現在 *現在の住所: ケルン 50931、ドイツ、ケルン エクセレンス クラスター 老化関連疾患における細胞ストレス応答に関する研究 (CECAD)。
ミトコンドリア疾患による神経変性は、ニューロンの代謝可塑性が限られているため不可逆的であると考えられていますが、ミトコンドリア機能不全が体内のニューロン代謝の細胞自律性に及ぼす影響は十分に解明されていません。本稿では、ミトコンドリア融合ダイナミクスの破綻によって引き起こされる進行性OXPHOS欠損を伴うプルキンエ細胞の細胞特異的プロテオームを紹介します。ミトコンドリア機能不全がプロテオミクス分野に大きな変化をもたらし、最終的には細胞死の前に精密な代謝プログラムが順次活性化されることが分かりました。予想外にも、TCA回路の中間体を補うピルビン酸カルボキシラーゼ（PCx）やその他の抗老化酵素が明らかに誘導されていることがわかりました。PCx阻害は酸化ストレスと神経変性を悪化させ、アテローム性動脈硬化がOXPHOSを欠損するニューロンで保護効果を持つことを示唆しています。末期変性したニューロンにおけるミトコンドリア融合の回復は、これらの代謝特性を完全に逆転させ、細胞死を予防します。私たちの研究結果は、ミトコンドリア機能不全に対する回復力を付与するこれまで知られていなかった経路を特定し、疾患の後期段階においても神経変性を回復できることを示しました。
神経エネルギー代謝の維持におけるミトコンドリアの中心的な役割は、ヒトのミトコンドリア疾患に関連する広範な神経学的症状によって強調されています。これらの疾患のほとんどは、ミトコンドリア遺伝子発現を制御する遺伝子変異 (1, 2) またはミトコンドリアダイナミクスに関連する遺伝子破壊によって引き起こされ、これらは間接的にミトコンドリアDNA (mtDNA) の安定性に影響を及ぼします (3, 4)。動物モデルの研究では、周辺組織のミトコンドリア機能不全に反応して、保守的な代謝経路 (5-7) が活性化されることが示されており、これはこれらの複雑な疾患の病因を深く理解するための重要な情報を提供します。これとは対照的に、脳のミトコンドリアアデノシン三リン酸 (ATP) 産生の全体的な不全によって引き起こされる特定の細胞タイプの代謝変化に関する理解は基礎的であり (8)、疾患の予防または防止に使用できる治療標的を特定する必要性を強調しています。神経変性を予防します (9)。情報不足の原因は、神経細胞は周囲の組織の細胞種と比較して、代謝の柔軟性が非常に限られていると広く考えられていることです(10)。これらの細胞は、シナプス伝達を促進し、損傷や疾患に反応するために、ニューロンへの代謝物の供給を調整する中心的な役割を担っているため、脳組織の厳しい条件に細胞代謝を適応させる能力は、ほぼグリア細胞に限られています(11-14)。さらに、脳組織に固有の細胞の多様性は、特定のニューロンサブグループで起こる代謝変化の研究を大きく妨げています。その結果、ニューロンにおけるミトコンドリア機能不全が細胞および代謝に及ぼす正確な影響についてはほとんど分かっていません。
ミトコンドリア機能不全の代謝的影響を理解するため、ミトコンドリア外膜融合タンパク質（Mfn2）の破壊によって引き起こされる神経変性の様々な段階にあるプルキンエ細胞（PN）を単離した。ヒトにおけるMfn2変異は、シャルコー・マリー・トゥース病2A型として知られる遺伝性運動感覚神経障害（15）と関連しているが、マウスにおけるMfn2の条件付き破壊は、酸化リン酸化（OXPHOS）誘導による機能不全のよく知られた誘導法である。様々なニューロンサブタイプ（16-19）と、それに伴う神経変性表現型は、運動障害（18, 19）や小脳失調症（16）などの進行性の神経症状を伴う。ラベルフリー定量（LFQ）プロテオミクス、メタボロミクス、イメージング、およびウイルス学的手法を組み合わせて使用​​することで、進行性神経変性がピルビン酸カルボキシラーゼ（PCx）およびPNの動脈硬化に関与する他の因子をin vivoで強く誘導することを示しています。酵素の発現。この発見の関連性を検証するために、Mfn2欠損PNでのPCxの発現を特異的にダウンレギュレーションし、この操作が酸化ストレスを悪化させ、神経変性を加速することを発見しました。これにより、無精子症が細胞死をもたらすことが証明されました。代謝適応性。MFN2の重度の発現は、重度のOXPHOS欠乏、ミトコンドリアDNAの大量消費、明らかに壊れたミトコンドリアネットワークを伴う末期変性PNを完全に救済することができ、これはさらに、この形式の神経変性が細胞死前の病気の進行段階でも回復できることを強調しています。
Mfn2 ノックアウト PN のミトコンドリアを可視化するために、Cre 依存性ミトコンドリアが黄色蛍光タンパク質 (YFP) (mtYFP) (20) Cre 発現を標的とすることを可能にするマウス系統を使用し、in vivo でミトコンドリアの形態を調べた。PN での Mfn2 遺伝子の破壊により、ミトコンドリア ネットワークが徐々に分裂することがわかり (図 S1A)、最も早い変化は 3 週齢で確認された。対照的に、カルビンジン免疫染色の消失によって証明されるように、PN 細胞層の大幅な変性は 12 週齢まで開始されなかった (図 1、A および B)。ミトコンドリアの形態の最も早い変化と神経細胞死の目に見える開始との間の時間的不一致から、細胞死前のミトコンドリア機能不全によって引き起こされる代謝変化を調べることとなった。我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）ベースの戦略を開発し、YFP（YFP+）発現PN（図1C）およびコントロールマウス（Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre）（以下、CTRLと表記）を単離しました（図S1B）。 YFPシグナルの相対的強度に基づくゲーティング戦略の最適化により、PNのYFP+本体（YFPhigh）を非PN（YFPneg）（図S1B）または推定蛍光軸索/樹状突起断片（YFPlow、図S1D、左）から精製することができ、共焦点顕微鏡で確認しました（図S1D、右）。 分類された集団の同一性を検証するために、LFQプロテオミクスを実施し、次に主成分分析を実施したところ、YFPhigh細胞とYFPneg細胞は明確に分離していることがわかりました（図S1C）。 YFPhigh 細胞では、既知の PN マーカー (Calb1、Pcp2、Grid2、Itpr3 など) が正味で濃縮されていましたが (21、22)、ニューロンや他の細胞型で一般的に発現しているタンパク質は濃縮されていませんでした (図 1D) 。 分類された YFPhigh 細胞の独立した実験で収集されたサンプル間の比較では、相関係数が 0.9 を超えており、生物学的反復間の再現性が良好であることが示されました (図 S1E)。 まとめると、これらのデータは、実行可能な PN を急性かつ特異的に分離するための計画を検証しました。 使用した L7-cre ドライバー システムは、配信後 1 週間でモザイク組換えを誘発するため (23)、CTRL からマウスを選別し、条件付き (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ニューロンを収集し始めました。エンドポイントとして、明らかなミトコンドリアの断片化にもかかわらず PN 層が無傷であった 8 週齢を選択しました (図 1B および図 S1A)。合計で 3013 個のタンパク質を定量しましたが、そのうち約 22% はミトコンドリアプロテオームに基づく MitoCarta 2.0 アノテーションに基づいてミトコンドリアと分類されました (図 1E) (24)。8 週目に実施した差次的遺伝子発現解析では、すべてのタンパク質の 10.5% のみに有意な変化が見られ (図 1F および図 S1F)、そのうち 195 個のタンパク質がダウンレギュレーションされ、120 個のタンパク質がアップレギュレーションされました (図 1F)。このデータセットの「革新的なパスウェイ解析」では、差次的に発現した遺伝子が主に特定の代謝経路の限定されたセットに属していることが示されていることは注目に値します (図 1G)。興味深いことに、OXPHOS およびカルシウムシグナル伝達に関連する経路のダウンレギュレーションにより、融合欠損 PN におけるミトコンドリア機能障害の誘発が確認されますが、主にアミノ酸代謝に関係する他のカテゴリは大幅にアップレギュレーションされており、これはミトコンドリア PN で発生する代謝と一致しています。再配線は機能障害と一致しています。
(A) CTRL マウスと Mfn2cKO マウスの小脳切片の代表的な共焦点写真。PN (カルビンジン、灰色) の進行性喪失が見られます。核は DAPI で対比染色されています。(B) (A) の定量化 (一元配置分散分析、***P<0.001、n = 3 匹のマウスからの 4 ～ 6 つの円)。(C) 実験ワークフロー。(D) プルキンエ細胞 (上) と他の細胞タイプ (中央) に固有のマーカーのヒートマップ分布。(E) 分類された PN で特定されたミトコンドリアタンパク質の数を示すベン図。(F) 8 週目の Mfn2cKO ニューロンで差次的に発現したタンパク質のボルケーノプロット (有意性カットオフ値 1.3)。(G) 創造性パスウェイ分析では、8 週目と分類された Mfn2cKO PN における 5 つの最も重要なアップレギュレーション (赤) およびダウンレギュレーション (青) パスウェイが示されています。検出された各タンパク質の平均発現レベルを示します。グレースケールヒートマップ：調整済みP値。ns、重要ではありません。
プロテオミクスデータは、複合体I、III、およびIVのタンパク質発現が徐々に減少することを示した。複合体I、III、およびIVはすべて必須のmtDNAコードサブユニットを含んでいたが、核コードのみの複合体IIは基本的に影響を受けなかった（図2Aおよび図S2A）。プロテオミクスの結果と一致して、小脳組織切片の免疫組織化学は、PNの複合体IVのMTCO1（ミトコンドリアシトクロムC酸化酵素サブユニット1）サブユニットレベルが徐々に減少することを示した（図2B）。mtDNAコードサブユニットMtatp8は大幅に減少したが（図S2A）、核コードATP合成酵素サブユニットの定常状態レベルは変化せず、これはmtDNA発現が安定している場合の既知の安定したATP合成酵素サブアセンブリF1複合体と一致している。形成は一貫している。中断（7）。選別されたMfn2cKO PNのmtDNAレベルをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）で評価したところ、mtDNAコピー数が徐々に減少していることが確認されました。対照群と比較して、8週齢ではmtDNAレベルの約20%しか保持されていませんでした（図2C）。これらの結果と一致して、Mfn2cKO PNの共焦点顕微鏡染色を使用してDNAを検出し、時間依存的なミトコンドリアヌクレオチドの消費を示しました（図2D）。ミトコンドリアタンパク質分解とストレス応答に関与する候補の一部、Lonp1、Afg3l2、Clpx、OXPHOS複合体アセンブリ因子のみがアップレギュレーションされていることがわかりました。アポトーシスに関与するタンパク質のレベルに有意な変化は検出されませんでした（図S2B）。同様に、カルシウム輸送に関与するミトコンドリアと小胞体チャネルにはわずかな変化しかないことがわかりました（図S2C）。さらに、オートファジー関連タンパク質の評価では有意な変化は認められず、これは生体内で免疫組織化学および電子顕微鏡検査によって観察されたオートファゴソームの可視的な誘導と一致しています（図S3）。しかし、PNにおける進行性のOXPHOS機能不全は、ミトコンドリアの明らかな超微細構造変化を伴います。5週齢および8週齢のMfn2cKO PNでは、細胞体および樹状突起にミトコンドリアクラスターが見られ、内膜構造に大きな変化が見られます（図S4、AおよびB）。これらの超微細構造変化およびmtDNAの有意な減少と一致して、テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）を用いた急性期大脳小脳切片の解析により、Mfn2cKO PNのミトコンドリア膜電位が有意に低下していることが示されました（図S4C）。
