグルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ2（GPT2）の上方制御によって反映される（図3、AおよびC）。 GLSのアップレギュレーションはスプライシングされたアイソフォームのグルタミナーゼC（GLS-GAC）に限定されていること（Mfn2cKO/CTRLの変化は約4.5倍、P = 0.05）と、癌組織におけるその特異的なアップレギュレーションがミトコンドリアの生体エネルギーをサポートする可能性があることは注目に値する。（27）。
(A) ヒートマップは、8 週間の特定の経路におけるタンパク質レベルの倍率変化を示しています。(B) 抗 PCx 抗体で標識した小脳スライスの例 (スケールバー、20 μm)。黄色の矢印はプルキンエ細胞体を示しています。(C) アテローム性動脈硬化症の重要な候補として特定されたタンパク質発現の時間経過分析 (多重 t 検定、*FDR <5%、n = 3-5 匹のマウス)。(D) 上: [1-13C]ピルビン酸トレーサーに含まれる標識炭素のさまざまな進入方法 (すなわち、PDH 経由または動脈経由) を示す模式図。下: バイオリンチャートは、[1-13C]ピルビン酸で急性小脳スライスを標識した後、アスパラギン酸、クエン酸、リンゴ酸に変換された単一標識炭素 (M1) の割合を示しています (対応のある t 検定、** P <0.01)。(E) 示された経路の包括的な時間履歴分析。 8週目の時点でP<0.05のタンパク質のみを考慮する。破線：調整値なし（二元配置分散分析；* P<0.05；*** P<0.001）。データは平均値±標準誤差で表す。
我々の分析では、BCAA異化が主要なアップレギュレーション経路の1つとなった。この事実は、OXPHOSを欠くPNではTCAサイクルに入る換気量が変化する可能性があることを強く示唆している。これは、重度のOXPHOS機能不全の維持中に神経生理学と生存に直接影響を与える可能性のある、神経代謝再配線の主要な形態を表している可能性がある。この仮説と一致して、主要な抗動脈硬化酵素PCxがアップレギュレーションされていることがわかった（Mfn2cKO/CTRLは約1.5倍に変化、図3A）。PCxはピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する反応を触媒する（28）。脳組織では、その発現はアストロサイトに限定されていると考えられている（29、30）。プロテオミクスの結果と一致して、共焦点顕微鏡観察では、PCxの発現がOXPHOS欠損PNで特異的かつ有意に増加していることが示された一方、PCxの反応性は主にコントロールの隣接するベルクマン神経膠細胞に限定されていた（図3B）。観察されたPCxのアップレギュレーションを機能的にテストするために、急性小脳スライスを[1-13C]ピルビン酸トレーサーで処理した。ピルビン酸がピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）によって酸化されると、その同位体標識は消失するが、ピルビン酸が血管反応によって代謝されるとTCAサイクル中間体に組み込まれる（図3D）。プロテオミクスデータを支持するように、Mfn2cKOスライスのアスパラギン酸にこのトレーサー由来の多数のマーカーが観察され、クエン酸とリンゴ酸も有意ではないものの、中程度の傾向を示した（図3D）。
ミトコンドリア転写因子A遺伝子（Tfam）を特異的に破壊することによってミトコンドリア機能障害を引き起こしたMitoParkマウスのドーパミンニューロンでは、PCx発現も有意に上方制御されており（31）、アセトン酸動脈硬化症の発生は、体内の神経OXPHOSの機能障害中に制御されていることが示唆される。動脈硬化症に関連する可能性のあるニューロンで発現する可能性のある特異的な酵素（32-34）が、OXPHOSを欠くPNで有意に上方制御されていることがわかっていることは注目に値する。例えば、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ（PCC-A）、プロピオニルCoAをスクシニルCoAに変換するマロニルCoA、およびリンゴ酸からピルビン酸を回収することを主な役割とするミトコンドリアリンゴ酸酵素3（ME3）などである（図3、AおよびC）（33、35）。さらに、PDHをリン酸化して不活性化するPdk3酵素の有意な増加が見られたが（36）、PDHを活性化するPdp1酵素やPDH酵素複合体自体には変化は検出されなかった（図3A）。 Mern2cKO PNでは一貫して、PDH複合体のピルビン酸デヒドロゲナーゼE1成分のα1サブユニットα（PDHE1α）サブユニットのSer293（PDHの酵素活性を阻害することが知られている）のリン酸化が増強されていた（図S6C）。ピルビン酸は血管にアクセスできない。
最後に、報告によると、活性化プロセス中に、セリンとグリシンの生合成のスーパーパスウェイ、関連するミトコンドリア葉酸（1C）サイクル、およびプロリン生合成（図1Gおよび図S5C）がすべて有意に上方制御されていることがわかりました。周囲の組織はミトコンドリア機能不全（5-7）で活性化されます。これらのプロテオミクスデータを裏付ける共焦点分析では、OXPHOSが欠損したPNでは、8週齢マウスの小脳スライスにミトコンドリア葉酸サイクルのキー酵素であるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ2（SHMT2）を投与しました。有意な免疫応答（図S5D）。 13 CU-グルコースで培養した急性小脳スライスにおいて、代謝トレーシング実験により、セリンとプロリンの生合成のアップレギュレーションがさらに確認され、炭素アイソフォームのセリンとプロリンへの流入が増加したことが示された（図S5E）。GLSとGPT2によって促進される反応は、グルタミンからグルタミン酸を合成し、グルタミン酸とα-ケトグルタル酸の間でトランスアミノ化を行うため、これらのアップレギュレーションは、OXPHOS欠損ニューロンがグルタミン酸に対する需要が増加していることを示しており、これはプロリンの生合成の増加を維持することを目的としている可能性がある（図S5C）。これらの変化とは対照的に、PN特異的Mfn2cKOマウスの小脳アストロサイトのプロテオミクス解析では、これらの経路（すべての抗ペルオキシダーゼを含む）の発現に有意な変化が見られなかったことから、この代謝方向転換は分解されたPNに選択的であることが示された（図S6、D～G）。
要約すると、これらの解析により、PNにおける特定の代謝経路の時間的活性化のパターンが大きく異なることが明らかになった。神経細胞のミトコンドリア機能異常は、早期のアテローム性動脈硬化症や1Cリモデリング（図3Eおよび図S5C）、さらにはIおよびIV複合体の発現の予測可能な変化につながる可能性があるが、セリンde novo合成の変化は後期になって初めて明らかになった。OXPHOS機能不全（図3Eおよび図S5C）。これらの知見は、ストレス誘発性のミトコンドリア（1Cサイクル）および細胞質（セリン生合成）の応答が、TCAサイクルのアテローム性動脈硬化症の増加と相乗的に作用して神経細胞の代謝を再構築する一連のプロセスを定義する。
8週齢のOXPHOS欠損PNは、高頻度の興奮活動を維持し、ミトコンドリア機能不全を補うために顕著な代謝再接続を受けることができる。この発見は、この時点でもこれらの細胞が神経変性を遅らせたり予防したりするための治療介入を受ける可能性があるという興味深い可能性を提起する。我々は、2つの独立した介入によってこの可能性を解決した。最初の方法では、MFN2がin vivoでOXPHOS欠損PNに選択的に発現できるように、Cre依存性アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを設計した（図S7A）。MFN2と蛍光レポーター遺伝子mCherryをコードするAAV（Mfn2-AAV）は、in vitroの初代神経細胞培養で検証され、MFN2がCre依存的に発現し、ミトコンドリアの形態が回復し、それによってMfn2cKOニューロンの神経変異が防止された（図S7、B、D、E）。次に、8週齢のMfn2-AAVをMfn2cKOマウスと対照マウスの小脳皮質に定位的に送達する生体内実験を行い、12週齢のマウスを解析した（図4A）。処理したMfn2cKOマウスは死亡した（図1、AおよびB）（16）。生体内でのウイルス形質導入により、小脳の一部の円でPNの選択的発現が生じた（図S7、GおよびH）。mCherryのみを発現する対照AAV（Ctrl-AAV）の注入は、Mfn2cKO動物の神経変性の程度に有意な影響を与えなかった。対照的に、Mfn2-AAVで形質導入したMfn2cKOの解析では、PN細胞層の有意な保護効果が示された（図4、BおよびC）。特に、ニューロン密度は対照動物とほとんど区別がつかないようである（図4、BおよびC、および図S7、HおよびI）。 MFN1の発現はMFN2の発現と同程度に神経細胞死の抑制に効果的であるが、MFN2の発現はそうではない（図4Cおよび図S7、CおよびF）。これは、異所性MFN1の発現がMFN2の欠損を効果的に補うことができることを示している。単一PNレベルでのさらなる解析では、Mfn2-AAVがミトコンドリアの超微細構造を大幅に回復させ、mtDNAレベルを正常化し、抗血管新生マーカーPCxの高発現を逆転させたことが示された（図4、C～E）。回復したMfn2cKOマウスを安静状態で視覚的に観察したところ、姿勢および運動症状（運動S1～S3）が改善されていることがわかった。結論として、これらの実験は、OXPHOSが著しく欠乏したPNへのMFN2の遅延再導入がmtDNA消費を逆転させ、アテローム性動脈硬化を誘導するのに十分であり、それによって生体内での軸索変性および神経細胞死を予防できることを示している。
