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本態性振戦（ET）の早期診断は、特に健常対照群（HC）やパーキンソン病（PD）との鑑別が困難な場合がある。近年、腸内細菌叢とその代謝物の便サンプル分析により、神経変性疾患の新たなバイオマーカー発見のための新たな方法がもたらされている。腸内細菌叢の主要代謝物である短鎖脂肪酸（SCFA）は、PD患者の便中で減少している。しかし、ETにおける便中SCFAはこれまで研究されていない。本研究では、ETにおける便中SCFAレベルを調査し、臨床症状および腸内細菌叢との関係を評価し、その診断能力の可能性を明らかにすることを目的とした。37名のET患者、37名の新規PD患者、および35名のHC患者において、便中SCFAおよび腸内細菌叢を測定した。便秘、自律神経機能障害、および振戦の重症度は、スケールを用いて評価した。プロピオン酸、酪酸、およびイソ酪酸の便中レベルは、HCよりもETで低かった。プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸の組み合わせは、AUC 0.751 (95% CI: 0.634–0.867) で ET と HC を区別した。糞便中のイソ吉草酸とイソ酪酸のレベルは、PD よりも ET で低かった。イソ吉草酸とイソ酪酸は、AUC 0.743 (95% CI: 0.629–0.857) で ET と PD を区別する。糞便中のプロピオン酸は、便秘と自律神経機能障害と逆相関している。イソ酪酸とイソ吉草酸は、振戦の重症度と逆相関している。糞便中の短鎖脂肪酸の減少は、ET における Faecalibacterium と Streptobacterium の存在量の減少と関連していた。このように、ETでは糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）含有量が減少し、臨床症状の重症度や腸内細菌叢の変化と関連している。糞便中のプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、イソ吉草酸は、ETの診断および鑑別診断における潜在的なバイオマーカーとなる可能性がある。
本態性振戦（ET）は、主に上肢の振戦を特徴とする進行性の慢性神経変性疾患であり、頭部、声帯、下肢などの身体の他の部分にも影響を及ぼす可能性があります1。ETの臨床的特徴には、運動症状だけでなく、消化器疾患などの非運動症状も含まれます2。本態性振戦の病理学的および生理学的特徴を調べるために数多くの研究が行われてきましたが、明確な病態生理学的メカニズムは特定されていません3,4。最近の研究では、腸内細菌叢-腸-脳軸の機能不全が神経変性疾患に寄与している可能性があり、腸内細菌叢と神経変性疾患の間に双方向のつながりがある可能性を示す証拠が増えています5,6。注目すべきことに、ある症例報告では、糞便微生物叢移植により患者の本態性振戦と過敏性腸症候群の両方が改善しており、腸内細菌叢と本態性振戦の間に密接な関係があることを示唆している可能性があります。さらに、ET患者の腸内細菌叢に特異的な変化が見られ、これはETにおける腸内細菌叢異常の重要な役割を強く裏付けています8。
神経変性疾患における腸内細菌叢異常に関しては、PDが最も広く研究されている5。腸内細菌叢のバランスが崩れると、腸管透過性が高まり、腸管グリアが活性化され、α-シヌクレイン病を引き起こす可能性がある9,10,11。PDとETは、ETとPD患者における振戦の頻度が類似していること、安静時振戦（PDに典型的な振戦）と姿勢振戦（主にET患者に見られる）が重複していることなど、いくつかの共通の特徴を共有しており、両者を区別することが困難である。初期段階12。したがって、ETとPDを区別するための有用な窓を早急に開く必要がある。この文脈において、ETにおける特異的な腸内細菌叢異常とそれに伴う代謝産物の変化を研究し、PDとの違いを特定することは、ETの診断および鑑別診断のための潜在的なバイオマーカーとなる可能性がある。