(A) OXPHOS複合体の発現レベルの経時的解析。8週時点でP<0.05のタンパク質のみを考慮（二元配置分散分析）。点線：CTRLと比較して調整なし。（B）左：抗MTCO1抗体で標識した小脳切片の例（スケールバー、20μm）。プルキンエ細胞体が占める領域は黄色で覆われている。右：MTCO1レベルの定量（一元配置分散分析、3匹のマウスからn = 7～20個の細胞を解析）。（C）ソートされたPNにおけるmtDNAコピー数のqPCR解析（一元配置分散分析、n = 3～7匹のマウス）。（D）左：抗DNA抗体で標識した小脳スライスの例（スケールバー、20μm）。プルキンエ細胞体が占める領域は黄色で覆われている。右：mtDNA損傷の定量化（一元配置分散分析、マウス3匹からn = 5〜9個の細胞）。（E）急性小脳切片の例。全細胞パッチクランプ記録におけるmitoYFP + プルキンエ細胞（矢印）を示しています。（F）IV曲線の定量化。（G）CTRLおよびMfn2cKOプルキンエ細胞における脱分極電流注入の代表的な記録。上のトレース：APをトリガーした最初のパルス。下のトレース：最大AP周波数。（H）シナプス後自発入力（sPSP）の定量化。代表的な記録トレースとそのズーム比は（I）に示されています。一元配置分散分析では、マウス3匹からn = 5〜20個の細胞を解析しました。データは平均±SEMとして表されます；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。 (J) 穿孔パッチクランプ法を用いて記録された自発性APの代表的な波形。上の波形：最大AP頻度。下の波形：単一APの拡大図。(K) (J)に従って平均および最大AP頻度を定量化する。マン・ホイットニー検定；4匹のマウスからn = 5個の細胞を解析した。データは平均値±標準誤差（SEM）として表され、有意差はない。
8週齢のMfn2cKO PNで明らかなOXPHOS損傷が検出され、ニューロンの生理機能が重篤に異常であることが示唆されました。そこで、急性小脳切片で全細胞パッチクランプ記録を実施することにより、4～5週および7～8週のOXPHOS欠損ニューロンの受動的な電気特性を分析しました（図2E）。予想外にも、Mfn2cKOニューロンの平均静止膜電位と入力抵抗は、細胞間に微妙な差があったものの、対照と同様でした（表1）。同様に、4～5週齢では、電流-電圧関係（IV曲線）に有意な変化は認められませんでした（図2F）。しかし、7～8週齢のMfn2cKOニューロンはいずれもIVレジメン（過分極ステップ）を生き延びず、この後期段階では過分極電位に対する明らかな感受性があることを示しました。対照的に、Mfn2cKOニューロンでは、反復活動電位（AP）放電を引き起こす脱分極電流は耐容性が高く、全体的な放電パターンは8週齢のコントロールニューロンと有意に異ならないことを示しています（表1および図2G）。同様に、自発シナプス後電流（sPSC）の頻度と振幅はコントロール群と同等であり、イベントの頻度は4週から5週、7週、8週へと同様に増加しました（図2、HおよびI）。PNにおけるシナプス成熟の期間（25）。同様の結果は、穿孔PNパッチの後にも得られました。この構成により、全細胞パッチクランプ記録で発生する可能性のある細胞ATP欠陥の補償が防止されます。特に、Mfn2cKOニューロンの静止膜電位と自発発火頻度は影響を受けませんでした（図2、JおよびK）。要約すると、これらの結果は、明らかな OXPHOS 機能不全を伴う PN が高周波放電パターンにうまく対処できることを示しており、ほぼ正常な電気生理学的応答を維持できるようにする補償メカニズムが存在することを示しています。
データは平均値±SEM（一元配置分散分析、Holm-Sidakの多重比較検定；*P<0.05）として表される。単位数は括弧内に示されている。
我々は、プロテオミクスデータセット（図1G）のいずれかのカテゴリーに、重度のOXPHOS欠乏を打ち消すことができる経路が含まれているかどうか、それによって、影響を受けたPNがほぼ正常な電気生理学を維持できる理由を説明できるかどうかを調べることにした（図2、E～K）。 プロテオミクス解析により、分岐鎖アミノ酸（BCAA）の分解に関与する酵素が大幅に上方制御され（図3Aおよび図S5A）、最終生成物のアセチルCoA（CoA）またはスクシニルCoAが動脈硬化性酸（TCA）サイクルでトリカルボン酸を補充できることが示された。 BCAAトランスアミナーゼ1（BCAT1）とBCAT2の含有量が両方とも増加していることがわかった。 これらは、α-ケトグルタル酸からグルタミン酸を生成することによって、BCAA分解の最初のステップを触媒する（26）。分岐鎖ケト酸脱水素酵素（BCKD）複合体を構成するすべてのサブユニットがアップレギュレーションされています（複合体は、結果として生じるBCAA炭素骨格の後続の不可逆的な脱炭酸を触媒します）（図3Aおよび図S5A）。ただし、分類されたPNではBCAA自体に明らかな変化は見られませんでした。これは、これらの必須アミノ酸の細胞内取り込みの増加、またはTCAサイクルを補うための他の供給源（グルコースまたは乳酸）の使用による可能性があります（図S5B）。OXPHOSを欠くPNは、8週齢でグルタミン分解およびアミノ基転移活性の増加も示しており、これはミトコンドリア酵素グルタミナーゼ（GLS）およびグルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ2（GPT2）のアップレギュレーションに反映されます（図3、AおよびC）。注目すべきは、GLSの上方制御はスプライスされたアイソフォームグルタミナーゼC（GLS-GAC）に限定されており（Mfn2cKO / CTRLの変化は約4.5倍、P = 0.05）、癌組織におけるその特異的な上方制御はミトコンドリアのバイオエネルギーをサポートできることである。（27）。
(A) ヒートマップは、8週間時点での指定経路におけるタンパク質レベルの倍数変化を示しています。(B) 抗PCx抗体で標識した小脳切片の例（スケールバー、20μm）。黄色の矢印はプルキンエ細胞体を指しています。(C) アテローム性動脈硬化症の重要な候補として特定されたタンパク質発現の経時的解析（多重t検定、*FDR <5%、n = 3-5匹のマウス）。(D) 上：[1-13C]ピルビン酸トレーサーに含まれる標識炭素を入力するさまざまな方法（PDHまたは経動脈経路経由）を示す模式図。下：バイオリンチャートは、急性小脳切片を[1-13C]ピルビン酸で標識した後、単一標識炭素（M1）がアスパラギン酸、クエン酸、リンゴ酸に変換された割合を示しています（対応のあるt検定、** P <0.01）。 (E) 示された経路の包括的な時系列解析。8週時点でP<0.05のタンパク質のみを考慮。破線：調整値なし（二元配置分散分析；* P<0.05；*** P<0.001）。データは平均±SEMとして表される。
我々の解析では、BCAA分解が重要なアップレギュレーション経路の一つとなっている。この事実は、OXPHOSを欠損するPNではTCAサイクルに入る換気量が変化する可能性があることを強く示唆している。これはニューロンの代謝再配線の主要な形態を表している可能性があり、重度のOXPHOS機能不全が維持されている間、ニューロンの生理機能と生存に直接的な影響を及ぼす可能性がある。この仮説と一致して、主要な抗動脈硬化酵素PCxがアップレギュレーションされている（Mfn2cKO/CTRLは約1.5倍に変化；図3A）ことを発見した。PCxはピルビン酸からオキサロ酢酸への変換を触媒する（28）。オキサロ酢酸は脳組織に存在すると考えられている。PCxの発現はアストロサイトに限定されている（29, 30）。プロテオミクスの結果と一致して、共焦点顕微鏡検査により、PCx発現はOXPHOS欠損PNで特異的かつ有意に増加しているのに対し、PCx反応性は主に対照の隣接するベルクマングリア細胞に限定されていることが示された（図3B）。観察されたPCxの上方制御を機能的に試験するために、急性小脳切片を[1-13C]ピルビン酸トレーサーで処理した。ピルビン酸がピルビン酸脱水素酵素（PDH）によって酸化されると、その同位体標識は消失したが、ピルビン酸が血管反応によって代謝されると、TCA回路中間体に組み込まれる（図3D）。プロテオミクスデータを裏付けるように、Mfn2cKO切片のアスパラギン酸でこのトレーサーからのマーカーが多数観察されたが、クエン酸とリンゴ酸にも有意ではないものの中程度の傾向が見られた（図3D）。
ドーパミンニューロンがミトコンドリア転写因子A遺伝子（Tfam）を特異的に破壊することによりミトコンドリア機能不全を呈するMitoParkマウスのドーパミンニューロンでは（図S6B）、PCx発現も有意に上昇しており（31）、アセトン酸性動脈硬化症の発症は体内のニューロンOXPHOSの機能不全によって制御されていることを示しています。注目すべきことに、動脈硬化に関連する可能性のあるニューロンで発現している可能性のある特異な酵素（32-34）が、OXPHOS欠損のPNにおいて有意に増加していることが発見されました。例えば、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ（PCC-A）、プロピオニルCoAをスクシニルCoAに変換するマロニルCoA、そしてリンゴ酸からピルビン酸を回収することを主な役割とするミトコンドリアリンゴ酸酵素3（ME3）などが挙げられます（図3AおよびC）（33, 35）。さらに、PDHをリン酸化して不活性化するPdk3酵素の有意な増加も発見されました（36）。一方、PDHを活性化するPdp1酵素やPDH酵素複合体自体には変化は見られませんでした（図3A）。 Mern2cKO PNでは、PDH複合体を構成するピルビン酸脱水素酵素E1のα1サブユニット（PDHE1α）のSer293（PDHの酵素活性を阻害することが知られている）のリン酸化が一貫して亢進していた（図S6C）。ピルビン酸は血管から輸送されない。