(A) 示された代謝経路が活性化されたときに MFN2 をコードする AAV を注入する実験スケジュールを示す図。(B) Mfn2cKO マウスで 8 週間目に形質導入され、抗カルビンジン抗体で標識された 12 週間齢の小脳スライスの代表的な共焦点画像。右: 軸索線維のスケール。軸索ズームのスケールは 450 および 75 μm です。(C) 左: AAV 形質導入ループ (AAV+) のプルキンエ細胞密度の定量化 (一元配置分散分析; n = 3 匹のマウス)。右: 12 週間目の形質導入された PN の mtDNA フォーカス分析 (対応のない t 検定; n = 3 匹のマウスからの 6 個の細胞)。* P <0.05; ** P <0.01。(D) 示されたウイルスベクターで形質導入された Mfn2cKO 小脳切片の PN の代表的な透過型電子顕微鏡写真。ピンク色のマスクは樹状突起が占める領域を示し、黄色の点線四角は右側に拡大表示した領域を示しています。nは核を表します。スケールバーは1μmです。(E)は、12週目に形質導入されたPNにおけるPCx染色の例を示しています。スケールバーは20μmです。OEは過剰発現、FCは倍率変化です。
最後に、OXPHOS機能不全を経験したPNにおけるペルオキシダーゼ誘導性細胞生存の重要性を調査した。マウスPCx mRNAを特異的に標的とするAAV-shRNA（ショートヘアピンRNA）をコードするmCherry（AAV-shPCx）を作製し、そのウイルスまたはそのスクランブルコントロール（AAV-scr）をMfn2cKOマウスの小脳に注入した。注入は、PCx発現が増加し（図3C）、PN細胞層がまだ無傷である期間（図1A）に効果的なPCxノックダウンを達成するために、生後4週目に実施した（図5A）。注目すべきは、PCxのノックダウン（図S8A）によりPN死が著しく加速され、これは感染したリングに限られることである（図5、BおよびC）。 PCxアップレギュレーションによって誘発される代謝効果のメカニズムを理解するために、PCxノックダウン後のPNの酸化還元状態を調べ、AAV媒介光バイオセンサーGrx1-roGFP2を同時に発現させてグルタチオンペプチド酸化還元電位の相対変化を評価した（図S8、B～D）。次に、FLIM条件を確認した後、7週齢のMfn2cKOまたは対照同腹仔の急性脳切片で二光子蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）を実施し、細胞質酸化還元状態の潜在的な変化を検出した（図S8、E～G）。解析の結果、PCx発現を欠く単一のMfn2cKO PNの酸化状態が有意に増加していることが示され、これは対照ニューロンまたはスクランブルshRNAのみを発現するMfn2cKO PNとは異なっていた（図5、DおよびE）。 PCxの発現が抑制されると、高度に酸化された状態を示すMfn2cKO PNの割合が3倍以上に増加した（図5E）。これは、PCxの発現亢進が変性したニューロンの酸化還元能力を維持していることを示している。
(A) 示された代謝経路が活性化されたときに shPCx をコードする AAV を注入する実験スケジュールを示す図。(B) 4 週間目に抗カルシニューリン抗体で標識され、形質導入された Mfn2cKO マウスの 8 週間齢の小脳切片の代表的な共焦点写真。スケールバー、450μm。(C) AAV 形質導入ループのプルキンエ細胞密度の定量化 (一元配置分散分析; n = 3 ～ 4 匹のマウス)。データは平均±SEM で表す; ***P<0.001。(D) 指定された実験条件下でグルタチオン酸化還元センサー Grx1-roGFP2 を発現する 7 週間齢の PN の平均寿命を示す代表的な FLIM 画像。LUT (ルックアップテーブル) 比: 生存時間間隔 (ピコ秒)。スケールバー、25μm。 （E）ヒストグラムは、（D）のGrx1-roGFP2寿命値の分布を示しています（各条件下で2匹のマウスのn=158～368細胞）。各ヒストグラムの上にある円グラフは、CTRL-AAV-scrの平均寿命値の1標準偏差を超える、有意に長い（赤、酸化）または短い（青、減少）寿命値を持つ細胞の数を示しています。（F）提案されたモデルは、神経PCxのアップレギュレーションの保護効果を示しています。
総じて、ここで提供するデータは、MFN2の再発現が、重度のOXPHOS欠損、重度のmtDNA枯渇、および極めて異常なista様形態を伴う進行したPNを完全に救済できることを示しており、進行した疾患においても継続的な進歩をもたらす。神経変性は、細胞死前の段階の可逆的な証拠を提供する。この代謝の柔軟性の程度は、ニューロンがアテローム性動脈硬化症（TCAサイクルの再配線）を誘導する能力によってさらに強調され、これはOXPHOSを欠くPNにおけるPCx発現を阻害し、細胞死を促進することで保護的な役割を果たす（図5F）。
この研究では、PNのOXPHOS機能不全に対する反応は、代謝プログラムによって活性化される異なる活性化経路を介して、徐々にTCAサイクルアテローム性動脈硬化症に収束するという証拠を提供しました。多くの補完的な方法でプロテオミクス解析を確認し、重度のミトコンドリア機能不全に直面すると、ニューロンはこれまで知られていなかった代謝の弾力性を持っていることを明らかにしました。驚くべきことに、全体の再配線プロセスは、徐々に不可逆的に神経変性を伴う最終的な代謝状態を必ずしも示すものではなく、私たちのデータは、細胞死前の段階でも維持ニューロンを構成する可能性があることを示唆しています。機能的補償メカニズム。この発見は、ニューロンが体内でかなりの程度の代謝可塑性を持っていることを示しています。この事実は、MFN2の後の再導入が主要な代謝マーカーの発現を逆転させ、PNの変性を防ぐことができることを証明しています。逆に、アテローム性動脈硬化症を抑制し、神経を加速させます。
私たちの研究で最も興味深い発見の 1 つは、OXPHOS を欠く PN が、動脈硬化を特異的に刺激する酵素を上方制御することによって TCA サイクル代謝を変化させることができるということです。代謝の再編成は癌細胞の共通の特徴であり、その一部は、呼吸鎖を駆動し、脂質およびヌクレオチド生合成前駆体の産生を維持する還元当量を生成するために、TCA サイクル中間体を補充するグルタミンに依存しています (39、40)。最近の研究では、OXPHOS 機能不全を経験している末梢組織では、グルタミン / グルタミン酸代謝の再接続も顕著な特徴であることが示されており (5、41)、グルタミンが TCA サイクルに入る方向は OXPHOS 損傷の重症度によって決まります (41)。しかし、体内の神経代謝可塑性の類似性および疾患コンテキストにおけるその可能性のある関連性についての明確な証拠はありません。最近のin vitro研究では、初代皮質ニューロンが神経伝達のためにグルタミン酸プールを動員し、それによって代謝ストレス条件下で酸化代謝とアテローム性動脈硬化を促進することが示された（42）。注目すべきは、TCAサイクル酵素コハク酸デヒドロゲナーゼの薬理学的阻害下では、ピルビン酸カルボキシル化が培養小脳顆粒ニューロンにおけるオキサロ酢酸の合成を維持すると考えられていることである（34）。しかし、これらのメカニズムの脳組織（アテローム性動脈硬化は主にアストロサイトに限定されていると考えられている）に対する生理学的関連性は、依然として重要な生理学的意義を持っている（43）。この場合、我々のデータは、体内でOXPHOSによって損傷を受けたPNが、TCAプール中間体の補充の2つの主要な供給源であるBCAA分解とピルビン酸カルボキシル化に切り替えることができることを示している。 BCAA異化が神経細胞のエネルギー代謝に寄与するという仮説は、神経伝達におけるグルタミン酸とGABAの役割に加えて提唱されているものの（44）、これらのメカニズムがin vivoで機能しているという証拠はまだない。したがって、機能不全のPNは、アテローム性動脈硬化症の増加によって同化プロセスによって引き起こされるTCA中間体の消費を自動的に補償できると推測するのは容易である。特に、ミトコンドリア機能不全の増殖細胞で示唆されているように（45）、アスパラギン酸の需要増加を維持するためにPCxのアップレギュレーションが必要になる可能性がある。しかし、我々のメタボロミクス解析では、Mfn2cKO PNのアスパラギン酸の定常状態レベルに有意な変化は見られなかった（図S6A）。これはおそらく、増殖細胞と分裂後ニューロンの間でアスパラギン酸の代謝利用が異なることを反映していると考えられる。生体内の機能不全ニューロンにおける PCx のアップレギュレーションの正確なメカニズムはまだ解明されていませんが、小脳スライスを用いた FLIM 実験で実証されたように、この時期尚早な反応がニューロンの酸化還元状態の維持に重要な役割を果たしていることを示しました。特に、PN による PCx のアップレギュレーションを阻害すると、より酸化された状態になり、細胞死が加速する可能性があります。BCAA 分解の活性化とピルビン酸のカルボキシル化は、ミトコンドリア機能不全の末梢組織を特徴づける方法ではありません (7)。したがって、これらは唯一の特徴ではないにしても、神経変性に重要な OXPHOS 欠損ニューロンの優先的な特徴であると思われます。