短鎖脂肪酸（SCFA）は、食物繊維の腸内細菌発酵によって生成される主要な代謝産物であり、腸脳相互作用において重要な役割を果たすと考えられている13,14。SCFAは結腸細胞に取り込まれ、門脈系を介して肝臓に運ばれ、一部は全身循環に入る。SCFAは、腸管バリアの完全性を維持し、腸粘膜における自然免疫を促進する局所的な効果を持つ15。また、タイトジャンクションタンパク質を刺激し、Gタンパク質共役受容体（GPCR）を刺激して血液脳関門（BBB）を通過することでニューロンを活性化することにより、血液脳関門（BBB）に長期的な影響を与える16。酢酸、プロピオン酸、酪酸は、結腸で最も豊富なSCFAである。これまでの研究では、パーキンソン病患者において、糞便中の酢酸、プロピオン酸、酪酸のレベルが低下していることが示されている17。しかし、ET患者における糞便中の短鎖脂肪酸濃度はこれまで研究されたことがない。
したがって、本研究は、ET患者の糞便SCFAの特異的な変化とPD患者との違いを特定し、糞便SCFAとETの臨床症状および腸内細菌叢との関係を評価し、糞便サンプルの潜在的な診断能力および鑑別診断能力を決定することを目的とした。KZhK。抗PD薬に関連する交絡因子に対処するため、疾患対照として新規発症パーキンソン病患者を選択した。
表1に、37人のET、37人のPD、および35人のHCの人口統計学的および臨床的特徴をまとめた。ET、PD、およびHCは、年齢、性別、およびBMIでマッチングされた。3つのグループは、喫煙、飲酒、コーヒーと紅茶の摂取の割合も同様であった。PDグループのWexnerスコア（P = 0.004）およびHAMD-17スコア（P = 0.001）はHCグループよりも高く、ETグループのHAMAスコア（P = 0.011）およびHAMD-17スコア（P = 0.011）はHCグループよりも高かった。ETグループの疾患経過はPDグループよりも有意に長かった（P<0.001）。
糞便中のプロピオン酸（P = 0.023）、酢酸（P = 0.039）、酪酸（P = 0.020）、イソ吉草酸（P = 0.045）、およびイソ酪酸（P = 0.015）のレベルには有意差が認められた。さらに事後解析では、ET群のプロピオン酸（P = 0.023）、酪酸（P = 0.007）、およびイソ酪酸（P = 0.040）のレベルはHC群よりも有意に低かった。ET患者はPD患者よりもイソ吉草酸（P = 0.014）およびイソ酪酸（P = 0.005）のレベルが低かった。さらに、糞便中のプロピオン酸（P = 0.013）、酢酸（P = 0.016）、酪酸（P = 0.041）のレベルは、CC患者よりもPD患者の方が低かった（図1および補足表1）。
agは、それぞれプロピオン酸、酢酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、カプロン酸、イソ酪酸の群間比較を表します。3つの群間で、糞便中のプロピオン酸、酢酸、酪酸、イソ吉草酸、イソ酪酸のレベルに有意差がありました。ET：本態性振戦、パーキンソン病、HC：健常対照群、SCFA。有意差は*P < 0.05および**P < 0.01で示されます。
ET群とPD群の疾患経過の違いを考慮して、早期PD患者33名とET患者16名（疾患経過3年未満）を対象にさらに比較検討を行った（補足表2）。その結果、ET群の糞便プロピオン酸含有量はHA群よりも有意に低かった（P=0.015）。酪酸とイソ酪酸についてはET群とHC群の差は有意ではなかったが、傾向は認められた（P = 0.082）。糞便イソ酪酸濃度は、PD患者と比較してET患者で有意に低かった（P = 0.030）。イソ吉草酸についてはET群とPD群の差は有意ではなかったが、傾向は認められた（P = 0.084）。プロピオン酸（P = 0.023）、酢酸（P = 0.020）、酪酸（P = 0.044）は、PD患者ではHC患者よりも有意に低かった。これらの結果（補足図1）は、概ね主要な結果と一致している。全体サンプルと早期患者サブグループの結果の差は、サブグループのサンプルサイズが小さいため、データの統計的検出力が低下したことに起因する可能性がある。