最後に、セリンおよびグリシン生合成のスーパーパスウェイ、関連するミトコンドリア葉酸（1C）サイクル、およびプロリン生合成（図1Gおよび図S5C）は、報告によると、活性化プロセス中にすべて有意にアップレギュレーションされることを発見しました。周囲の組織はミトコンドリア機能不全によって活性化されます（5-7）。これらのプロテオミクスデータを裏付ける共焦点解析により、OXPHOS欠損PNにおいて、8週齢マウスの小脳切片をミトコンドリア葉酸サイクルの主要酵素であるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ2（SHMT2）に曝露したところ、顕著な免疫応答が認められました（図S5D）。 CU-グルコースでインキュベートした急性小脳切片13枚において、代謝追跡実験によりセリンおよびプロリン生合成の上昇がさらに確認され、セリンおよびプロリンへの炭素アイソフォームのフラックスが増加したことが示唆された（図S5E）。GLSおよびGPT2によって促進される反応は、グルタミンからグルタミン酸の合成、およびグルタミン酸とα-ケトグルタル酸間のアミノ基転移を担っているため、これらの上昇はOXPHOS欠損ニューロンにおけるグルタミン酸需要の増加を示唆しており、これはプロリン生合成の増加を維持することを目的としている可能性がある（図S5C）。これらの変化とは対照的に、PN特異的Mfn2cKOマウスの小脳アストロサイトのプロテオーム解析では、これらの経路（すべての抗ペルオキシダーゼを含む）の発現に大きな変化は見られず、この代謝リダイレクトは分解されたPNに選択的であることが実証されました（図S6、D～G）。
要約すると、これらの解析により、PNにおける特定の代謝経路の活性化には有意に異なるパターンが明らかになりました。神経ミトコンドリア機能の異常は、早期のアテローム性動脈硬化症や1Cリモデリング（図3Eおよび図S5C）、さらにはIおよびIV複合体の発現における予測可能な変化につながる可能性がありますが、セリンのde novo合成における変化は後期になって初めて明らかになりました。OXPHOS機能不全（図3Eおよび図S5C）。これらの知見は、ストレス誘導性のミトコンドリア（1Cサイクル）および細胞質（セリン生合成）応答が、TCAサイクルにおけるアテローム性動脈硬化症の増加と相乗的に作用し、神経代謝を再構築するという一連のプロセスを明確に示しています。
8 週齢の OXPHOS 欠損 PN は、高頻度の興奮活動を維持し、ミトコンドリアの機能不全を補うために大幅な代謝再接続を受けることができます。この発見は、この時点でもこれらの細胞が神経変性を遅らせたり予防したりするための治療介入を受ける可能性があるという興味深い可能性を提起します。後期。私たちはこの可能性を 2 つの独立した介入によって解決しました。最初の方法では、Cre 依存性アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターを設計し、MFN2 を in vivo で OXPHOS 欠損 PN に選択的に発現できるようにしました (図 S7A)。MFN2 をコードする AAV と蛍光レポーター遺伝子 mCherry (Mfn2-AAV) は、in vitro の一次ニューロン培養で検証され、これにより MFN2 が Cre 依存的に発現され、ミトコンドリアの形態が回復し、それによって Mfn2cKO ニューロンにおける神経変異が防止されました (図 S7、B、D、E)。次に、8週齢のMfn2-AAVをMfn2cKOマウスとコントロールマウスの小脳皮質に定位的に送達するin vivo実験を行い、12週齢のマウスを解析した（図4A）。処置されたMfn2cKOマウスは死亡した（図1、AとB）（16）。 in vivoでのウイルス形質導入により、一部の小脳輪でPNが選択的に発現した（図S7、GとH）。mCherryのみを発現するコントロールAAV（Ctrl-AAV）の注射は、Mfn2cKO動物の神経変性の程度に有意な影響を与えなかった。対照的に、Mfn2-AAVを導入したMfn2cKOの解析では、PN細胞層の有意な保護効果が示された（図4、BとC）。特に、ニューロン密度はコントロール動物とほとんど区別がつかないようである（図4、BとC、図S7、HとI）。 MFN1の発現は神経細胞死の救済に同等に効果的であるが、MFN2の発現はそうではない（図4Cおよび図S7、CおよびF）。これは、異所性MFN1の発現がMFN2の不足を効果的に補えることを示している。単一PNレベルでのさらなる分析は、Mfn2-AAVがミトコンドリアの超微細構造を大幅に救済し、mtDNAレベルを正常化し、抗血管新生マーカーPCxの高発現を逆転させたことを示しました（図4、C〜E）。救済されたMfn2cKOマウスを安静時に視覚的に検査したところ、姿勢と運動症状（運動S1〜S3）が改善していることが示されました。結論として、これらの実験は、OXPHOSが重度に欠損しているPNへのMFN2の遅延再導入が、mtDNAの消費を逆転させてアテローム性動脈硬化を誘発するのに十分であり、それによって生体内での軸索変性と神経細胞死を防ぐことを示しています。
(A) 示された代謝経路が活性化されたときに MFN2 をコードする AAV を注入するための実験スケジュールを示す図。 (B) 8 週齢の Mfn2cKO マウスに形質導入され、抗カルビンジン抗体で標識された 12 週齢の小脳スライスの代表的な共焦点画像。右: 軸索繊維のスケーリング。軸索ズームのスケールは 450 μm と 75 μm です。(C) 左: AAV 導入ループ (AAV+) におけるプルキンエ細胞密度の定量化 (一元配置分散分析、n = 3 匹のマウス)。右: 12 週目に形質導入された PN における mtDNA フォーカス分析 (無対 t 検定、n = 3 匹のマウスからの 6 個の細胞)。* P <0.05、** P <0.01。(D) 示されたウイルスベクターを導入した Mfn2cKO 小脳切片の PN の代表的な透過型電子顕微鏡写真。ピンク色のマスクは樹状突起が占める領域を示し、黄色の点線の四角は右側の拡大図を示しています。nは核を表します。スケールバーは1μmです。(E)は、12週目に導入したPNにおけるPCx染色の例を示しています。スケールバーは20μmです。OE：過剰発現、FC：倍率変化。
最後に、OXPHOS機能不全を経験したPNにおけるペルオキシダーゼ誘導性細胞生存の重要性を調査した。マウスPCx mRNAを特異的に標的とするAAV-shRNA（ショートヘアピンRNA）をコードするmCherry（AAV-shPCx）を作製し、ウイルスまたはそのスクランブルコントロール（AAV-scr）をMfn2cKOマウスの小脳に注入した。注入は生後4週目に実施し（図5A）、PCx発現が増加する期間（図3C）とPN細胞層がまだ無傷である期間（図1A）に効果的なPCxノックダウンを達成した。PCxノックダウン（図S8A）はPN細胞死を有意に加速させ、それが感染リングに限定されることは注目に値する（図5、BおよびC）。 PCxの上方制御によって誘発される代謝効果のメカニズムを理解するために、PCxノックダウンおよびAAV媒介光バイオセンサーGrx1-roGFP2を同時に発現させた後のPNの酸化還元状態を調べ（図S8、B〜D）、グルタチオンペプチドの酸化還元電位の相対的変化を評価しました（38）。次に、7週齢のMfn2cKOまたはコントロール同腹仔の急性脳切片で二光子蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）を実施し、FLIM条件を確認した後の細胞質酸化還元状態の電位変化を検出しました（図S8、E〜G）。分析により、PCx発現を欠く単一のMfn2cKO PNの酸化状態の有意な増加が示され、これはコントロールニューロンまたはスクランブルshRNAのみを発現するMfn2cKO PNとは異なります（図5、DおよびE）。 PCx の発現がダウンレギュレーションされると、高度に酸化された状態を示す Mfn2cKO PN の割合が 3 倍以上増加しました (図 5E)。これは、PCx のアップレギュレーションによって変性ニューロンの酸化還元能力が維持されたことを示しています。
(A) 示された代謝経路が活性化されたときに shPCx をコードする AAV を注入するための実験スケジュールを示す図。 (B) 4 週目に抗カルシニューリン抗体で形質導入および標識した Mfn2cKO マウスの 8 週齢の小脳切片の代表的な共焦点写真。スケールバー、450 μm。(C) AAV 導入ループにおけるプルキンエ細胞密度の定量化 (一元配置分散分析、n = 3 ～ 4 匹のマウス)。データは平均±SEM として表されます。***P<0.001。(D) 指定された実験条件下でグルタチオン酸化還元センサー Grx1-roGFP2 を発現する 7 週齢の PN の平均寿命を示す代表的な FLIM 画像。LUT (ルックアップ テーブル) 比: 生存時間間隔 (ピコ秒単位)。スケールバー、25 μm。 (E) ヒストグラムは、(D) のGrx1-roGFP2 の寿命値の分布を示しています（各条件で2匹のマウス、n=158～368個の細胞）。各ヒストグラムの上部にある円グラフは、CTRL-AAV-scr における平均寿命値の1 SD を超える、有意に長い（赤、酸化）または短い（青、還元）寿命値を持つ細胞の数を示しています。(F) 提案モデルは、神経細胞のPCxの上方制御による保護効果を示しています。
総じて、本データから、MFN2の再発現は、重度のOXPHOS欠損、重度のmtDNA枯渇、そして極めて異常なイスタ様形態を伴う進行期PNを完全に救済し、進行期においても継続的な治療効果をもたらすことが示唆されます。神経変性は、細胞死前の段階を可逆的に証明します。この代謝の柔軟性は、ニューロンがアテローム性動脈硬化（TCAサイクルの再配線）を誘導する能力によってさらに強調されます。アテローム性動脈硬化は、OXPHOS欠損PNにおけるPCxの発現を阻害し、細胞死を促進することで保護的な役割を果たします（図5F）。
本研究では、OXPHOS機能不全に対するPNの応答は、代謝プログラムによって活性化される差動活性化経路を介して、TCAサイクルのアテローム性動脈硬化症に徐々に収束することであるという証拠を示しました。 多くの補完的な方法でプロテオーム解析を確認し、重度のミトコンドリア機能不全に苦しむニューロンは、これまで知られていない形の代謝弾力性を示すことを明らかにしました。 驚いたことに、再配線プロセス全体が、必ずしも神経変性に伴う末端代謝状態を徐々に不可逆的に示すわけではありませんが、私たちのデータは、細胞死の前の段階でも維持ニューロンを構成する可能性があることを示唆しています。機能的補償メカニズム。 この発見は、ニューロンが体内でかなりの程度の代謝可塑性を持っていることを示しています。 この事実は、MFN2を後で再導入すると、主要な代謝マーカーの発現が逆転し、PN変性を防ぐことができることを証明しています。 それどころか、アテローム性動脈硬化を抑制し、神経を加速します。 性転換者。