小脳疾患は、通常運動失調として現れ、しばしばPN（ニューロン）を損傷する異質なタイプの神経変性疾患である（46）。このニューロン集団は、マウスでの選択的変性がヒト脊髄小脳失調症の特徴である多くの運動症状を再現するのに十分であるため、ミトコンドリア機能不全に対して特に脆弱である（16、47、48）。報告によると、変異遺伝子を持つトランスジェニックマウスモデルはヒト脊髄小脳失調症と関連しており、ミトコンドリア機能不全を伴う（49、50）ため、PNPHにおけるOXPH欠損の影響を研究することの重要性が強調される。したがって、この特異なニューロン集団を効果的に分離して研究することは特に適している。しかし、PNは圧力に非常に敏感であり、小脳細胞集団全体のごく一部を占めるにすぎないため、多くのオミクスベースの研究において、PNを全細胞として選択的に分離することは依然として困難な課題である。他の細胞型（特に成人組織）の混入を完全に排除することはほぼ不可能ですが、効果的な解離ステップとFACSを組み合わせることで、下流のプロテオミクス解析に十分な数の生存可能なニューロンを得ることができ、小脳全体の既存のデータセット（51）と比較して、かなり高いタンパク質カバレッジ（約3000種類のタンパク質）を実現しました。全細胞の生存性を維持することで、ここで提供する方法は、ミトコンドリアの代謝経路の変化だけでなく、細胞質側の対応するものの変化も確認できるため、細胞型を濃縮するためのミトコンドリア膜タグの使用を補完し、複雑な組織におけるミトコンドリア数の新しい方法（52、53）となります。ここで説明する方法は、プルキンエ細胞の研究に関連するだけでなく、ミトコンドリア機能不全の他のモデルを含む、疾患脳の代謝変化に対処するために、あらゆる種類の細胞に容易に適用できます。
最後に、この代謝再編成過程において、細胞ストレスの主要な兆候を完全に逆転させ、神経変性を予防できる治療可能な期間を特定しました。したがって、ここで述べた再配線の機能的意義を理解することで、ミトコンドリア機能不全時の神経細胞の生存を維持するための治療法に関する根本的な洞察が得られる可能性があります。この原理が他の神経疾患にも適用できるかどうかを完全に明らかにするためには、他の脳細胞種におけるエネルギー代謝の変化を詳細に解析する今後の研究が必要です。
MitoParkマウスについては既に報告されている（31）。loxP配列でMfn2遺伝子を挟んだC57BL/6Nマウスについては既に報告されており（18）、L7-Creマウスと交配された（23）。得られた二重ヘテロ接合体の子孫をホモ接合体のMfn2loxP/Mfn2loxPマウスと交配し、Mfn2のプルキンエ特異的遺伝子ノックアウトマウス（Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre）を作製した。交配の一部では、追加の交配によりGt（ROSA26）SorStop-mito-YFPアレル（stop-mtYFP）が導入された（20）。すべての動物実験は、欧州、国内、および機関のガイドラインに従って実施され、ドイツ、ノルトライン＝ヴェストファーレン州の環境および消費者保護局（LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz）の承認を得た。動物実験は、欧州実験動物科学協会連盟のガイドラインにも従って実施される。
妊娠中の女性の頸椎脱臼を麻酔した後、マウス胚を分離します（E13）。皮質は、10 mM Hepes を添加した Hanks 平衡塩類溶液 (HBSS) で解剖し、パパイン (20 U/ml) とシステイン (1μg/ml) を含む Dulbecco's Modified Eagle's Medium に移しました。組織を DMEM でインキュベートし、酵素消化により解離します。37℃で 20 分間 Ml) でインキュベートした後、10% ウシ胎児血清を添加した DMEM で機械的に粉砕します。細胞は、ポリリジンでコーティングしたガラスカバースリップ上に、6 cm 培養皿あたり 2×10⁶ 個の密度、またはイメージング解析用に 0.5×10⁵ 個の細胞/cm² の密度で播種しました。 4 時間後、培地を 1% B27 サプリメントと 0.5 mM GlutaMax を含む Neurobasal 血清フリー培地に交換した。その後、ニューロンは実験全体を通して 37 °C および 5% CO2 で維持され、週に 1 回給餌された。in vitro での組換えを誘導するために、次の AAV9 ウイルス ベクターを 3μl (24 ウェル培養皿) または 0.5μl (24 ウェルプレート) 使用して、in vitro での 2 日目にニューロンを処理した: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene、カタログ番号 105530-AAV9) および AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene、カタログ番号 105545-AAV9)。
マウスMfn1およびMfn2相補的DNA（それぞれAddgeneプラスミド#23212および#23213から取得）は、C末端にV5配列（GKPIPNPLLGLDST）でマークされ、T2A配列を介してmCherryとインフレームで融合されている。Grx1-roGFP2は、ハイデルベルクTP Dick DFKZ（ドイツ癌研究センター）からの提供である。従来のクローニング法を用いてtdTomatoカセットを置換することにより、カセットはpAAV-CAG-FLEX-tdTomatoバックボーン（Addgene参照番号28306）にサブクローニングされ、pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5、pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5およびpAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2ベクターが生成された。同様の戦略を用いて、コントロールベクター pAAV-CAG-FLEX-mCherry を作成した。AAV-shPCx コンストラクトを作成するには、マウス PCx を標的とする shRNA をコードする DNA 配列 (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) を含むプラスミド AAV ベクター (VectorBuilder、pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) が必要である。U6 プロモーターの制御下で、mCherry は CMV プロモーターの制御下で使用されている。補助 AAV ベクターの作製は、製造元の指示 (Cell Biolabs) に従って行った。要するに、mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)、mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry)、mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) または Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) のコード遺伝子、ならびにコード AAV1 カプシド タンパク質およびアクセサリ タンパク質を搭載したトランスファー プラスミドをリン酸カルシウム法でパッケージングします。ドライアイス/エタノール浴で凍結融解サイクルを行い、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を溶解することにより、粗ウイルス上清を得ました。 AAVベクターは、不連続ヨージキサノール勾配超遠心分離（32,000 rpm、4℃で24時間）により精製され、Amicon ultra-15遠心フィルターを使用して濃縮された。AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013ゲノムコピー（GC）/ml]、AAV1-CAG-FLEX-mCherry（6.1×1012 GC/ml）、AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5（1.9×1013 GC/ml）、AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2（8.9×1012 GC/ml）のゲノム力価は、以前に記載されたとおり（54）、リアルタイム定量PCR（qPCR）により測定された。