次に、糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）レベルが、ET患者とCUまたはPD患者を区別できるかどうかを検討した。ROC分析によると、プロピオン酸レベルのAUCの差は0.668（95%信頼区間：0.538～0.797）であり、ET患者とHC患者を区別することができた。酪酸レベルはAUCが0.685（95%信頼区間：0.556～0.814）であり、ET患者とGC患者を区別することができた。イソ酪酸レベルの差は、AUCが0.655（95%信頼区間：0.525～0.786）であり、ET患者とHC患者を区別できる可能性がある。プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸のレベルを組み合わせると、感度74.3%、特異度72.9%で、より高いAUC 0.751 (95% CI: 0.634–0.867) が得られました (図 2a)。ET 患者と PD 患者を区別するために、イソ吉草酸レベルの AUC は 0.700 (95% CI: 0.579–0.822)、イソ酪酸レベルの AUC は 0.718 (95% CI: 0.599–0.836) でした。イソ吉草酸とイソ酪酸レベルの組み合わせでは、より高い AUC 0.743 (95% CI: 0.629–0.857)、感度74.3%、特異度62.9% が得られました (図 2b)。さらに、パーキンソン病患者の糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）レベルが対照群と異なるかどうかを検討した。ROC分析によると、プロピオン酸レベルの差に基づいてPD患者を識別するためのAUCは0.687（95% CI：0.559-0.814）で、感度は68.6%、特異度は68.7%であった。酢酸レベルの差は、AUCが0.674（95% CI：0.542-0.805）でPD患者をHCから区別できる可能性がある。PD患者は、AUCが0.651（95% CI：0.515-0.787）で酪酸レベルのみでCUから区別できる。プロピオン酸、酢酸、酪酸レベルを組み合わせると、AUCは0.682（95% CI：0.553-0.811）となった（図2c）。
a ロシア正教会によるETとHCに対する差別。b ROCによるETとPDに対する差別。c ROCによるPDとHCに対する差別。ET：本態性振戦、パーキンソン病、HC：健常対照群、SCFA。
ET患者では、糞便中のイソ酪酸レベルはFTMスコアと負の相関を示し（r = -0.349、P = 0.034）、糞便中のイソ吉草酸レベルはFTMスコア（r = -0.421、P = 0.001）およびTETRASスコア（r = -0.382、P = 0.020）と負の相関を示した。ETおよびPD患者では、糞便中のプロピオン酸レベルはSCOPA-AUTスコアと負の相関を示した（r = -0.236、P = 0.043）（図3および補足表3）。ET群（P ≥ 0.161）またはPD群（P ≥ 0.246）のいずれにおいても、疾患経過とSCFAの間に有意な相関は認められなかった（補足表4）。 PD患者では、糞便中のカプロン酸濃度はMDS-UPDRSスコアと正の相関を示した（r = 0.335、P = 0.042）。全参加者において、糞便中のプロピオン酸（r = −0.230、P = 0.016）および酢酸（r = −0.210、P = 0.029）濃度はWexnerスコアと負の相関を示した（図3および補足表3）。
糞便中のイソ酪酸濃度はFTMスコアと負の相関を示し、イソ吉草酸はFTMおよびTETRASスコアと負の相関を示し、プロピオン酸はSCOPA-AUTスコアと負の相関を示し、カプロン酸はMDS-UPDRSスコアと正の相関を示し、プロピオン酸はFTMおよびTETRASスコアと負の相関を示した。TETRASおよび酢酸はWexnerスコアと負の相関を示した。 MDS-UPDRS協会が後援する統一パーキンソン病評価尺度、ミニメンタルステート検査（MMSE）、ハミルトンうつ病評価尺度（HAMD-17、17項目）、ハミルトン不安評価尺度（HAMA）、ホーエン・ヤール病期分類（HY）、SCFA、パーキンソン病自律神経症状アウトカム尺度（SCOPA-AUT）、ファナ・トロサ・マリン臨床振戦評価尺度（FTM）、TETRAS研究グループ（TRG）本態性振戦評価尺度。有意差は*P < 0.05および**P < 0.01で示される。
LEfSE解析を用いて腸内細菌叢の識別能力をさらに詳しく調べ、属レベルの相対存在量データを選択して詳細な解析を行った。ET群とHC群、およびET群とPD群の間で比較を行った。次に、2つの比較群における腸内細菌叢の相対存在量と糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）レベルについて、スピアマン相関分析を行った。