私たちの研究で最も興味深い発見の 1 つは、OXPHOS を欠く PN が、動脈硬化を特異的に促進する酵素を上方制御することにより、TCA 回路の代謝を変更できることです。代謝再編成はがん細胞に共通する特徴で、がん細胞の一部はグルタミンに依存して TCA 回路の中間体を補充し、呼吸鎖を駆動して脂質とヌクレオチドの生合成前駆体の生成を維持する還元当量を生成しています (39 、 40)。最近の研究では、OXPHOS 機能不全を経験している末梢組織では、グルタミン/グルタミン酸代謝の再接続も顕著な特徴であり (5、41)、TCA 回路へのグルタミンの流入方向は、OXPHOS 障害の重症度によって異なります (41)。しかし、体内のニューロンの代謝可塑性の類似性と疾患の状況におけるその関連性に関する明確な証拠はありません。最近の試験管内研究では、一次皮質ニューロンが神経伝達のためにグルタミン酸プールを動員し、それによって代謝ストレス条件下で酸化代謝とアテローム性動脈硬化を促進することが示された (42)。TCA 回路酵素コハク酸脱水素酵素の薬理学的阻害下では、培養小脳顆粒ニューロンにおいてピルビン酸カルボキシル化がオキサロ酢酸の合成を維持すると考えられていることは注目に値する (34)。しかし、これらのメカニズムの脳組織への生理学的関連性 (アテローム性動脈硬化は主にアストロサイトに限定されると考えられている) は、依然として重要な生理学的意義を持っている (43)。この場合、私たちのデータは、体内で OXPHOS によって損傷を受けた PN が、TCA プール中間体の補充の 2 つの主な源である BCAA 分解とピルビン酸カルボキシル化に切り替えることができることを示している。神経伝達におけるグルタミン酸と GABA の役割に加えて、BCAA 分解が神経エネルギー代謝に寄与するという考えが提唱されているものの (44)、これらのメカニズムを生体内で証明するものはまだありません。そのため、機能不全の PN が、同化プロセスによって引き起こされる TCA 中間体の消費を、動脈硬化を増加させることで自動的に補うことができると推測するのは簡単です。特に、ミトコンドリア機能不全を伴う増殖細胞で示唆されているアスパラギン酸の需要増加を維持するためには、PCx の上方制御が必要である可能性があります (45)。しかし、私たちのメタボロミクス解析では、Mfn2cKO PN におけるアスパラギン酸の定常状態レベルに有意な変化は見られませんでした (図 S6A)。これは、おそらく増殖細胞と有糸分裂後のニューロン間でのアスパラギン酸の代謝利用の違いを反映していると考えられます。生体内で機能不全ニューロンにおけるPCxの上方制御の正確なメカニズムはまだ解明されていないが、この早期反応がニューロンの酸化還元状態維持に重要な役割を果たしていることを我々は実証しており、これは小脳切片を用いたFLIM実験で実証されている。特に、PNによるPCxの上方制御を阻害すると、より酸化された状態が促進され、細胞死が促進される可能性がある。BCAA分解の活性化とピルビン酸のカルボキシル化は、ミトコンドリア機能不全の末梢組織を特徴づけるものではない(7)。したがって、これらはOXPHOS欠損ニューロンの唯一の特徴ではないとしても、神経変性において重要な重要な特徴であると考えられる。
小脳疾患は、通常、運動失調として発現し、しばしばPNを損傷する、不均一なタイプの神経変性疾患です（46）。このニューロン集団は、マウスにおける選択的な変性が、ヒト脊髄小脳失調症を特徴付ける多くの運動症状を再現するのに十分であるため、ミトコンドリア機能不全に対して特に脆弱です（16、47、48）。報告によると、変異遺伝子を持つトランスジェニックマウスモデルは、ヒト脊髄小脳失調症と関連しており、ミトコンドリア機能不全を有しています（49、50）。これは、PNPHにおけるOXPHOS欠損の影響を研究することの重要性を強調しています。したがって、この独特なニューロン集団を効果的に単離して研究することは特に適しています。しかし、PNは圧力に非常に敏感であり、小脳細胞集団全体の割合が低いことを考えると、多くのオミックスに基づく研究にとって、それらを細胞全体として選択的に分離することは依然として困難な側面です。他の細胞タイプ（特に成体組織）の混入を完全に排除することはほぼ不可能ですが、我々は効果的な解離ステップとFACSを組み合わせて、下流のプロテオミクス分析に十分な数の生存ニューロンを取得し、小脳全体の既存のデータセット（51）と比較して非常に高いタンパク質カバレッジ（約3000タンパク質）を実現しました。細胞全体の生存率を維持することにより、ここで提供する方法は、ミトコンドリアの代謝経路の変化を確認するだけでなく、その細胞質対応物の変化も確認することを可能にし、これは、ミトコンドリア膜タグを使用して細胞タイプを濃縮する新しい方法と相補的です。複雑な組織中のミトコンドリアの数を調べるための新しい方法（52、53）。ここで説明する方法は、プルキンエ細胞の研究に関連しているだけでなく、ミトコンドリア機能不全の他のモデルを含む、病気の脳の代謝変化に対処するためにあらゆる種類の細胞に簡単に適用できます。
最後に、この代謝再編成プロセスにおいて、細胞ストレスの主要な兆候を完全に逆転させ、神経変性を防ぐことができる治療の窓を特定しました。したがって、ここで説明した再配線の機能的意味を理解することは、ミトコンドリア機能不全時の神経細胞の生存能力を維持するための治療法の可能性に関する根本的な知見をもたらす可能性があります。この原理が他の神経疾患にも適用可能であることを完全に明らかにするためには、他の脳細胞種におけるエネルギー代謝の変化を解明することを目的とした今後の研究が必要です。
MitoParkマウスについては既に報告されている（31）。Mfn2遺伝子をloxPで挟むC57BL/6Nマウスについては既に報告されている（18）。このマウスはL7-Creマウスと交配されている（23）。得られた二重ヘテロ接合体の子孫は、ホモ接合体のMfn2loxP/Mfn2loxPマウスと交配され、プルキンエ特異的にMfn2遺伝子ノックアウト（Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre）が作製された。交配のサブセットでは、追加の交配によりGt（ROSA26）SorStop-mito-YFPアレル（stop-mtYFP）が導入された（20）。すべての動物実験は、欧州、国、および機関のガイドラインに従って実施され、ドイツのノルトライン＝ヴェストファーレン州環境・環境保護省（LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz）の承認を得ている。動物実験は、欧州実験動物学会連合のガイドラインにも従います。
妊婦の頸椎脱臼を麻酔した後、マウス胚（E13）を単離する。皮質を10 mM Hepesを添加したハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で解剖し、パパイン（20 U/ml）およびシステイン（1μg/ml）を含むダルベッコ改変イーグル培地に継代した。組織をDMEMで培養し、酵素消化により解離させた。ML）を37℃で20分間インキュベートした後、10%ウシ胎児血清を添加したDMEMで機械的に粉砕した。細胞は、ポリリジンでコーティングしたガラスカバースリップ上に、6 cm培養皿あたり2×106個、または画像解析用に0.5×105個/cm2の密度で播種した。 4時間後、培地を1% B27サプリメントおよび0.5 mM GlutaMaxを含むNeurobasal無血清培地に交換した。実験期間中、ニューロンは37℃、5% CO2で維持し、週に1回栄養補給を行った。in vitro組換えを誘導するために、in vitro 2日目に、以下のAAV9ウイルスベクターを3μl（24ウェル培養ディッシュ）または0.5μl（24ウェルプレート）用いてニューロンを処理した：AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH（Addgene、カタログ番号105530-AAV9）およびAAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40（Addgene、カタログ番号105545-AAV9）。
マウスMfn1およびMfn2相補DNA（それぞれAddgeneプラスミド#23212および#23213から取得）は、C末端にV5配列（GKPIPNPLLGLDST）が付与され、T2A配列を介してmCherryとインフレームで融合されています。Grx1-roGFP2は、ハイデルベルクのTP Dick DFKZ（ドイツ・クレブス研究所）から提供されたものです。従来のクローニング法を用いてtdTomatoカセットを置換し、pAAV-CAG-FLEX-tdTomatoバックボーン（Addgene参照番号28306）にサブクローニングすることで、pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5、pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5、およびpAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2ベクターを作製しました。同様の戦略を用いて、コントロールベクターpAAV-CAG-FLEX-mCherryを作製しました。AAV-shPCxコンストラクトを作製するには、マウスPCxを標的とするshRNAをコードするDNA配列（5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′）を含むプラスミドAAVベクター（VectorBuilder、pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]）が必要です。U6プロモーターの制御下では、CMVプロモーターの制御下でmCherryが使用されています。補助AAVベクターの作製は、製造元（Cell Biolabs）の指示に従って行いました。簡単に説明すると、mCherry-T2A-MFN2-V5（pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5）、mCherry-T2A-MFN1-V5（pAAV-CAG-FLEX-mCherry）を組み込んだトランスファープラスミドを用いて、293AAV細胞（pAAV-CAG-FLEX-mCherry）、mCherry（pAAV-CAG-FLEX-mCherry）、またはGrx-roGFP2（pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2）をコードする遺伝子、ならびにAAV1カプシドタンパク質およびアクセサリータンパク質をコードするプラスミドをリン酸カルシウム法を用いてパッケージングする。粗ウイルス上清はドライアイス／エタノール浴中で凍結融解サイクルによって得られ、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で溶解された。 AAVベクターは、不連続イオジキサノール勾配超遠心分離（32,000 rpm、4℃で24時間）により精製し、Amicon ultra-15遠心フィルターを用いて濃縮した。AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5（2.9×1013ゲノムコピー（GC）/ml）、AAV1-CAG-FLEX-mCherry（6.1×1012 GC/ml）、AAV1-CAG- FLEXのゲノム力価は、以前報告したとおり（54）、リアルタイム定量PCR（qPCR）-MFN1-V5（1.9×1013 GC/ml）、AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2（8.9×1012 GC/ml）により測定した。