初代ニューロンを氷冷した 1x PBS で掻き取り、ペレット化し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤 (Roche) を含む 0.5% Triton X-100 / 0.5% デオキシコール酸ナトリウム / PBS 溶解バッファーでホモジナイズした。タンパク質定量は、ビシンコニン酸アッセイ (Thermo Fisher Scientific) を使用して行った。タンパク質は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜 (GE Healthcare) にブロッティングした。非特異的部位をブロックし、TBST (Tween を含む Tris 緩衝生理食塩水) 中の 5% ミルクで一次抗体 (詳細は表 S1 を参照) とインキュベートし、洗浄ステップと TBST 中の二次抗体をインキュベートする。一次抗体と +4°C で一晩インキュベートする。洗浄後、室温で 2 時間二次抗体を適用する。続いて、同じブロットを抗β-アクチン抗体とインキュベートすることにより、同じローディング量が確認された。化学発光への変換および化学発光増強による検出（GEヘルスケア）。
ガラスカバースリップ上に播種したニューロンは、指定された時点で室温で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)/PBS で 10 分間固定した。カバースリップは、まず室温で 0.1% Triton X-100/PBS で 5 分間浸透させ、次にブロッキングバッファー [3% ウシ血清アルブミン (BSA)/PBS] で浸透させた。2 日目に、カバースリップをブロッキングバッファーで洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体とともに室温で 2 時間インキュベートした。最後に、サンプルを PBS で十分に洗浄し、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で対比染色した後、Aqua-Poly/Mount で顕微鏡スライドに固定した。
マウス（オスとメス）にケタミン（130 mg/kg）とキシラジン（10 mg/kg）を腹腔内注射して麻酔をかけ、カルプロフェン鎮痛剤（5 mg/kg）を皮下投与し、温熱パッドを備えた定位固定装置（Kopf）に置いた。頭蓋骨を露出し、歯科用ドリルを使用して、小脳皮質のうちミス骨（ラムダから：尾部1.8、外側1、小葉IVおよびVに相当）に対応する部分を薄く削る。湾曲した注射針を使用して、頭蓋骨に小さな穴を慎重に開け、下の血管系を損傷しないようにする。次に、細く引き伸ばしたガラス毛細管をマイクロホール（硬膜腹側の-1.3から-1）にゆっくりと挿入し、手動シリンジ（Narishige）を用いてマイクロインジェクター（Narishige）に200～300 nlのAAVを10～20分かけて低圧で数回注入する。注入後、ウイルスが完全に拡散するように毛細管をさらに10分間留置する。毛細管を抜去した後、創傷の炎症を最小限に抑え、動物が回復できるように皮膚を慎重に縫合する。手術後数日間、動物には鎮痛剤（カスポフェン）を投与し、その間、動物の身体状態を注意深く観察し、所定の時点で安楽死させた。すべての手順は、欧州、国内、および機関のガイドラインに従って実施され、ドイツ、ノルトライン＝ヴェストファーレン州の環境・消費者保護自然局の承認を得ています。
動物はケタミン（100 mg/kg）とキシラジン（10 mg/kg）で麻酔され、心臓はまず0.1 M PBSで灌流され、次にPBS中の4% PFAで灌流された。組織は解剖され、4°Cで一晩4% PFA/PBSで固定された。振動ナイフ（Leica Microsystems GmbH、ウィーン、オーストリア）を使用して、PBSで固定された脳から矢状断切片（厚さ50 μm）を作成した。特に指定がない限り、遊離浮遊切片の染色は、上記（13）に記載されているように、室温で撹拌しながら行われた。簡単に言うと、まず、得られた切片を室温で15分間0.5% Triton X-100/PBSで透過処理した。一部のエピトープ（PcxおよびShmt2）については、このステップの代わりに、切片を80°C（pH 9）のトリス-EDTA緩衝液で25分間加熱した。次に、切片をブロッキングバッファー（3% BSA/PBS）中の一次抗体（表S1参照）と共に4℃で一晩撹拌しながらインキュベートした。翌日、切片をブロッキングバッファーで洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体と共に室温で2時間インキュベートした。最後に、切片をPBSで十分に洗浄し、DAPIで対比染色した後、顕微鏡スライド上にAquaPolymountで固定した。
白色光レーザーと405ダイオード紫外線レーザーを備えたレーザー走査共焦点顕微鏡（TCS SP8-XまたはTCSデジタルライトシート、ライカマイクロシステムズ）を使用してサンプルを画像化しました。蛍光色素を励起し、ハイブリッド検出器（HyD）で信号を収集することにより、LAS-Xソフトウェアを使用して、ナイキストサンプリングに準拠したスタック画像をシーケンシャルモードで収集しました。非定量パネルの場合、非常にダイナミックな信号（たとえば、体細胞と樹状突起mtYFP）です。BrightRモードでPNの数を検出するにはHyDを使用します。バックグラウンドを低減するために、0.3～6 nsのゲーティングが適用されます。
選別された細胞のリアルタイムイメージング。1% B27 サプリメントと 0.5 mM GlutaMax を含む Neurobasal-A 培地で選別した後、細胞を直ちにポリ-L-リジンコートガラススライド (μ-Slide8 Well、Ibidi、カタログ番号 80826) に播種し、37 °C、5% CO2 で 1 時間保持して細胞を定着させた。リアルタイムイメージングは​​、白色レーザー、HyD、63×[1.4 開口数 (NA)] 油浸対物レンズ、加熱ステージを備えた Leica SP8 レーザー走査共焦点顕微鏡で実行した。
マウスは二酸化炭素で迅速に麻酔され、断頭され、脳は頭蓋骨から迅速に取り出され、200μm 厚 (13C 標識実験用) または 275μm 厚 (2 光子実験用) の矢状断面に切断され、以下の材料が充填された。アイスクリーム (HM-650 V、Thermo Fisher Scientific、ドイツ、ヴァルドルフ) には、以下の物質が充填されている: 125 mM 氷冷、炭素飽和 (95% O2 および 5% CO2) 低 Ca2 + 人工脳脊髄液 (ACSF) NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM リン酸ナトリウム緩衝液、25 mM NaHCO3、25 mM グルコース、0.5 mM CaCl2 および 3.5 mM MgCl2 (浸透圧 310 ～ 330 mmol)。得られた脳スライスを、高濃度のCa2+ ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl2、2.0 mM MgCl2）を含む前培養チャンバーに移し、pH 7.4、310～320 mmolのCa2+濃度で培養する。
画像撮影中は、スライスを専用の画像撮影室に移動させ、32～33℃の一定温度でACSFを連続的に灌流しながら実験を行った。スライス画像撮影には、ライカ25倍対物レンズ（NA 0.95、水）とTi:サファイアレーザー（Chameleon Vision II、Coherent）を搭載したマルチフォトンレーザー走査顕微鏡（TCS SP8 MP-OPO、ライカマイクロシステムズ）を使用した。FLIMモジュール（PicoHarp300、PicoQuant）も使用した。
Grx1-roGFP2のFLIM。Grx1-roGFP2バイオセンサーがPNを標的とした矢状脳切片において、2光子FLIMによりPNの細胞質酸化還元状態の変化を測定した。PN層では、生存可能なPN（すなわち、樹状突起に沿ったビーズ状構造や神経形態変化がない）と、二重陽性roGFP2センサーおよびshRNA PCxまたはその制御配列をコードするAAV（それぞれmCherryを共発現）が存在することを確認するため、切片表面から約50～80μm下の取得フィールドを選択した。2倍デジタルズーム[励起波長：890 nm、512 nm、512ピクセル]でシングルスタック画像を収集した。検出: 内部 HyD、フルオレセインイソチオシアネート (FITC) フィルター グループ] および 2 ～ 3 分以内の画像平均化を使用して、曲線フィッティングに十分な光子 (合計 1000 光子) が収集されるようにします。 Grx1-roGFP2 プローブの感度と FLIM 条件の検証は、灌流 ACSF に外因性の 10 mM H2O2 を追加したとき (酸化を最大化して寿命を延長するため)、および 2 mM ジチオスレイトールを追加したとき (還元度を最小化して寿命を短縮するため) の roGFP2 の寿命値をモニタリングすることによって実行されました (図 S8、D ～ G)。取得した結果を解析するためにFLIMfit 5.1.1ソフトウェアを使用し、画像全体の単一指数減衰曲線を測定されたIRF（機器応答関数）にフィッティングし、χ2が約1となるようにしました。単一のPNの寿命を計算するために、神経体の周囲のマスクを手動で描画し、各マスク内の平均寿命を定量化に使用しました。