ET および CA の分析では、Faecalibacterium (酪酸と相関、r = 0.408、P < 0.001)、Lactobacillus (酪酸と相関、r = 0.283、P = 0.016)、Streptobacterium (プロピオン酸と相関、r = 0.327) が存在した。、P = 0.005; 酪酸と相関、r = 0.374、P = 0.001;イソ酪酸と相関するHowardella（プロピオン酸と相関するr = 0.242、P = 0.041）、Raoultella（プロピオン酸と相関するr = 0.249、P = 0.035）、およびCandidatus Arthromitus（イソ酪酸と相関するr = 0.302、P = 0.010）はETで減少し、糞便SCFAレベルと正の相関がある。しかし、Stenotropomonasの存在量はETで増加し、糞便イソ酪酸レベルと負の相関があった（r = -0.250、P = 0.034）。 FDR調整後、Faecalibacterium、Catenibacter、SCFA間の相関のみが有意なままであった（P ≤ 0.045）（図4および補足表5）。
ETとHCの相関分析。FDR調整後、Faecalibacterium（酪酸と正の相関）とStreptobacterium（プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸と正の相関）の存在量はETで減少しており、糞便SCFAレベルと正の相関があることがわかった。b ETとPDの相関分析。FDR調整後、有意な関連は見つからなかった。ET：本態性振戦、パーキンソン病、HC：健常対照群、SCFA。有意差は*P < 0.05および**P < 0.01で示されている。
ETとPDを比較分析したところ、ETではClostridium trichophytonが増加しており、糞便中のイソ吉草酸（r = -0.238、P = 0.041）およびイソ酪酸（r = -0.257、P = 0.027）と相関していることがわかった。FDR補正後も、いずれも有意であった（P≥0.295）（図4および補足表5）。
本研究は、ET患者とCUおよびPD患者における糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）レベルを調べ、腸内細菌叢の変化および症状の重症度との相関関係を包括的に検討した研究である。ET患者では糞便中のSCFAレベルが低下しており、臨床的重症度および腸内細菌叢の特異的な変化と関連していることがわかった。糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）の累積レベルは、ETをGCおよびPDから区別する指標となる。
GC患者と比較して、ET患者ではプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸の糞便中濃度が低い。プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸の組み合わせは、AUC 0.751 (95% CI: 0.634–0.867)、感度74.3%、特異度72.9%でETとHCを区別し、ETの潜在的な役割の診断バイオマーカーとして使用できることを示唆した。さらに分析した結果、糞便中のプロピオン酸濃度はWexnerスコアおよびSCOPA-AUTスコアと負の相関関係にあることがわかった。糞便中のイソ酪酸濃度はFTMスコアと逆相関関係にあった。一方、ETにおける酪酸濃度の低下は、SCFA産生微生物叢、Faecalibacterium、およびCategorybacterの存在量の減少と関連していた。さらに、ETにおけるカテニバクター属細菌の減少は、糞便中のプロピオン酸およびイソ酪酸レベルの低下とも関連していた。