一次ニューロンを氷冷した 1x PBS で掻き取り、ペレット化した後、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤 (Roche) を含む 0.5% Triton X-100 / 0.5% デオキシコール酸ナトリウム/PBS 溶解緩衝液でホモジェナイズしました。タンパク質の定量は、ビシンコニン酸アッセイ (Thermo Fisher Scientific) を用いて行いました。次に、タンパク質を SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜 (GE Healthcare) にブロッティングしました。非特異的部位をブロックし、5% ミルクを含む TBST (Tween 添加トリス緩衝生理食塩水) で一次抗体 (詳細は表 S1 を参照) とインキュベートし、洗浄ステップおよび二次抗体を TBST でインキュベートします。一次抗体と +4°C で一晩インキュベートします。その後、同じブロットを抗β-アクチン抗体でインキュベートし、同様のローディングを確認しました。検出は化学発光への変換と化学発光増強（GEヘルスケア）によって行いました。
あらかじめガラスカバーガラス上に播種したニューロンを、指定の時点で4%パラホルムアルデヒド（PFA）/PBSで室温で10分間固定した。カバーガラスは、まず0.1%トリトンX-100/PBSで室温で5分間透過し、次にブロッキングバッファー（3%ウシ血清アルブミン（BSA）/PBS）でブロッキングした。2日目に、カバーガラスをブロッキングバッファーで洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体とともに室温で2時間インキュベートした。最後に、サンプルを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含むPBSで十分に洗浄し、対比染色した後、Aqua-Poly/Mountを用いて顕微鏡スライド上に固定した。
マウス（雄および雌）を、ケタミン（130 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の腹腔内注射により麻酔し、カルプロフェン鎮痛剤（5 mg/kg）を皮下投与した。そして、温熱パッドを備えた定位固定装置（Kopf）に設置した。頭蓋骨を露出させ、歯科用ドリルを用いて、mis骨に対応する小脳皮質の部分を薄くする（ラムダから：尾部1.8、側方1、IV小葉およびV小葉に相当）。湾曲した注射針を用いて、頭蓋骨下部の血管系を損傷しないように慎重に小さな穴を開ける。次に、細く引き伸ばされたガラスキャピラリーを微小孔（硬膜腹側の-1.3から-1）にゆっくりと挿入し、200～300 nlのAAVを手動注射器（ナリシゲ）を用いて、10～20分かけて低圧で数回に分けてマイクロインジェクター（ナリシゲ）に注入します。注入後、キャピラリーをさらに10分間留置し、ウイルスが完全に拡散するのを待ちます。キャピラリーを抜去した後、創傷炎症を最小限に抑え、動物の回復を促すため、皮膚を慎重に縫合します。術後数日間、動物には鎮痛剤（カスポフェン）を投与し、その間、動物の体調を注意深く観察した後、所定の時点で安楽死させました。すべての手順は、欧州、国内、および機関のガイドラインに従って実施され、ドイツ、ノルトライン＝ヴェストファーレン州の環境および環境保護省の LandesamtfürNatur によって承認されました。
動物はケタミン（100 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）で麻酔し、最初に0.1 M PBSで心臓を灌流し、次に4％ PFAを含むPBSで灌流した。組織を解剖し、4％ PFA/PBSで一晩4℃で固定した。振動ナイフ（Leica Microsystems GmbH、ウィーン、オーストリア）を使用して、PBS中で固定した脳から矢状切片（厚さ50μm）を調製した。特に指定がない限り、自由浮遊切片の染色は上記（13）の方法で室温で撹拌しながら行った。つまり、まず得られた切片を0.5％ Triton X-100/PBSで15分間室温で透過処理したが、一部のエピトープ（PcxおよびShmt2）については、このステップの代わりに、切片を80℃（PH 9）のtris-EDTA緩衝液中で25分間加熱した。次に、切片をブロッキングバッファー（3% BSA/PBS）中の一次抗体（表S1参照）と4℃で一晩撹拌しながらインキュベートした。翌日、切片をブロッキングバッファーで洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体と室温で2時間インキュベートした。最後に、切片をPBSで十分に洗浄し、DAPIで対比染色した後、AquaPolymountで固定して顕微鏡スライド上に固定した。
白色光レーザーと405ダイオード紫外線レーザーを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡（TCS SP8-XまたはTCS Digital Light Sheet、Leica Microsystems）を用いてサンプルを画像化した。蛍光色素を励起し、ハイブリッド検出器（HyDs）でシグナルを収集することで、LAS-Xソフトウェアを用いてナイキストサンプリングに準拠したスタック画像をシーケンシャルモードで収集した。非定量パネルでは、高度に動的なシグナル（例えば、体細胞や樹状突起など）を検出するため、HyDを用いてBrightRモードでPNの数を検出した。バックグラウンドを低減するため、0.3～6nsのゲーティングを適用した。
ソーティングされた細胞のリアルタイムイメージング。1% B27サプリメントおよび0.5 mM GlutaMaxを含むNeurobasal-A培地でソーティングした後、細胞は直ちにポリ-L-リジンコーティングされたガラススライド（μ-Slide8 Well、Ibidi社、カタログ番号80826）に播種し、37℃、5% CO2で1時間静置して細胞を沈降させた。リアルタイムイメージングは​​、白色レーザーHyD、63×[1.4 NA]オイル対物レンズ、および加熱ステージを備えたLeica SP8レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて行った。
マウスを二酸化炭素で素早く麻酔し、断頭し、脳を頭蓋骨から素早く摘出し、厚さ 200 μm (13C 標識実験用) または厚さ 275 μm (2 光子実験用) の矢状断面に切断し、以下の物質を充填しました。アイスクリーム (HM-650 V、Thermo Fisher Scientific、ドイツ、ヴァルドルフ) には、以下の物質が充填されています: 125 mM 氷冷炭素飽和 (95% O2 および 5% CO2) 低 Ca2 + 人工脳脊髄液 (ACSF) NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM リン酸ナトリウム緩衝液、25 mM NaHCO3、25 mM グルコース、0.5 mM CaCl2、および 3.5 mM MgCl2 (浸透圧 310 ～ 330 mmol)。得られた脳切片を、高Ca2+ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl2および2.0 mM MgCl2培地）pH 7.4および310〜320 mmol）を含むプレインキュベーションチャンバーに移します。
イメージングプロセス中、スライスは専用のイメージング室に移され、32～33℃の一定温度でACSF灌流下で連続的に実験が行われた。スライスイメージングには、Leica 25倍対物レンズ（NA 0.95、水中）を搭載した多光子レーザー走査顕微鏡（TCS SP8 MP-OPO、Leica Microsystems）とTi:サファイアレーザー（Chameleon Vision II、Coherent社）を使用した。FLIMモジュール（PicoHarp300、PicoQuant社）を用いた。
Grx1-roGFP2のFLIM。脳矢状断面切片において、Grx1-roGFP2バイオセンサーをPNに標的として、PNの細胞質酸化還元状態の変化を2光子FLIMで測定した。PN層では、スライス表面から約50～80μm下の領域を画像取得領域として選択し、生存PN（樹状突起に沿ったビーズ状構造や神経細胞の形態変化がない状態）と、二重陽性roGFP2センサーとshRNA PCxまたはその制御配列をコードするAAV（それぞれmCherryを共発現）の存在を確認した。2倍デジタルズーム（励起波長：890 nm、512 nm、512ピクセル）でシングルスタック画像を取得した。検出：内部HyD、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）フィルター群]、および2～3分以内の画像平均化により、カーブフィッティングに十分な光子（合計1000光子）が収集されることを確認した。Grx1-roGFP2プローブの感度とFLIM条件の検証は、灌流ACSFに外因性10 mM H2O2を添加した場合（酸化を最大化し、寿命を延長）、その後2 mMジチオトレイトールを添加した場合（還元の程度を最小化し、寿命を短縮）のroGFP2の寿命値をモニタリングすることで行った（図S8、D～G）。 FLIMfit 5.1.1ソフトウェアを使用して取得した結果を分析し、画像全体の単一の指数関数的減衰曲線を測定したIRF（機器応答関数）に適合させると、χ2はおよそ1になります。単一のPNの寿命を計算するために、神経体の周囲のマスクを手動で描画し、各マスクの平均寿命を使用して定量化しました。
ミトコンドリア電位解析。急性切片を灌流ACSFに直接添加した100 nM TMRMで30分間インキュベートした後、PNのミトコンドリア電位変化を二光子顕微鏡で測定した。TMRMイメージングは​​、プローブを920 nmで励起し、内部HyD（テトラメチルローダミンイソチオシアネート：585/40 nm）を使用してシグナルを収集し、mtYFPのイメージングには同じ励起波長を使用し、異なる内部HyD（FITC：525/50）を使用した。ImageJのImage Calculatorプラグインを使用して、単一細胞レベルでミトコンドリア電位を評価する。つまり、プラグイン方程式：signal = min (mtYFP, TMRM)は、対応するチャネルのシングルスタック共焦点画像において、プルキンエ細胞ソマリにおいてTMRMシグナルを示すミトコンドリア領域を特定するために使用される。次に、結果として得られたマスク内のピクセル領域を定量化し、mtYFP チャネルの対応するしきい値シングルスタック画像で正規化して、ミトコンドリアの電位を示すミトコンドリア分率を取得します。
画像はHuygens Pro（Scientific Volume Imaging）ソフトウェアを用いてデコンボリューション処理しました。タイルのスキャン画像については、LAS-Xソフトウェアの自動スティッチングアルゴリズムを用いて、単一のタイルのモンタージュ画像を作成しました。画像キャリブレーション後、ImageJとAdobe Photoshopを用いて画像をさらに処理し、明るさとコントラストを均一に調整しました。グラフィックの準備にはAdobe Illustratorを使用しました。
mtDNAフォーカス解析。DNA抗体で標識した小脳切片を用いて、共焦点顕微鏡を用いてmtDNA病変の数を定量化した。各細胞の細胞体と核にそれぞれターゲット領域を設定し、Multi Measureプラグイン（ImageJソフトウェア）を用いてそれぞれの面積を算出した。細胞体面積から核面積を差し引くことで細胞質面積を算出した。最後に、Analyze Particlesプラグイン（ImageJソフトウェア）を用いて、閾値画像上のmtDNAを示す細胞質DNAポイントを自動定量化し、得られた結果をCTRLマウスのPN平均値で正規化した。結果は細胞あたりのヌクレオシド数の平均として表した。