ミトコンドリア電位分析。急性切片を灌流ACSFに直接添加した100 nM TMRMで30分間インキュベートした後、PNのミトコンドリア電位の変化を二光子顕微鏡で測定した。TMRMイメージングは​​、プローブを920 nmで励起し、内部HyD（テトラメチルローダミンイソチオシアネート：585/40 nm）を使用してシグナルを収集することによって実行した。mtYFPのイメージングには、同じ励起波長を使用するが、異なる内部HyD（FITC：525/50）を使用した。ImageJのImage Calculatorプラグインを使用して、単一細胞レベルでミトコンドリア電位を評価する。簡単に言うと、プラグイン方程式：signal = min (mtYFP、TMRM)を使用して、対応するチャネルのシングルスタック共焦点画像でプルキンエソマリのTMRMシグナルを示すミトコンドリア領域を特定する。次に、得られたマスク内のピクセル領域を定量化し、mtYFPチャネルの対応する閾値シングルスタック画像で正規化して、ミトコンドリア電位を示すミトコンドリア分画を取得します。
画像はHuygens Pro（Scientific Volume Imaging）ソフトウェアでデコンボリューション処理を行った。タイルをスキャンした画像については、LAS-Xソフトウェアに搭載されている自動スティッチングアルゴリズムを用いて、1枚のタイルのモンタージュ画像を作成した。画像キャリブレーション後、ImageJとAdobe Photoshopを用いて画像をさらに処理し、明るさとコントラストを均一に調整した。グラフィック作成にはAdobe Illustratorを使用した。
mtDNAフォーカス解析。DNAに対する抗体で標識した小脳切片上のmtDNA病変数を共焦点顕微鏡で定量した。各細胞の細胞体と核に対してそれぞれターゲット領域を作成し、Multi Measureプラグイン（ImageJソフトウェア）を使用してそれぞれの領域を計算した。細胞体領域から核領域を差し引いて細胞質領域を得た。最後に、Analyze Particlesプラグイン（ImageJソフトウェア）を使用して、閾値画像上のmtDNAを示す細胞質DNAポイントを自動的に定量し、得られた結果をCTRLマウスのPN平均値で正規化した。結果は、細胞あたりの平均ヌクレオシド数として表される。
タンパク質発現解析。ImageJ の Image Calculator プラグインを使用して、PN におけるタンパク質発現を単一細胞レベルで評価します。簡単に言うと、対応するチャネルの単層共焦点画像において、signal = min (mtYFP, antibody) の式を用いて、プルキナの特定の抗体に対して免疫反応性を示すミトコンドリア領域を特定します。次に、得られたマスク内のピクセル領域を定量化し、mtYFP チャネルの対応する閾値単一スタック画像で正規化して、表示されたタンパク質のミトコンドリア分画を取得します。
プルキンエ細胞密度解析。ImageJのCell Counterプラグインを用いて、カウントされたプルキンエ細胞数を、カウントされた細胞が占める小脳輪の長さで割ることにより、プルキンエ細胞密度を評価した。
サンプルの準備と収集。コントロール群と Mfn2cKO マウスの脳を 0.1 M リン酸緩衝液 (PB) 中の 2% PFA/2.5% グルタルアルデヒドで固定し、繊毛虫 (Leica Mikrosysteme GmbH、ウィーン、オーストリア) を使用して冠状断面 (厚さ 50 ～ 60 μm) を作成した。次に、室温で 1 時間、1% 四酸化オスミウムと 1.5% フェロシアン化カリウムを含む PB 緩衝液で固定した。切片を蒸留水で 3 回洗浄し、1% 酢酸ウラニルを含む 70% エタノールで 20 分間染色した。切片を段階的アルコールで脱水し、シリコン コートガラス スライドの間に Durcupan ACM (Araldite 鋳造樹脂 M) エポキシ樹脂 (Electron Microscopy Sciences、カタログ番号 14040) に包埋し、最後にオーブンで 60℃ で 48 時間重合した。小脳皮質領域を選択し、ライカウルトラカット（ライカマイクロシステムズ社、オーストリア、ウィーン）で50 nmの超薄切片を作製し、ポリスチレンフィルムでコーティングした2×1 mmの銅スリットグリッド上に載せた。切片を4%酢酸ウラニル水溶液で10分間染色し、水で数回洗浄した後、レイノルズ鉛クエン酸水溶液で10分間染色し、さらに水で数回洗浄した。透過型電子顕微鏡Philips CM100（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）とTVIPS（ティーツビデオ画像処理システム）TemCam-F416デジタルカメラ（TVIPS社、米国ガウティング）を用いて顕微鏡写真を撮影した。
AAVに感染したマウスの場合、脳を分離して1 mm厚の矢状断面にスライスし、蛍光顕微鏡を使用して小脳を観察し、AAV感染リング（すなわち、mCherryを発現している）を特定した。少なくとも2つの連続する小脳リングでプルキンエ細胞層（つまり、ほぼ全層）の非常に高い形質導入効率がAAV注射によって得られた実験のみを使用する。AAV形質導入ループをマイクロ解剖して一晩後固定（0.1 Mココエート緩衝液中の4% PFAと2.5%グルタルアルデヒド）し、さらに処理した。EPON包埋のために、固定した組織を0.1 Mココエートナトリウム緩衝液（Applichem）で洗浄し、0.1 Mココエートナトリウム緩衝液（Applichem）中の2% OsO4（os、Science Services; Caco）で4時間インキュベートした後、2時間洗浄した。 0.1 M コカミド緩衝液で 3 回繰り返します。続いて、エタノール濃度を段階的に上げて、各エタノール溶液を 4°C で 15 分間インキュベートして組織を脱水します。組織をプロピレンオキシドに移し、EPON (Sigma-Aldrich) で 4°C で一晩インキュベートします。組織を新鮮な EPON に室温で 2 時間置き、その後 62°C で 72 時間包埋します。超ミクロトーム (Leica Microsystems、UC6) とダイヤモンドナイフ (Diatome、Biel、スイス) を使用して 70 nm の超薄切片を切断し、1.5% 酢酸ウラニルで 37°C で 15 分間染色し、クエン酸鉛溶液で 4 分間染色します。電子顕微鏡写真は、カメラOneView 4K 16ビット（Gatan社製）およびDigitalMicrographソフトウェア（Gatan社製）を搭載したJEM-2100 Plus透過型電子顕微鏡（JEOL社製）を用いて撮影した。解析には、5000倍または10000倍のデジタルズームで取得した電子顕微鏡写真を使用した。
ミトコンドリアの形態学的解析。すべての解析において、ImageJソフトウェアを使用してデジタル画像上で個々のミトコンドリアの輪郭を手動で描画した。さまざまな形態学的パラメータを解析した。ミトコンドリア密度は、各細胞の総ミトコンドリア面積を細胞質面積で割った値（細胞質面積＝細胞面積－細胞核面積）×100として表される。ミトコンドリアの丸みは、[4π∙(面積／周囲長2)]の式で計算される。ミトコンドリアの形態は解析され、主な形状に基づいて「管状」と「水疱状」の2つのカテゴリーに分類された。
オートファゴソーム/リソソームの数と密度の解析。ImageJソフトウェアを使用して、デジタル画像内の各オートファゴソーム/リソソームの輪郭を手動で描画します。オートファゴソーム/リソソームの面積は、各細胞のオートファゴソーム/リソソーム構造の総面積を細胞質面積（細胞質面積＝細胞面積－核面積）×100で割って算出したパーセンテージで表します。オートファゴソーム/リソソームの密度は、総数を細胞あたりのオートファゴソーム/リソソーム構造の数（細胞質面積）（細胞質面積＝細胞面積－核面積）で割って算出します。
急性切片作製およびサンプル調製のための標識。グルコース標識を必要とする実験では、急性脳切片を前培養チャンバーに移します。このチャンバーには、飽和炭素（95% O2 および 5% CO2）、高 Ca2 + ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM リン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO 3、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl 2 および 2.0 mM MgCl 2、pH 7.4 および 310 ～ 320 mOsm に調整）が含まれており、グルコースは 13 C 6- グルコース置換体（Eurisotop、カタログ番号 CLM-1396）です。ピルビン酸標識が必要な実験では、急性脳切片を高Ca2+ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl2、2.0 mM MgCl2を加え、pH 7.4、浸透圧310～320 mOsmに調整）に移し、1 mM 1-[1-13C]ピルビン酸（Eurisotop、カタログ番号CLM-1082）を加える。切片を37℃で90分間インキュベートする。実験終了後、切片を75 mM炭酸アンモニウムを含む水溶液（pH 7.4）で素早く洗浄し、アセトニトリル（ACN）：メタノール：水（v:v:v）の40:40:20の混合液中で均質化した。切片を氷上で30分間インキュベートした後、サンプルを4℃で21,000 g、10分間遠心分離し、透明な上清をSpeedVac濃縮器で乾燥させた。得られた乾燥代謝物ペレットは、分析まで-80℃で保存した。