大腸で産生される短鎖脂肪酸のほとんどは、主にH+依存性またはナトリウム依存性モノカルボン酸トランスポーターを介して大腸細胞に取り込まれます。吸収された短鎖脂肪酸は大腸細胞のエネルギー源として使用されますが、大腸細胞で代謝されないものは門脈循環に輸送されます18。短鎖脂肪酸は腸管運動に影響を与え、腸管バリア機能を強化し、宿主の代謝と免疫に影響を与える可能性があります19。以前の研究では、PD患者ではHCと比較して糞便中の酪酸、酢酸、プロピオン酸の濃度が低下していることがわかっています17。これは、我々の結果と一致しています。我々の研究では、ET患者で短鎖脂肪酸の減少が見つかりましたが、ETの病態における短鎖脂肪酸の役割についてはほとんどわかっていません。酪酸とプロピオン酸はGPCRに結合し、MAPKやNF-κB20シグナル伝達などのGPCR依存性シグナル伝達に影響を与える可能性があります。腸脳軸の基本概念は、腸内細菌によって分泌される短鎖脂肪酸（SCFA）が宿主のシグナル伝達に影響を与え、それによって腸と脳の機能に影響を与えるというものである。酪酸とプロピオン酸はヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性に対して強力な阻害効果を持ち21、酪酸は転写因子のリガンドとしても作用するため、主に遺伝子調節への影響により、宿主の代謝、分化、増殖に広範な影響を与える22。SCFAと神経変性疾患の証拠に基づくと、酪酸は、PDにおけるドーパミン作動性ニューロンの死を媒介する可能性のあるHDAC活性の障害を是正する能力があるため、治療候補と考えられている23,24,25。動物実験では、酪酸がPDモデルにおいてドーパミン作動性ニューロンの変性を予防し、運動障害を改善する能力も実証されている26,27。プロピオン酸は炎症反応を抑制し、血液脳関門（BBB）の完全性を保護することがわかっている28,29。研究により、プロピオン酸はPDモデルにおけるロテノン毒性に対するドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することが示されており30、プロピオン酸の経口投与はPDマウスにおけるドーパミン作動性ニューロンの喪失と運動障害を回復させることが示されています31。イソ酪酸の機能についてはほとんど知られていません。しかし、最近の研究では、マウスにB. ovaleを定着させると腸内SCFA含有量（酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉草酸を含む）と腸内GABA濃度が増加することが判明し、腸内細菌叢と腸内SCFA、神経伝達物質濃度との間に関連性が確立されていることが強調されています32。 ETでは、小脳の異常な病理学的変化には、プルキンエ細胞の軸索と樹状突起の変化、プルキンエ細胞の変位と消失、バスケット細胞の軸索の変化、プルキンエ細胞分布との上行線維接続の異常、歯状骨核のGABA受容体の変化が含まれ、これにより小脳からのGABA作動性出力が減少します3,4,33。SCFAがプルキンエ細胞の神経変性および小脳GABA産生の減少と関連しているかどうかは不明です。我々の結果はSCFAとETの間に強い関連性があることを示唆していますが、横断的研究デザインではSCFAとETの疾患プロセスとの因果関係についての結論を出すことはできません。糞便SCFAの連続測定やメカニズムを調べる動物実験など、さらなる縦断的追跡調査が必要です。
SCFAは結腸平滑筋の収縮を刺激すると考えられています34。SCFAが不足すると便秘の症状が悪化し、SCFAを補給すると便秘の症状が改善する可能性があります35。私たちの結果も、ET患者において糞便中のSCFA含有量の減少と便秘および自律神経機能障害の増加との間に有意な関連があることを示しています。ある症例報告では、腸内細菌叢移植により患者7の腸内細菌叢と過敏性腸症候群の両方が改善したことが示されており、腸内細菌叢とETの密接な関係がさらに示唆されています。したがって、糞便中のSCFA/腸内細菌叢は宿主の腸管運動と自律神経系の機能に影響を与える可能性があると考えています。
この研究では、ET群における糞便中のSCFAレベルの低下は、Faecalibacterium（酪酸に関連）およびStreptobacterium（プロピオン酸、酪酸、およびイソ酪酸に関連）の存在量の減少と関連していることがわかった。FDR補正後も、この関係は有意である。FaecalibacteriumとStreptobacteriumはSCFA産生微生物である。Faecalibacteriumは酪酸産生微生物として知られている36一方、Catenibacter発酵の主な産物は酢酸、酪酸、および乳酸である37。FaecalibacteriumはET群とHC群の両方で100%検出された。ET群の相対存在量の中央値は2.06%、HC群の中央値は3.28%であった（LDA 3.870）。