タンパク質発現解析。ImageJのImage Calculatorプラグインを用いて、PNにおけるタンパク質発現を単一細胞レベルで評価します。つまり、対応するチャネルの単層共焦点画像において、signal = min (mtYFP, antibody)という式を用いて、プルキナにおいて特定の抗体に対して免疫反応性を示すミトコンドリア領域を特定します。次に、得られたマスク内のピクセル領域を定量化し、対応するmtYFPチャネルの閾値シングルスタック画像で正規化することで、表示されたタンパク質のミトコンドリア分画を取得します。
プルキンエ細胞密度解析。ImageJのCell Counterプラグインを用いて、カウントしたプルキンエ細胞数を、カウントした細胞が占める小脳輪の長さで割ることで、プルキンエ細胞密度を評価した。
サンプルの準備と収集。対照群およびMfn2cKOマウスの脳を、0.1 Mリン酸緩衝液（PB）中の2% PFA/2.5%グルタルアルデヒドで固定し、繊毛虫（Leica Mikrosysteme GmbH、オーストリア、ウィーン）を用いて冠状切片を作製した（厚さ50～60μm）。次に、1%四酸化オスミウムおよび1.5%フェロシアン化カリウムを含むPB緩衝液で室温で1時間固定した。切片を蒸留水で3回洗浄し、1%酢酸ウラニルを含む70%エタノールで20分間染色した。次に、切片を段階的アルコールで脱水し、シリコンコーティングされたスライドガラスの間にDurcupan ACM（アラルダイト鋳造樹脂M）エポキシ樹脂（Electron Microscopy Sciences、カタログ番号14040）を埋め込み、最後に60℃のオーブンで48時間重合した。小脳皮質領域を選択し、Leica Ultracut（Leica Mikrosysteme GmbH、オーストリア、ウィーン）を用いて50 nmの超薄切片を作製し、ポリスチレンフィルムでコーティングした2×1 mmの銅スリットグリッドに貼り付けた。切片は4%酢酸ウラニル水溶液で10分間染色し、水で数回洗浄した後、レイノルズクエン酸鉛水溶液で10分間染色し、さらに水で数回洗浄した。顕微鏡写真は、透過型電子顕微鏡Philips CM100（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）とTVIPS（Tietz Video and Image Processing System）TemCam-F416デジタルカメラ（TVIPS GmbH、米国ガウティング、ドイツ）を用いて撮影した。
AAVに感染したマウスについては、脳を分離して1 mmの厚さの矢状断面にスライスし、蛍光顕微鏡を使用して小脳を観察し、AAVに感染したリング（つまり、mCherryを発現している）を同定しました。AAV注入により、少なくとも2つの連続した小脳リングでプルキンエ細胞層（つまり、ほぼ全層）の非常に高い形質導入効率が得られる実験のみを使用しています。AAV導入ループを顕微解剖し、一晩後固定（0.1 Mココ酸緩衝液中の4％PFAおよび2.5％グルタルアルデヒド）し、さらに処理しました。EPON包埋のために、固定した組織を0.1 Mココ酸ナトリウム緩衝液（Applichem）で洗浄し、0.1 Mココ酸ナトリウム緩衝液（Applichem）中の2％OsO4（os、Science Services; Caco）で4時間インキュベートし、その後2時間洗浄しました。 0.1 Mコカミド緩衝液で3回繰り返した。その後、濃度の上昇するエタノール溶液を用いて、各エタノール溶液を4℃で15分間インキュベートし、組織を脱水した。組織をプロピレンオキシドに移し、EPON（Sigma-Aldrich）中で4℃で一晩インキュベートした。組織を新鮮なEPONに室温で2時間浸漬した後、62℃で72時間包埋した。ウルトラミクロトーム（Leica Microsystems、UC6）とダイヤモンドナイフ（Diatome、スイス、ビール）を用いて70 nmの超薄切片を作製し、1.5%酢酸ウラニルで37℃で15分間染色した後、クエン酸鉛溶液で4分間染色した。電子顕微鏡写真は、Camera OneView 4K 16-bit（Gatan社）およびDigitalMicrographソフトウェア（Gatan社）を搭載したJEM-2100 Plus透過型電子顕微鏡（JEOL社）を用いて撮影しました。解析のために、5000倍または10,000倍のデジタルズームで電子顕微鏡写真を取得しました。
ミトコンドリアの形態学的解析。全ての解析において、ImageJソフトウェアを用いて、個々のミトコンドリアの輪郭をデジタル画像に手動で描画した。様々な形態学的パラメータを分析した。ミトコンドリア密度は、各細胞のミトコンドリア総面積を細胞質面積（細胞質面積＝細胞面積－細胞核面積）×100で割ったパーセンテージとして表される。ミトコンドリアの円形度は[4π∙(面積/周囲長2)]という式で計算される。ミトコンドリアのイスタ形態を分析し、その主な形状に基づいて2つのカテゴリー（「管状」と「水疱状」）に分類した。
オートファゴソーム／リソソームの数と密度の解析。ImageJソフトウェアを用いて、デジタル画像上の各オートファゴソーム／リソソームの輪郭を手動で描画します。オートファゴソーム／リソソーム面積は、各細胞におけるオートファゴソーム／リソソーム構造の総面積を細胞質面積（細胞質面積＝細胞面積－核面積）×100で割ったパーセンテージで表します。オートファゴソーム／リソソームの密度は、総数を細胞あたりのオートファゴソーム／リソソーム構造の数（細胞質面積換算）（細胞質面積＝細胞面積－核面積）で割ることで算出します。
急性切片作製およびサンプル調製のための標識。グルコース標識を必要とする実験では、急性脳切片をプレインキュベーションチャンバーに移します。プレインキュベーションチャンバーには、飽和炭素（95% O2、5% CO2）、高Ca2+ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl2、2.0 mM MgCl2、pH 7.4、310～320 mOsmに調整）が含まれており、グルコースは13 C 6-グルコース置換体（Eurisotop、カタログ番号CLM-1396）です。ピルビン酸標識を必要とする実験では、急性脳切片を高Ca₂+ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO₃、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl₂、2.0 mM MgCl₂を添加し、pH 7.4、310～320 mOsmに調整）に移し、1 mM 1-[1-13C]ピルビン酸（Eurisotop、カタログ番号CLM-1082）を添加します。切片を37℃で90分間インキュベートします。実験終了後、切片を75 mM炭酸アンモニウムを含む水溶液（pH 7.4）で素早く洗浄し、アセトニトリル（ACN）：メタノール：水の40:40:20（v:v:v）混合液でホモジェナイズした。切片を氷上で30分間インキュベートした後、サンプルを4℃、21,000 gで10分間遠心分離し、得られた上清をSpeedVac濃縮器で乾燥させた。得られた乾燥代謝物ペレットは、分析まで-80℃で保存した。
13 C標識アミノ酸の液体クロマトグラフィー質量分析。液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）分析のために、代謝物ペレットを75μlのLC-MSグレード水（Honeywell社製）に再懸濁した。21,000 g、4℃で5分間遠心分離した後、上澄み液20μlをアミノ酸フラックス分析に用い、残りの抽出物は直ちに陰イオン分析に用いた（下記参照）。アミノ酸分析は、前述の塩化ベンゾイル誘導体化プロトコル（55, 56）を用いて実施した。最初のステップでは、100 mM炭酸ナトリウム（Sigma-Aldrich社製）10μlを代謝物抽出物20μlに加え、次に2%塩化ベンゾイル（Sigma-Aldrich社製）10μlをLCグレードACNに加えた。サンプルを軽くボルテックスし、次に 21,000 g で 5 分間、20°C で遠心分離した。澄んだ上清を円錐形のガラスインサート付きの 2 ml オートサンプラーバイアルに移した (容量 200 μl)。サンプルは、Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) 高分解能精密質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) に接続された Acquity iClass 超高性能 LC システム (Waters) を使用して分析した。分析では、誘導体化サンプル 2 μl を 1.8 μm 粒子を含む 100×1.0 mm の高強度シリカ T3 カラム (Waters) に注入した。流速は 100 μl/分で、緩衝液システムは緩衝液 A (水中の 10 mM ギ酸アンモニウムおよび 0.15% ギ酸) と緩衝液 B (ACN) で構成され0%B。0～0.1分で0～15% B、0.1～0.5分で15～17% B、0.5～14分で17～55% B、14～14.5分で55～70% B、18分で14.5～70～100% B、18～19分で100% B、19～19.1分で100～0% B、19.1～28分で0% B（55、56）。 QE-HF質量分析計は、質量範囲m/z（質量電荷比）50～750の正イオン化モードで動作します。適用分解能は60,000、ゲイン制御（AGC）イオンターゲットは3×106個、最大イオン化時間は100ミリ秒です。加熱式エレクトロスプレーイオン化（ESI）源は、スプレー電圧3.5 kV、キャピラリー温度250°C、シースエアフロー60 AU（任意単位）、補助エアフロー20 AUで動作します。250°C。Sレンズは60 AUに設定されています。
13C標識有機酸の陰イオンクロマトグラフィー-MS分析。残った代謝物沈殿物（55μl）を、QE-HF質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に接続されたDionexイオンクロマトグラフィーシステム（ICS 5000+、Thermo Fisher Scientific）を使用して分析しました。簡単に言うと、代謝物抽出物5μlを、充填比1のプッシュイン部分ループモードでHPLC（2 mm×250 mm、粒子サイズ4μm、Thermo Fisher Scientific）を備えたDionex IonPac AS11-HCカラムに注入しました。）Dionex IonPac AG11-HCガードカラム（2 mm x 50 mm、4μm、Thermo Fisher Scientific）。カラム温度は30°Cに維持され、オートサンプラーは6°Cに設定されています。脱イオン水が付属している水酸化カリウムカートリッジを使用して、溶離液ジェネレーターを通して水酸化カリウムグラジエントを生成します。流速380μl/分で代謝物を分離し、以下のグラジエントを適用した：0～3分：10 mM KOH、3～12分：10～50 mM KOH、12～19分：50～100 mM KOH、19～21分：100 mM KOH、21～21.5分：100～10 mM KOH。カラムは10 mM KOHで8.5分間再平衡化した。
溶出代謝物はカラム後、150μl/分のイソプロパノール補充流と混合され、負イオン化モードで動作する高分解能質量分析計に送られます。MSは、m/z 50～750の質量範囲を60,000の分解能でモニタリングします。AGCは1×106に設定され、最大イオン時間は100msに維持されます。加熱ESIイオン源は3.5kVのスプレー電圧で動作しました。イオン源のその他の設定は、キャピラリー温度275℃、シースガス流量60AU、補助ガス流量300℃で20AU、Sレンズ設定60AUです。