13 C 標識アミノ酸の液体クロマトグラフィー質量分析。液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) 分析のために、代謝物ペレットを 75 μl の LC-MS グレード水 (Honeywell) に再懸濁した。4 °C で 5 分間 21,000 g で遠心分離した後、清澄化された上清 20 μl をアミノ酸フラックス分析に使用し、残りの抽出液は直ちに陰イオン分析に使用した (下記参照)。アミノ酸分析は、以前に説明したベンゾイルクロリド誘導体化プロトコル (55、56) を使用して実施した。最初のステップでは、10 μl の 100 mM 炭酸ナトリウム (Sigma-Aldrich) を 20 μl の代謝物抽出液に加え、次に 10 μl の 2% ベンゾイルクロリド (Sigma-Aldrich) を LC グレード ACN に加えた。サンプルを軽くボルテックスした後、20℃で21,000 gで5分間遠心分離した。上清を円錐形のガラスインサート（容量200 μl）付きの2 mlオートサンプラーバイアルに移した。サンプルは、Q-Exactive（QE）-HF（超高磁場オービトラップ）高分解能精密質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に接続されたAcquity iClass超高性能LCシステム（Waters）を使用して分析した。分析のために、誘導体化サンプル2μlを1.8μm粒子を含む100×1.0 mm高強度シリカT3カラム（Waters）に注入した。流速は100μl/分で、バッファーシステムはバッファーA（水中の10 mMギ酸アンモニウムと0.15%ギ酸）とバッファーB（ACN）で構成されている。グラジエントは次のとおりである：0分で0%B。 0%B。0～0.1分で0～15%B、0.1～0.5分で15～17%B、0.5～14分で17～55%B、14～14.5分で55～70%B、18分で14.5～70～100%B、18～19分で100%B、19～19.1分で100～0%B、19.1～28分で0%B（55、56）。 QE-HF質量分析計は、質量範囲m/z（質量電荷比）50～750の正イオン化モードで動作します。適用分解能は60,000、ゲイン制御（AGC）イオンターゲットは3×10⁶、最大イオン時間は100ミリ秒です。加熱式エレクトロスプレーイオン化（ESI）源は、スプレー電圧3.5 kV、キャピラリー温度250℃、シース気流60 AU（任意単位）、補助気流20 AUで動作します。250℃。Sレンズは60 AUに設定されています。
13C標識有機酸の陰イオンクロマトグラフィー-MS分析。残りの代謝物沈殿物（55μl）は、QE-HF質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に接続されたDionexイオンクロマトグラフィーシステム（ICS 5000+、Thermo Fisher Scientific）を使用して分析した。簡単に言うと、代謝物抽出液5μlを、充填率1のプッシュイン部分ループモードでHPLC（2 mm×250 mm、粒子サイズ4μm、Thermo Fisher Scientific）を備えたDionex IonPac AS11-HCカラムに注入した。）Dionex IonPac AG11-HCガードカラム（2 mm x 50 mm、4μm、Thermo Fisher Scientific）。カラム温度は30℃に維持し、オートサンプラーは6℃に設定した。脱イオン水が付属の水酸化カリウムカートリッジを使用して、溶出液発生器を通して水酸化カリウム勾配を生成する。代謝物の分離は、流速380μl/minで、以下のグラジエントを適用して行った：0～3分、10mM KOH；3～12分、10～50mM KOH；12～19分、50～100mM KOH；19～21分、100mM KOH；21～21.5分、100～10mM KOH。カラムは10mM KOH中で8.5分間再平衡化した。
溶出された代謝物は、カラムの後に 150μl/min のイソプロパノール補充流と混合され、負イオン化モードで動作する高分解能質量分析計に送られます。MS は、m/z 50 ～ 750 の質量範囲を 60,000 の分解能でモニタリングします。AGC は 1×106 に設定され、最大イオン時間は 100 ms に維持されます。加熱式 ESI イオン源は、スプレー電圧 3.5 kV で動作しました。イオン源のその他の設定は次のとおりです。キャピラリー温度 275 °C、シースガス流量 60 AU、補助ガス流量 300 °C で 20 AU、S レンズ設定 60 AU。
13C標識代謝物のデータ解析。同位体比のデータ解析にはTraceFinderソフトウェア（バージョン4.2、Thermo Fisher Scientific）を使用。各化合物の同一性は信頼できる参照化合物によって検証され、独立して分析された。同位体濃縮分析を実行するために、各13C同位体（Mn）の抽出イオンクロマトグラム（XIC）の面積は、アミノ酸の分析に使用される[M + H] +（nは対象化合物の炭素数）または陰イオンの分析に使用される[MH] +から抽出された。XICの質量精度は5 ppm未満であり、RTの精度は0.05分である。濃縮分析は、検出された各同位体と対応する化合物のすべての同位体の合計との比を計算することによって実行される。これらの比は各同位体についてパーセント値として示され、結果は前述のようにモルパーセント濃縮（MPE）として表される（42）。
凍結したニューロンペレットを氷冷した80%メタノール（v/v）中で均質化し、ボルテックスした後、-20℃で30分間インキュベートした。サンプルを再びボルテックスし、+4℃で30分間撹拌した。サンプルを4℃で21,000gで5分間遠心分離し、得られた上清を回収し、SpeedVac濃縮器を使用して25℃で乾燥させ、その後の分析に用いた。上記のように、選別した細胞のアミノ酸についてLC-MS分析を行った。TraceFinder（バージョン4.2、Thermo Fisher Scientific）を使用して、各化合物の単一同位体質量を使用してデータ解析を行った。代謝物データの分位正規化は、preprocessCoreソフトウェアパッケージ（57）を使用して行った。
スライス標本の作製。マウスを二酸化炭素で迅速に麻酔し、断頭し、脳を頭蓋骨から迅速に取り出し、氷で満たした振動ナイフ（HM-650 V、Thermo Fisher Scientific、ドイツ、ヴァルドルフ）を使用して、300～375 μmの矢状断切片に切断した。冷炭素ガス化（95% O2および5% CO2）低Ca2+ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl2および6.0 mM MgCl2 pH 7.4および310～330 mOsmに調整）。得られた脳スライスを、高濃度のCa2+ ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、4.0 mM CaCl2、3.5 mM MgCl2、pH 7.4、浸透圧310～320 mOsm）を含むチャンバーに移します。記録前にスライスが回復するように、20～30分間保存します。
記録。すべての記録には、固定記録チャンバーと20倍水浸対物レンズ（Scientifica）を備えた顕微鏡ステージが使用されました。推定プルキンエ細胞は、（i）体サイズ、（ii）小脳の解剖学的位置、および（iii）蛍光mtYFPレポーター遺伝子の発現によって識別されました。先端抵抗が5～11メガオームのパッチピペットは、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（GB150-10、0.86 mm×1.5 mm×100 mm、Science Products、Hofheim、ドイツ）と水平ピペットInstruments（P-1000、Sutter、Novato、CA）によって引き出されます。すべての記録は、ソフトウェアSignal（バージョン6.0、Cambridge Electronic、Cambridge、英国）によって制御されるELC-03XS npiパッチクランプアンプ（npi electronic GmbH、Tam、ドイツ）によって実行されました。実験は12.5 kHzのサンプリングレートで記録されました。信号は、それぞれカットオフ周波数が1.3kHzと10kHzの2つの短波長ベッセルフィルタでフィルタリングされます。膜とピペットの静電容量は、アンプを用いた補償回路によって補償されます。すべての実験は、Hokawoソフトウェア（バージョン2.8、浜松ホトニクス、ドイツ・ゲルデン）で制御されるOrca-Flash 4.0カメラ（浜松ホトニクス、ドイツ・ゲルデン）の制御下で行われました。
ルーチンの全細胞構成と解析。記録直前に、ピペットに以下の物質を含む内部溶液を充填します。4.0 mM KCl、2.0 mM NaCl、0.2 mM EGTA、135.0 mM グルコン酸カリウム、10.0 mM Hepes、4.0 mM ATP (Mg)、0.5 mM グアノシン三リン酸 (GTP) (Na)、10.0 mM クレアチニンリン酸を pH 7.25 に調整し、浸透圧は 290 mOsm (スクロース) でした。膜を破裂させるために 0 pA の力を加えた直後に、静止膜電位を測定します。入力抵抗は、-40、-30、-20、および -10 pA の過分極電流を印加することによって測定します。電圧応答の大きさを測定し、オームの法則を使用して入力抵抗を計算します。自発活動は電圧クランプで 5 分間記録され、sPSC は Igor Pro (バージョン 32 7.01、WaveMetrics、オレゴン州レイクオスウィーゴ、米国) で半自動認識スクリプトを使用して識別および測定されました。IV 曲線と定常状態電流は、バッテリーを異なる電位 (-110 mV から開始) でクランプし、電圧を 5 mV ステップで増加させることによって測定されます。AP の生成は、脱分極電流を適用することによってテストされました。脱分極電流パルスを適用しながら、セルを -70 mV でクランプします。各記録ユニットのステップサイズを個別に調整します (10 ～ 60 pA)。最も高い AP 周波数を引き起こすパルス スパイクを手動でカウントして、最大 AP 周波数を計算します。AP 閾値は、最初に 1 つ以上の AP をトリガーする脱分極パルスの 2 階微分を使用して分析されます。