カテゴリー細菌は、HC グループの 21.6% (8/37) で検出され、ET グループの 1 サンプル (1/35) でのみ検出されました。ET における連鎖球菌の減少と検出不能は、疾患の病原性との相関も示唆する可能性があります。HC グループにおける Catenibacter 種の相対存在量の中央値は 0.07% (LDA 2.129) でした。さらに、乳酸菌は糞便酪酸の変化と関連しており (P=0.016、FDR 調整後 P=0.096)、関節炎候補はイソ酪酸の変化と関連していました (P=0.016、FDR 調整後 P=0.072)。FDR 補正後、相関傾向のみが残りますが、統計的に有意ではありません。乳酸菌はSCFA（酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸）産生菌としても知られており38、Candidatus ArthromitusはTヘルパー17（Th17）細胞分化の特異的誘導菌であり、Th1/2およびTregは免疫バランス/Th17と関連している39。最近の研究では、糞便偽関節炎のレベル上昇が結腸炎症、腸管バリア機能障害、および全身性炎症に寄与する可能性があることが示唆されている40。ETではPDと比較してClostridium trichoidesのレベルが増加していた。Clostridium trichoidesの存在量はイソ吉草酸およびイソ酪酸と負の相関関係にあることがわかった。FDR調整後も両方とも有意であった（P≥0.295）。Clostridium pilosumは炎症と関連していることが知られている細菌であり、腸管バリア機能障害に寄与する可能性がある41。我々の以前の研究では、ET患者の腸内細菌叢の変化を報告した8。本研究では、ETにおける短鎖脂肪酸（SCFA）の変化についても報告し、腸内細菌叢異常とSCFAの変化との関連性を明らかにした。SCFAレベルの低下は、ETにおける腸内細菌叢異常および振戦の重症度と密接に関連している。これらの結果は、腸脳軸がETの発症機序において重要な役割を果たしている可能性を示唆しているが、動物モデルを用いたさらなる研究が必要である。
PD患者と比較して、ET患者の糞便中のイソ吉草酸とイソ酪酸のレベルは低い。イソ吉草酸とイソ酪酸の組み合わせは、AUC 0.743 (95% CI: 0.629–0.857)、感度74.3%、特異度62.9%でPDにおけるETを特定し、ETの鑑別診断におけるバイオマーカーとしての潜在的な役割を示唆している。糞便中のイソ吉草酸レベルは、FTMおよびTETRASスコアと負の相関関係にあった。糞便中のイソ酪酸レベルは、FTMスコアと負の相関関係にあった。イソ酪酸レベルの低下は、カタバクテリアの存在量の減少と関連していた。イソ吉草酸とイソ酪酸の機能についてはほとんど知られていない。以前の研究では、マウスに B. ovale を定着させると腸内 SCFA (酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉草酸を含む) の量と腸内 GABA 濃度が増加することが示されており、腸内細菌叢と腸内 SCFA/神経伝達物質濃度との間の腸内リンクが強調されています 32。興味深いことに、観察されたイソ酪酸レベルは PD 群と HC 群の間で類似していましたが、ET 群と PD (または HC) 群の間では異なっていました。イソ酪酸は、AUC 0.718 (95% CI: 0.599–0.836) で ET と PD を区別でき、AUC 0.655 (95% CI: 0.525–0.786) で ET と NC を識別できました。さらに、イソ酪酸レベルは振戦の重症度と相関しており、ET との関連性をさらに強めています。経口イソ酪酸が本態性振戦患者の振戦の重症度を軽減できるかどうかという問題は、さらなる研究に値する。
このように、ET患者では糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）含有量が減少しており、これはETの臨床的重症度および腸内細菌叢の特異的な変化と関連している。糞便中のプロピオン酸、酪酸、およびイソ酪酸はETの診断バイオマーカーとなる可能性があり、イソ酪酸およびイソ吉草酸はETの鑑別診断バイオマーカーとなる可能性がある。糞便中のイソ酪酸の変化は、他のSCFAの変化よりもETに対してより特異的である可能性がある。