13C標識代謝物のデータ分析。同位体比のデータ分析には、TraceFinderソフトウェア（バージョン4.2、Thermo Fisher Scientific）を使用します。各化合物の同一性は、信頼性の高い参照化合物によって検証され、独立して分析されました。同位体濃縮分析を実行するために、各13C同位体（Mn）の抽出イオンクロマトグラム（XIC）の領域を[M + H] +から抽出しました。ここで、nは対象化合物の炭素数であり、アミノ酸を分析するために使用されるか、[ MH] +は陰イオンを分析するために使用されます。XICの質量精度は5 ppm未満であり、RTの精度は0.05分です。濃縮分析は、検出された各同位体と、対応する化合物のすべての同位体の合計の比率を計算することによって実行されます。これらの比率は、各同位体のパーセンテージ値として与えられ、結果は、前述のように（42）、モルパーセント濃縮（MPE）として表されます。
凍結したニューロンペレットを氷冷した80%メタノール（v/v）中でホモジェナイズし、ボルテックスミキサーで撹拌した後、-20℃で30分間インキュベートした。再度ボルテックスミキサーで撹拌し、+4℃で30分間攪拌した。サンプルを21,000 g、4℃で5分間遠心分離し、得られた上清を回収し、SpeedVac濃縮器を用いて25℃で乾燥させ、その後の分析に使用した。上述のように、選別した細胞のアミノ酸についてLC-MS分析を行った。TraceFinder（バージョン4.2、Thermo Fisher Scientific）を用いて、各化合物のモノアイソトピック質量を用いてデータ解析を行った。代謝物データの分位正規化は、preprocessCoreソフトウェアパッケージ（57）を用いて行った。
スライス標本の作成。マウスを二酸化炭素で素早く麻酔し、断頭後、脳を頭蓋骨から素早く摘出し、氷を充填した振動ナイフ（HM-650 V、Thermo Fisher Scientific、ドイツ、ヴァルドルフ）を用いて300～375 μmの矢状断面に切断した。低温炭素ガス化（95% O2および5% CO2）低Ca2 + ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、1.0 mM CaCl2、6.0 mM MgCl2）。pH 7.4、310～330 mOsmに調整。得られた脳切片を、高Ca2+ACSF（125.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mMリン酸ナトリウム緩衝液、25.0 mM NaHCO3、25.0 mM d-グルコース、4.0 mM CaCl2、3.5 mM MgCl2）を含むチャンバー（pH 7.4、310～320 mOsm）に移します。記録前にスライスを復元できるように、20～30分間保存します。
記録。全ての記録には、固定記録チャンバーと20倍水浸対物レンズ（Scientifica）を備えた顕微鏡ステージを使用した。推定プルキンエ細胞は、（i）体の大きさ、（ii）小脳の解剖学的位置、および（iii）蛍光mtYFPレポーター遺伝子の発現によって同定した。先端抵抗が5～11メガオームのパッチピペットを、ホウケイ酸ガラス製キャピラリー（GB150-10、0.86 mm×1.5 mm×100 mm、Science Products、Hofheim、ドイツ）と水平ピペットInstruments（P-1000、Sutter、Novato、カリフォルニア州）で引き抜いた。全ての記録は、ソフトウェアSignal（バージョン6.0、Cambridge Electronic、Cambridge、英国）で制御されたELC-03XS npiパッチクランプアンプ（npi electronic GmbH、Tam、ドイツ）で行った。実験は、12.5 kHzのサンプリングレートで記録した。信号は、それぞれ1.3kHzと10kHzのカットオフ周波数を持つ2つのショートパスベッセルフィルタでフィルタリングされます。膜とピペットの静電容量は、アンプを用いた補償回路によって補償されます。すべての実験は、Hokawoソフトウェア（バージョン2.8、浜松市ゲルデン、ドイツ）によって制御されたOrca-Flash 4.0カメラ（浜松市ゲルデン、ドイツ）によって実施されました。
通常の細胞全体の構成と解析。記録直前に、以下の物質を含む内部溶液をピペットに充填する：4.0 mM KCl、2.0 mM NaCl、0.2 mM EGTA、135.0 mMグルコン酸カリウム、10.0 mM Hepes、4.0 mM ATP（Mg）、0.5 mMグアノシン三リン酸（GTP）（Na）、および10.0 mMクレアチニンリン酸をpH 7.25に調整し、浸透圧は290 mOsm（スクロース）とした。0 pAの力を加えて膜を破裂させた直後に、静止膜電位を測定した。入力抵抗は、-40、-30、-20、および-10 pAの過分極電流を印加して測定する。電圧応答の大きさを測定し、オームの法則を用いて入力抵抗を算出する。自発活動は電圧クランプで 5 分間記録され、sPSC は、半自動認識スクリプトを使用して Igor Pro (バージョン 32 7.01、WaveMetrics、米国オレゴン州レイクオスウェゴ) で識別および測定されました。IV 曲線と定常電流は、バッテリーをさまざまな電位 (-110 mV から開始) でクランプし、電圧を 5 mV ステップで増加させることで測定されます。AP の生成は、脱分極電流を適用してテストしました。脱分極電流パルスを適用しながら、セルを -70 mV でクランプします。各記録ユニットのステップ サイズを個別に調整します (10～60 pA)。最高の AP 周波数を引き起こすパルス スパイクを手動でカウントして、最大 AP 周波数を計算します。AP しきい値は、最初に 1 つ以上の AP をトリガーする脱分極パルスの 2 次導関数を使用して分析されます。
穿孔パッチの構成と解析。標準プロトコルを用いて穿孔パッチの記録を行う。ATPおよびGTPを含まないピペットを使用し、以下の成分を含まない：128 mMグルコン酸K、10 mM KCl、10 mM Hepes、0.1 mM EGTA、および2 mM MgCl2。pHをKOHで7.2に調整する。細胞膜の透過性が制御不能になるのを防ぐため、細胞内溶液からATPおよびGTPを除去する。パッチピペットにアムホテリシン含有内部溶液（約200～250μg/ml；G4888、Sigma-Aldrich）を充填し、穿孔パッチ記録を得る。アムホテリシンはジメチルスルホキシドに溶解した（最終濃度：0.1～0.3%；DMSO；D8418、Sigma-Aldrich）。使用したDMSOの濃度は、研究したニューロンに有意な影響を与えませんでした。 パンチングプロセス中、チャネル抵抗（Ra）は継続的にモニタリングされ、RaとAPの振幅が安定した後（20〜40分）に実験が開始されました。 自発活動は、電圧および/または電流クランプで2〜5分間測定されます。 データ解析は、Igor Pro（バージョン7.05.2、WaveMetrics、米国）、Excel（バージョン2010、Microsoft Corporation、レドモンド、米国）、およびGraphPad Prism（バージョン8.1.2、GraphPad Software Inc.、ラホヤ、カリフォルニア州）を使用して実施しました。 米国）。自発APを識別するために、IgorProのNeuroMatic v3.0cプラグインが使用されます。 各レコードに対して個別に調整される特定のしきい値を使用して、APを自動的に識別します。 スパイク間隔を使用して、最大瞬間スパイク周波数と平均スパイク周波数でスパイク周波数を決定します。
PNの分離。以前発表されたプロトコル（58）を改変し、マウス小脳から特定の段階のPNを精製した。簡潔に説明すると、小脳を解剖し、氷冷した解離培地（HBSS、Ca2+およびMg2+を含まない、20 mMグルコース、ペニシリン（50 U/ml）、ストレプトマイシン（0.05 mg/ml）を添加）中で細かく刻んだ後、パパイン（HBSS、l-システイン・HCl（1 mg/ml）、パパイン（16 U/ml）、デオキシリボヌクレアーゼI（DNase I; 0.1 mg/ml）を添加）で消化し、30℃で30分間処理した。まず、酵素分解を防ぐため、室温で卵粘液（10 mg/ml）、BSA（10 mg/ml）、DNase（0.1 mg/ml）を含むHBSS培地で組織を洗浄し、次に20 mMグルコースを含むHBSS培地で静かに粉砕し、ペニシリン（50 U/ml）、ストレプトマイシン（0.05 mg/ml）、DNase（0.1 mg/ml）で単一細胞を遊離させます。得られた細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーで濾過し、遠心分離（1110 rpm、5分、4°C）で細胞をペレット化し、ソーティング培地（HBSS、20 mMグルコース、20%ウシ胎児血清、ペニシリン（50 U/ml）、ストレプトマイシン（0.05 mg/ml）を補充）に再懸濁しました。細胞生存率をヨウ化プロピジウムで評価し、細胞密度を1×106～2×106個/mlに調整した。フローサイトメトリーの前に、懸濁液を50μmのセルストレーナーで濾過した。
フローサイトメーター。細胞選別は、FACSAria IIIマシン（BD Biosciences）とFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences、バージョン8.0.1）を使用して4°Cで実施しました。細胞懸濁液は、100μmノズルを使用して、20psiの圧力で約2800イベント/秒の速度で選別されました。従来のゲーティング基準（細胞サイズ、バイモーダル識別、散乱特性）ではPNを他の細胞タイプから正しく分離できないため、mitoYFP +マウスとコントロールmitoYFP −マウスのYFP強度と自己蛍光の直接比較に基づいてゲーティング戦略が設定されました。YFPは、サンプルに488 nmのレーザーラインを照射することによって励起され、シグナルは530/30 nmバンドパスフィルターを使用して検出されます。mitoYFP +マウスでは、Rosa26-mitoYFPレポーター遺伝子の相対的な強度も、神経体と軸索断片を区別するために使用されます。 7-AADは561 nmの黄色レーザーで励起され、死細胞を除去するために675/20 nmのバンドパスフィルターで検出されます。同時にアストロサイトを分離するために、細胞懸濁液をACSA-2-APCで染色した後、サンプルに640 nmのレーザーを照射し、660/20 nmのバンドパスフィルターで信号を検出しました。
採取した細胞は遠心分離（1110 rpm、5分、4℃）によりペレット化し、使用するまで-80℃で保存した。Mfn2cKOマウスとその仔マウスは、手順のばらつきを最小限に抑えるため、同日に分類した。FACSデータの表示と解析は、FlowJoソフトウェア（FlowJo LLC、米国オレゴン州アッシュランド）を用いて行った。