穿孔パッチの構成と解析。標準プロトコルを使用して穿孔パッチ記録を実行します。次の成分を含まないATPおよびGTPフリーピペットを使用し、pH 7.2に調整します（KOHを使用）。細胞膜の制御されない透過性を防ぐため、細胞内溶液からATPおよびGTPを除去します。パッチピペットには、パンチパッチ記録を得るために、アムホテリシンを含む内部溶液（約200～250μg/ml、G4888、Sigma-Aldrich）を充填します。アムホテリシンはジメチルスルホキシド（最終濃度：0.1～0.3%、DMSO、D8418、Sigma-Aldrich）に溶解しました。使用した DMSO の濃度は、研究対象のニューロンに有意な影響を与えませんでした。パンチング処理中は、チャネル抵抗 (Ra) を継続的に監視し、Ra と AP の振幅が安定した後 (20～40 分) に実験を開始しました。自発活動は、電圧および/または電流クランプで 2 ～ 5 分間測定されます。データ解析は、Igor Pro (バージョン 7.05.2、WaveMetrics、米国)、Excel (バージョン 2010、Microsoft Corporation、米国 Redmond)、および GraphPad Prism (バージョン 8.1.2、GraphPad Software Inc.、米国 La Jolla) を使用して実行されました。自発 AP を識別するために、IgorPro の NeuroMatic v3.0c プラグインが使用されます。各記録ごとに個別に調整される所定の閾値を使用して、AP を自動的に識別します。スパイク間隔を使用して、最大瞬間スパイク周波数と平均スパイク周波数でスパイク周波数を決定します。
PNの分離。以前に発表されたプロトコルを改変して、特定の段階のマウス小脳からPNを精製した（58）。簡単に言うと、小脳を解剖して氷冷解離培地［HBSS Ca2+およびMg2+なし、20 mMグルコース、ペニシリン（50 U/ml）、ストレプトマイシン（0.05 mg/ml）を添加］で細かくし、次にパパイン［HBSS、1-システイン・HCl（1 mg/ml）、パパイン（16 U/ml）、デオキシリボヌクレアーゼI（DNase I；0.1 mg/ml）を添加］で培地を消化し、30℃で30分間処理した。まず、酵素消化を防ぐため、室温で卵粘液（10 mg/ml）、BSA（10 mg/ml）、DNase（0.1 mg/ml）を含むHBSS培地で組織を洗浄し、次に、20 mMグルコース、ペニシリン（50 U/ml）、ストレプトマイシン（0.05 mg/ml）、DNase（0.1 mg/ml）を含むHBSS培地で穏やかに粉砕して単一細胞を放出します。得られた細胞懸濁液を70μmセルストレーナーでろ過し、遠心分離（1110 rpm、5分、4°C）により細胞をペレット化し、ソーティング培地［HBSS、20 mMグルコース、20%ウシ胎児血清、ペニシリン（50 U/ml）、ストレプトマイシン（0.05 mg/ml）を添加］に再懸濁します。プロピジウムヨウジドを用いて細胞生存率を評価し、細胞密度を1×10⁶～2×10⁶細胞/mlに調整する。フローサイトメトリーを行う前に、懸濁液を50μmのセルストレーナーでろ過する。
フローサイトメーター。細胞ソーティングは、FACSAria III マシン (BD Biosciences) と FACSDiva ソフトウェア (BD Biosciences、バージョン 8.0.1) を使用して 4 °C で実行しました。細胞懸濁液は、100 μm ノズルを使用して 20 psi の圧力で、約 2800 イベント/秒の速度でソーティングされました。従来のゲーティング基準 (細胞サイズ、二峰性識別、散乱特性) では、PN を他の細胞タイプから正しく分離することが保証されないため、ゲーティング戦略は、mitoYFP+ マウスとコントロール mitoYFP − マウスの YFP 強度と自家蛍光の直接比較に基づいて設定されています。YFP は、サンプルに 488 nm レーザーラインを照射して励起され、信号は 530/30 nm バンドパスフィルターを使用して検出されます。mitoYFP+ マウスでは、Rosa26-mitoYFP レポーター遺伝子の相対強度も、神経細胞体と軸索断片を区別するために使用されます。 7-AADは561nmの黄色レーザーで励起され、死細胞を除外するために675/20nmバンドパスフィルターで検出される。同時にアストロサイトを分離するために、細胞懸濁液をACSA-2-APCで染色し、サンプルに640nmのレーザー光を照射し、660/20nmバンドパスフィルターを使用して信号を検出した。
採取した細胞は遠心分離（1110 rpm、5分、4℃）によりペレット化し、使用するまで-80℃で保存した。Mfn2cKOマウスとその同腹仔は、手順のばらつきを最小限に抑えるため、同日に分類した。FACSデータの表示と解析は、FlowJoソフトウェア（FlowJo LLC、米国オレゴン州アッシュランド）を使用して行った。
前述の通り（59）、リアルタイムPCRは、選別されたニューロンからDNAを分離し、その後のmtDNA定量に用いる。直線性と閾値感度は、まず異なる数の細胞でqPCRを実行することによってテストした。簡単に言うと、50 mMトリス-HCl（pH 8.5）、1 mM EDTA、0.5% Tween 20、プロテイナーゼK（200 ng/ml）からなる溶解バッファーに300 PNを集め、55℃で120分間インキュベートする。細胞をさらに95℃で10分間インキュベートして、プロテイナーゼKの完全な不活性化を確実にする。mt-Nd1に特異的なTaqManプローブ（Thermo Fisher）を用いて、7900HTリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）で半定量PCRによりmtDNAを測定した。 Science (カタログ番号 Mm04225274_s1)、mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 AIVI3E8)、および 18S (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 Hs99999901_s1) 遺伝子。
プロテオームサンプルの調製。溶解バッファー[6 M グアニジン塩酸塩、10 mM トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、10 mM クロロアセトアミド、100 mM トリス-HCl]中で、95℃で10分間加熱し、超音波処理して凍結ニューロンペレットを溶解します。Bioruptor (Diagenode) で10分間 (30秒パルス / 30秒休止期間) 処理します。サンプルを20 mM トリス-HCl (pH 8.0) で1:10に希釈し、300 ng トリプシンゴールド (Promega) と混合し、37℃で一晩インキュベートして完全に消化します。2日目に、サンプルを20,000 gで20分間遠心分離します。上清を0.1%ギ酸で希釈し、自作のStageTipsで脱塩します。サンプルは SpeedVac 装置 (Eppendorf concentrator plus 5305) で 45°C で乾燥させ、その後ペプチドを 0.1% ギ酸に懸濁した。すべてのサンプルは同一人物によって同時に調製された。アストロサイトサンプルを分析するために、4 μg の脱塩ペプチドをタンデム質量タグ (TMT10plex、カタログ番号 90110、Thermo Fisher Scientific) で標識し、ペプチドと TMT 試薬の比率を 1:20 とした。TMT 標識の場合、0.8 mg の TMT 試薬を 70 μl の無水 ACN に再懸濁し、乾燥させたペプチドを 9 μl の 0.1 M TEAB (トリエチルアンモニウム重炭酸塩) に再溶解し、これに 7 μl の ACN 中の TMT 試薬を加えた。濃度は 43.75% であった。60 分間のインキュベーション後、2 μl の 5% ヒドロキシルアミンで反応を停止した。標識ペプチドを回収し、乾燥させ、200μlの0.1%ギ酸（FA）に再懸濁し、2つに分け、自作のStageTipsを使用して脱塩した。UltiMate 3000超高性能液体クロマトグラフ（UltiMate 3000超高性能液体クロマトグラフ）を使用して、2つの半分のうちの1つを、130Å1.7μm C18粒子（Waters、カタログ番号SKU：186006935、Thermo Fisher Scientific）を充填した1mm x 150mm Acquityクロマトグラフィーカラムで分画した。ペプチドを30μl/分の流速で分離し、96分の段階的グラジエントで85分間1%から50%のバッファーBに分離し、3分間で50%から95%のバッファーBに分離し、その後8分間95%のバッファーBに分離した。緩衝液Aは5%アセトニトリルと10mM炭酸水素アンモニウム（ABC）からなり、緩衝液Bは80%アセトニトリルと10mM炭酸水素アンモニウムからなります。3分ごとに分画を採取し、2つのグループ（1+17、2+18など）にまとめて、真空遠心分離機で乾燥させます。