本研究にはいくつかの限界があります。第一に、食習慣や食嗜好が腸内細菌叢の発現に影響を与える可能性があるため、異なる集団におけるより大規模な研究サンプルが必要であり、今後の研究では食物摂取頻度調査票などの包括的かつ体系的な食事調査を導入する必要があります。第二に、横断研究デザインでは、短鎖脂肪酸（SCFA）と本態性振戦（ET）の病態との因果関係に関する結論を出すことはできません。糞便中のSCFAを連続的に測定する長期追跡調査がさらに必要です。第三に、糞便中のSCFAレベルの診断能力および鑑別診断能力は、ET、健常対照群（HC）、およびパーキンソン病（PD）の独立したサンプルを使用して検証する必要があります。今後、より多くの独立した便サンプルを検査する必要があります。最後に、本コホートのPD患者は、ET患者よりも有意に罹病期間が短かった。私たちは主に、年齢、性別、およびBMIでET、PD、およびHCをマッチングしました。ET群とPD群の病態経過の違いを考慮し、さらなる比較のために、早期PD患者33名とET患者16名（罹病期間3年以下）も研究しました。 SCFAにおける群間差は、概ね我々の主要データと一致していた。さらに、疾患期間とSCFAの変化との間に相関関係は認められなかった。しかしながら、今後は、より大規模なサンプルで検証を完了するために、疾患期間が短い早期段階のPDおよびET患者を募集することが最善であろう。
本研究の実施計画は、上海交通大学医学院附属瑞金病院倫理委員会（RHEC2018-243）の承認を得た。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
2019 年 1 月から 2022 年 12 月の間に、上海交通大学医学部付属瑞金病院運動障害センタークリニックから 109 人の被験者 (ET 37 人、PD 37 人、HC 35 人) が本研究に含まれた。基準は、(1) 年齢 25 ～ 85 歳、(2) ET 患者は MDS ワーキンググループの基準 42 に従って診断され、PD は MDS 基準 43 に従って診断された、(3) すべての患者はサンプル採取前に抗 PD 薬を服用していなかった、(4) ET グループは便サンプル採取前に β 遮断薬のみを服用するか、関連薬を服用していなかった。年齢、性別、体格指数 (BMI) が一致する HC も選択された。除外基準は以下のとおりです。(1) ベジタリアン、(2) 栄養不良、(3) 消化管の慢性疾患 (炎症性腸疾患、胃潰瘍または十二指腸潰瘍を含む)、(4) 重度の慢性疾患 (悪性腫瘍を含む)、心不全、腎不全、血液疾患、(5) 消化管の大手術歴、(6) ヨーグルトの慢性的または定期的な摂取、(7) 1 ヶ月以内にプロバイオティクスまたは抗生物質の使用、(8) コルチコステロイド、プロトンポンプ阻害剤、スタチン、メトホルミン、免疫抑制剤または抗がん剤の慢性使用、(9) 臨床試験を妨げる重度の認知障害。
すべての被験者は、BMI を計算するために病歴、体重、身長の情報を提供し、神経学的検査と臨床評価を受けました。これには、ハミルトン不安評価尺度 (HAMA) 44 による不安スコア、ハミルトンうつ病評価尺度-17 (HAMD-17) 45 によるうつ病スコア、ウェクスナー便秘尺度 46 およびブリストル便スケール 47 を使用した便秘の重症度、ミニメンタルステート検査 (MMSE) 48 を使用した認知機能が含まれます。パーキンソン病の自律神経症状評価尺度 (SCOPA-AUT) 49 は、ET および PD 患者の自律神経機能障害を調べました。ファナ・トロス・マリン臨床振戦評価尺度 (FTM) および本態性振戦評価尺度 (TETRAS) 50 振戦研究グループ (TRG) 50 は、ET 患者で調べられました。米国パーキンソン病協会が後援するキンソン病評価尺度（MDS-）、UPDRSバージョン51、およびホーエン・ヤール（HY）バージョン52が検査された。
各参加者には、便採取容器を使用して朝に便サンプルを採取するように依頼した。容器を氷に移し、処理前に-80℃で保管した。SCFA分析は、Tiangene Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.のルーチン操作に従って実施した。各被験者から400 mgの新鮮な糞便サンプルを採取し、粉砕および超音波処理後にSCFAを使用して分析した。糞便中の選択されたSCFAは、ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）および液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（LC-MS/MS）を使用して分析した。