前述の通り（59）、リアルタイムPCRは、選別されたニューロンからDNAを単離し、その後のmtDNA定量のために用いられる。直線性と閾値感度は、まず異なる数の細胞に対してqPCRを実施することで検証された。簡単に説明すると、50 mMトリス-HCl（pH 8.5）、1 mM EDTA、0.5% Tween 20、プロテイナーゼK（200 ng/ml）を含む溶解バッファーに300 PNを採取し、55℃で120分間インキュベートする。その後、プロテイナーゼKを完全に不活性化するために、細胞を95℃で10分間インキュベートした。mt-Nd1特異的なTaqManプローブ（Thermo Fisher）を用いて、7900HTリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）で半定量PCRによりmtDNAを測定した。 Science、カタログ番号 Mm04225274_s1)、mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 AIVI3E8)、および 18S (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 Hs99999901_s1) 遺伝子。
プロテオームサンプルの調製。溶液を95℃で10分間加熱し、超音波処理することにより、溶解バッファー（6 Mグアニジン塩化物、10 mMトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、10 mMクロロアセトアミド、および100 mMトリス-HCl）中で凍結ニューロンペレットを溶解した。Bioruptor（Diagenode社製）で10分間（30秒パルス／30秒休止）処理した。サンプルを20 mMトリス-HCl（pH 8.0）で1:10に希釈し、300 ngのトリプシンゴールド（Promega社製）と混合し、37℃で一晩インキュベートして完全に分解した。2日目に、サンプルを20,000 gで20分間遠心分離した。上清を0.1%ギ酸で希釈し、自作のStageTipsで脱塩した。サンプルをSpeedVac装置（Eppendorf concentrator plus 5305）で45°Cで乾燥させた後、ペプチドを0.1%ギ酸に懸濁した。すべてのサンプルは、同じ人が同時に調製した。アストロサイトサンプルを分析するために、脱塩したペプチド4μgをタンデムマスタグ（TMT10plex、カタログ番号90110、Thermo Fisher Scientific）で、ペプチドとTMT試薬の比率を1:20にして標識した。TMT標識のために、TMT試薬0.8mgを無水ACN 70μlに再懸濁し、乾燥したペプチドを0.1 M TEAB（重炭酸トリエチルアンモニウム）9μlに再構成し、これにACN中のTMT試薬7μlを加えた。濃度は43.75%であった。 60分間のインキュベーション後、5%ヒドロキシルアミン2μlで反応を停止した。標識ペプチドを回収、乾燥させ、0.1%ギ酸（FA）200μlに再懸濁し、2つに分けた後、自作のStageTipsを用いて脱塩した。UltiMate 3000超高速液体クロマトグラフ（UltiMate 3000超高速液体クロマトグラフ）を用いて、片方のサンプルを130Å1.7μm C18粒子（Waters、カタログ番号SKU：186006935）を充填した1mm×150mm Acquityクロマトグラフィーカラムで分画した。Thermo Fisher Scientific）。流速30μl/分でペプチドを分離し、1%から50%の緩衝液Bで85分間、段階的に96分間グラジエント分離した後、50%から95%の緩衝液Bで3分間、95%の緩衝液Bで8分間分離する。緩衝液Aは5%アセトアミノフェン（ACN）と10 mM重炭酸アンモニウム（ABC）、緩衝液Bは80%アセトアミノフェンと10 mM ABCである。3分ごとに画分を回収し、2つのグループ（1 + 17、2 + 18など）にまとめ、真空遠心分離機で乾燥させる。
LC-MS/MS分析。質量分析では、ペプチド（番号r119.aq）を、1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ担体（Dr. Maisch、mat）を装着した25 cm、内径75 μmのPicoFrit分析カラム（新品対物レンズ、部品番号PF7508250）で分離した。EASY-nLC 1200（Thermo Fisher Scientific、ドイツ）を使用した。カラムは50℃に保持した。緩衝液Aおよび緩衝液Bは、それぞれ0.1%ギ酸水溶液および0.1%ギ酸を含む80%アセトニトリル溶液である。ペプチドは、200 nl/分のグラジエントで、緩衝液Bの6%から31%までを65分間、緩衝液Bの31%から50%までを5分間分離した。溶出ペプチドは、Orbitrap Fusion質量分析計（Thermo Fisher Scientific）で分析した。ペプチド前駆体のm/z測定は、350～1500 m/zの範囲で120,000の分解能で行われた。27%の正規化衝突エネルギーを用いて、電荷状態2～6の最も強い前駆体が高エネルギーCトラップ解離（HCD）切断のために選択された。サイクル時間は1秒に設定された。ペプチドフラグメントのm/z値は、最小のAGCターゲット5×104と最大注入時間86ミリ秒を用いてイオントラップで測定された。フラグメント化後、前駆体は45秒間動的除外リストに配置された。 TMT標識ペプチドは、50 cm、75 μm Acclaim PepMapカラム（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号164942）で分離され、移動スペクトルは、-50 Vと-70 Vの2つの補償電圧で動作する高電場非対称波形イオン（FAIMS）装置（Thermo Fisher Scientific）を備えたOrbitrap Lumos Tribrid質量分析計（Thermo Fisher Scientific）で分析されました。同期プリカーサーに基づいて選択されたMS3は、TMTレポートイオンシグナル測定に使用されます。ペプチド分離は、EASY-nLC 1200で、90%線形グラジエント溶出を使用して、6%～31%の緩衝液濃度で実施されました。緩衝液Aは0.1% FA、緩衝液Bは0.1% FAと80% ACNでした。分析カラムは50°Cで動作します。 FreeStyle (バージョン 1.6、Thermo Fisher Scientific) を使用して、FAIMS 補正電圧に応じて元のファイルを分割します。
タンパク質の同定と定量。統合型検索エンジンAndromedaを使用し、MaxQuantバージョン1.5.2.8（https://maxquant.org/）を用いて元データを解析した。Aequorea victoriaから取得したCreリコンビナーゼおよびYFP配列に加えて、マウス参照プロテオーム（プロテオームID UP000000589、2017年5月にUniProtからダウンロード）の標準配列およびアイソフォーム配列についてペプチドフラグメントスペクトルを検索した。メチオニン酸化およびタンパク質N末端アセチル化は可変修飾として設定し、システインカルバモイルメチル化は固定修飾として設定した。消化パラメータは「特異性」および「トリプシン/P」に設定した。タンパク質同定に使用するペプチドおよびカミソリペプチドの最小数は1であり、ユニークペプチドの最小数は0である。ペプチドマップマッチングの条件下では、タンパク質同定率は0.01であった。 「Second Peptide」オプションが有効になっています。異なる元のファイル間で成功した同定を転送するには、「match between runs」オプションを使用します。ラベルフリー定量（LFQ）（60）には、LFQ最小比カウント1を使用します。LFQ強度は、各時点で少なくとも1つの遺伝子型グループで少なくとも2つの有効な値に対してフィルタリングされ、幅0.3の正規分布から外挿され、1.8に移動します。LFQ結果を分析するには、Perseusコンピューティングプラットフォーム（https://maxquant.net/perseus/）とR（https://r-project.org/）を使用します。差次的発現解析には、limmaソフトウェアパッケージの2元配置中等度t検定を使用しました（61）。探索的データ解析は、ggplot、FactoMineR、factoextra、GGally、およびpheatmapを使用して実行されます。TMTベースのプロテオミクスデータは、MaxQuantバージョン1.6.10.43を使用して分析されました。 2018年9月にダウンロードされたUniProtのヒトプロテオミクスデータベースから、生のプロテオミクスデータを検索してください。分析には、メーカーが提供する同位体純度補正係数が含まれています。差次的発現解析には、Rのlimmaを使用してください。元のデータ、データベース検索結果、データ分析ワークフローと結果はすべて、データセット識別子PXD019690を持つPRIDEパートナーリポジトリを通じて、ProteomeXchangeアライアンスに保存されています。
機能的注釈は解析を豊かにします。Ingenuity Pathway Analysis（QIAGEN）ツールを使用して、8週目のデータセットの機能的注釈用語の豊富さを決定しました（図1）。つまり、LC-MS/MS（タンデム質量分析）データ分析から得られた定量的タンパク質リストを、次のフィルター基準で使用します。種と背景としてMus musculusを選択し、Benjaminiによってエンリッチメントに対して調整されたP値が0.05以下であるカテゴリが有意であることを示します。このグラフでは、調整されたP値に基づいて各クラスターの上位5つの超過カテゴリが表示されます。多重t検定を使用し、Benjamini、Krieger、およびYekutieliの2段階線形ブーストプログラム（Q = 5％）を使用して、各カテゴリで特定された重要な候補に対して経時的なタンパク質発現解析を実行し、各行を個別に解析します。一貫したSDを採用する必要はありません。
本研究の結果を公開データベースと比較し、図1のベン図を作成するために、定量的タンパク質リストとMitoCarta 2.0のアノテーション（24）を組み合わせました。ベン図の作成には、オンラインツール「Draw Venn Diagram」（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）を使用しました。
プロテオミクス解析に使用した統計手順の詳細については、「材料と方法」の該当セクションを参照してください。その他の実験については、対応する凡例に詳細情報が記載されています。特に記載がない限り、すべてのデータは平均値±標準誤差（SEM）で示され、すべての統計解析はGraphPad Prism 8.1.2ソフトウェアを用いて実施しました。
この記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1をご覧ください。
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E. Motori、I. Atanassov、SMV Kochan、K. Folz-Donahue、V. Sakthivelu、P. Giavalisco、N. Toni、J. Puyal、N.-G.ラーソン
機能不全ニューロンのプロテオミクス解析により、神経変性を抑えるために代謝プログラムが活性化されていることが明らかになりました。
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