LC-MS/MS分析。質量分析では、ペプチド（番号r119.aq）を、1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ培地（Dr. Maisch、mat）を備えた25 cm、内径75 μmのPicoFrit分析カラム（新しい対物レンズ、部品番号PF7508250）で分離し、EASY-nLC 1200（Thermo Fisher Scientific、ドイツ）を使用しました。カラムは50℃に維持しました。バッファーAとBは、それぞれ水中の0.1%ギ酸と80% ACN中の0.1%ギ酸です。ペプチドは、6%から31%のバッファーBで65分間、31%から50%のバッファーBで5分間、200 nl/minのグラジエントで分離しました。溶出されたペプチドは、Orbitrap Fusion質量分析計（Thermo Fisher Scientific）で分析された。ペプチド前駆体m/z測定は、350～1500 m/zの範囲で120,000の分解能で行われる。27%正規化衝突エネルギーを使用して、電荷状態が2～6の最も強い前駆体が、高エネルギーCトラップ解離（HCD）切断用に選択される。サイクル時間は1秒に設定されている。ペプチド断片のm/z値は、最小AGCターゲット5×104と最大注入時間86 msを使用してイオントラップで測定された。断片化後、前駆体は45秒間動的除外リストに置かれた。 TMT標識ペプチドは、50 cm、75 μm Acclaim PepMapカラム（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号164942）で分離され、移動スペクトルは、−50 Vと−70 Vの2つの補償電圧で動作する高磁場非対称波形イオン（FAIMS）装置（Thermo Fisher Scientific）を備えたOrbitrap Lumos Tribrid質量分析計（Thermo Fisher Scientific）で分析されました。同期前駆イオンに基づいて選択されたMS3は、TMTレポートイオンシグナルの測定に使用されます。ペプチドの分離は、EASY-nLC 1200で、バッファー濃度6%から31%の90%直線勾配溶出を使用して行われました。バッファーAは0.1% FA、バッファーBは0.1% FAと80% ACNでした。分析カラムは50℃で操作されます。 FreeStyle（バージョン1.6、Thermo Fisher Scientific社製）を使用して、FAIMS補正電圧に基づいて元のファイルを分割します。
タンパク質の同定と定量。統合された Andromeda 検索エンジンを使用して、元のデータは MaxQuant バージョン 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) を使用して解析されました。Aequorea victoria から得られた Cre リコンビナーゼと YFP 配列に加えて、ペプチド断片スペクトルは、マウス参照プロテオーム (Proteome ID UP000000589、2017 年 5 月に UniProt からダウンロード) の標準配列とアイソフォーム配列について検索されました。メチオニン酸化とタンパク質 N 末端アセチル化は可変修飾として設定され、システインカルバモイルメチル化は固定修飾として設定されました。消化パラメータは「特異性」と「トリプシン/P」に設定されています。タンパク質同定に使用されるペプチドとカミソリペプチドの最小数は 1、ユニークペプチドの最小数は 0 です。ペプチドマップマッチングの条件下では、タンパク質同定率は 0.01 でした。「セカンドペプチド」オプションが有効になっています。異なるオリジナル ファイル間で成功した識別を転送するには、「実行間のマッチング」オプションを使用します。ラベルフリー定量 (LFQ) には、LFQ 最小比率カウント 1 を使用します (60)。LFQ 強度は、各時点の少なくとも 1 つの遺伝子型グループで少なくとも 2 つの有効な値にフィルタリングされ、幅 0.3 の正規分布から外挿され、1.8 下に移動します。LFQ 結果を分析するには、Perseus コンピューティング プラットフォーム (https://maxquant.net/perseus/) と R (https://r-project.org/) を使用します。差次的発現分析には、limma ソフトウェア パッケージの 2 方向中程度の t 検定を使用しました (61)。探索的データ分析は、ggplot、FactoMineR、factoextra、GGally、および pheatmap を使用して実行します。TMT ベースのプロテオミクス データは、MaxQuant バージョン 1.6.10.43 を使用して分析しました。 2018年9月にダウンロードされたUniProtのヒトプロテオミクスデータベースから、生のプロテオミクスデータを検索します。解析には、製造元から提供された同位体純度補正係数が含まれています。差分発現解析には、Rのlimmaを使用します。元のデータ、データベース検索結果、データ解析ワークフローおよび結果はすべて、データセット識別子PXD019690を持つPRIDEパートナーリポジトリを通じて、ProteomeXchangeアライアンスに保存されています。
機能アノテーションは解析を充実させる。Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ツールを使用して、8 週間のデータセットの機能アノテーション用語の豊富さを決定した (図 1)。簡単に言うと、LC-MS/MS (タンデム質量分析) データ解析から得られた定量的タンパク質リストを次のフィルタ基準で使用した: 種と背景として Mus musculus を選択し、カテゴリは Benjamini で調整した P 値が 0.05 以下で有意であるとみなされる。このグラフでは、調整済み P 値に基づいて各クラスターの上位 5 つの過剰カテゴリを示している。多重 t 検定を使用し、Benjamini、Krieger、および Yekutieli (Q = 5%) の 2 段階線形ブーストプログラムを使用して、各カテゴリで特定された重要な候補に対して時系列タンパク質発現解析を実行し、各行を個別に解析した。一貫した SD を採用する必要はない。
この研究の結果を公表されているデータベースと比較し、図 1 のベン図を作成するために、定量的タンパク質リストと MitoCarta 2.0 アノテーション (24) を組み合わせました。オンライン ツール Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) を使用して図を作成します。
プロテオミクス解析に使用した統計的手法に関する詳細は、「材料と方法」の該当セクションを参照してください。その他の実験については、それぞれの凡例に詳細情報が記載されています。特に明記されていない限り、すべてのデータは平均値±標準誤差（SEM）で表され、すべての統計解析はGraphPad Prism 8.1.2ソフトウェアを使用して実施しました。
本記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 を参照してください。
これは、クリエイティブ・コモンズ表示-非営利ライセンスの条件に基づいて配布されるオープンアクセス記事です。このライセンスは、最終的な使用が商業的利益を目的とせず、元の作品が正しいことを前提として、あらゆる媒体での使用、配布、複製を許可します。参考文献。
注：メールアドレスの入力をお願いするのは、あなたがこのページを紹介した相手に、あなたがそのメールを見てもらいたいと思っており、スパムメールではないことを知らせるためだけです。メールアドレスを収集することはありません。
この質問は、あなたが訪問者であるかどうかを確認し、自動スパム送信を防ぐために使用されます。
E. Motori、I. Atanassov、SMV Kochan、K. Folz-Donahue、V. Sakthivelu、P. Giavalisco、N. Toni、J. Puyal、N.-G.ラーソン
機能不全に陥ったニューロンのプロテオミクス解析により、神経変性を抑制するために代謝プログラムが活性化されていることが明らかになった。
E. Motori、I. Atanassov、SMV Kochan、K. Folz-Donahue、V. Sakthivelu、P. Giavalisco、N. Toni、J. Puyal、N.-G.ラーソン
機能不全に陥ったニューロンのプロテオミクス解析により、神経変性を抑制するために代謝プログラムが活性化されていることが明らかになった。
©2020 米国科学進歩協会。無断転載を禁じます。 AAAS は、HINARI、AGORA、OARE、CHORUS、CLOCKSS、CrossRef、COUNTER のパートナーです。サイエンスアドバンス ISSN 2375-2548。