製造元の指示に従って、QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (QIAGEN、ドイツ、ヒルデン) を使用して、200 mg のサンプルから DNA を抽出した。微生物組成は、糞便から分離した DNA 上の 16 S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域を増幅してシーケンスすることにより決定した。サンプルを 1.2% アガロース ゲルで泳動して DNA をテストした。16S rRNA 遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅は、普遍的な細菌プライマー (357 F および 806 R) と Novaseq プラットフォーム上に構築された 2 段階アンプリコン ライブラリーを使用して実行した。
連続変数は平均値±標準偏差で表し、カテゴリ変数は数とパーセンテージで表します。分散の均一性を検定するために、Levene検定を使用しました。変数が正規分布している場合は両側t検定または分散分析（ANOVA）を使用して比較を行い、正規性または等分散性の仮定が満たされない場合は、ノンパラメトリックMann-Whitney U検定を使用しました。モデルの診断性能を定量化し、SCFAがET患者とHCまたはPD患者を区別する能力を調べるために、受信者操作特性（ROC）曲線下面積（AUC）を使用しました。SCFAと臨床的重症度との関係を調べるために、Spearman相関分析を使用しました。統計分析は、有意水準（P値およびFDR-Pを含む）を0.05（両側）に設定して、SPSSソフトウェア（バージョン22.0、SPSS Inc.、シカゴ、イリノイ州）を使用して実行しました。
16 S 配列は、Trimmomatic (バージョン 0.35)、Flash (バージョン 1.2.11)、UPARSE (バージョン v8.1.1756)、mothur (バージョン 1.33.3) および R (バージョン 3.6.3) ソフトウェアの組み合わせを使用して解析されました。生の 16S rRNA 遺伝子データは、UPARSE を使用して処理され、97% の同一性を持つ操作的分類単位 (OTU) が生成されました。分類は、参照データベースとして Silva 128 を使用して指定されました。相対存在量の属レベルのデータが、さらなる解析のために選択されました。線形判別分析 (LDA) 効果量分析 (LEfSE) は、α 閾値 0.05、効果量閾値 2.0 で、グループ (ET vs. HC、ET vs. PD) 間の比較に使用されました。LEfSE 分​​析によって識別された判別属は、SCFA の Spearman 相関分析にさらに使用されました。
研究デザインの詳細については、本論文に関連付けられているNatural Research Reportの要約を参照してください。
生の16Sシーケンスデータは、米国国立生物工学情報センター（NCBI）のBioProjectデータベース（SRP438900: PRJNA974928）に保存されています。URL：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP438900&o.=acc_s%3Aa。その他の関連データは、科学協力や本格的な研究プロジェクトを伴う学術交流など、合理的な要請があれば、責任著者に提供されます。当社の同意なしに第三者にデータを転送することは許可されていません。
オープンソースコードは、Trimmomatic（バージョン0.35）、Flash（バージョン1.2.11）、UPARSE（バージョンv8.1.1756）、mothur（バージョン1.33.3）、およびR（バージョン3.6.3）の組み合わせで、デフォルト設定または「方法」セクションを使用してのみ利用可能です。追加の説明情報は、合理的な要請があれば、責任著者に提供できます。
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