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プロピオン酸（PPA）は、自閉症スペクトラム障害などの神経発達障害におけるミトコンドリア機能不全の役割を研究するために使用されています。PPAはミトコンドリアの生合成、代謝、およびターンオーバーを阻害することが知られています。しかし、これらのメカニズムの複雑な時間的性質のため、PPAがミトコンドリアのダイナミクス、分裂、および融合に及ぼす影響は依然として問題となっています。ここでは、補完的な定量的イメージング技術を使用して、ニューロン様SH-SY5Y細胞におけるPPAがミトコンドリアの超微細構造、形態、およびダイナミクスにどのように影響するかを調べます。PPA（5 mM）は、ミトコンドリア面積（p < 0.01）、フェレット径および周囲長（p < 0.05）、および面積2（p < 0.01）の有意な減少を引き起こしました。ミトコンドリアイベントロケーター解析では、分裂および融合イベントが有意に増加（p < 0.05）し、ストレス条件下でミトコンドリアネットワークの完全性が維持されることが示されました。さらに、cMYC（p < 0.0001）、NRF1（p < 0.01）、TFAM（p < 0.05）、STOML2（p < 0.0001）、およびOPA1（p < 0.05）のmRNA発現が有意に減少しました。01）。これは、ストレス条件下で機能を維持するためにミトコンドリアの形態、生合成、およびダイナミクスが再構築されることを示しています。私たちのデータは、PPAがミトコンドリアダイナミクスに及ぼす影響に関する新たな知見を提供し、ミトコンドリアストレス応答に関与する複雑な制御メカニズムを研究するためのイメージング技術の有用性を強調しています。
ミトコンドリアは、エネルギー産生や生合成といった典型的な役割を超えて、様々な細胞機能において不可欠な役割を担っています。ミトコンドリア代謝は、カルシウムシグナル伝達、代謝および酸化還元恒常性、炎症シグナル伝達、エピジェネティック修飾、細胞増殖、分化、プログラム細胞死の重要な調節因子です1。特に、ミトコンドリア代謝は神経細胞の発達、生存、機能に不可欠であり、神経病理の様々な症状に広く関与しています2,3,4。
過去 10 年間で、代謝状態は神経発生、分化、成熟、可塑性の中心的な調節因子として浮上してきました 5,6。最近では、ミトコンドリアの形態とダイナミクスが、細胞内に健康なミトコンドリアのプールを維持する動的なプロセスである有糸分裂の特に重要な構成要素となっています。ミトコンドリアのダイナミクスは、ミトコンドリアの生合成と生体エネルギーからミトコンドリアの分裂、融合、輸送、除去に至るまで、複雑で相互依存的な経路によって調節されています 7,8。これらの統合メカニズムのいずれかが破壊されると、健康なミトコンドリア ネットワークの維持が損なわれ、神経発達に深刻な機能的影響が生じます 9,10。実際、ミトコンドリアのダイナミクスの調節異常は、自閉症スペクトラム障害 (ASD) を含む多くの精神疾患、神経変性疾患、神経発達障害で観察されています 11,12。
ASDは、複雑な遺伝的およびエピジェネティックな構造を持つ異質な神経発達障害です。ASDの遺伝性は疑いの余地がありませんが、その根底にある分子病因は依然として十分に理解されていません。前臨床モデル、臨床研究、およびマルチオミクス分子データセットからの蓄積されたデータは、ASDにおけるミトコンドリア機能障害の証拠をますます多く提供しています13,14。私たちは以前、ASD患者のコホートでゲノムワイドDNAメチル化スクリーニングを実施し、ミトコンドリア代謝経路に沿ってクラスター化された差次的メチル化遺伝子を特定しました15。その後、ASDにおけるミトコンドリア生合成とダイナミクスの中心的制御因子の差次的メチル化を報告し、これはmtDNAコピー数の増加と尿代謝プロファイルの変化に関連していました16。私たちのデータは、ミトコンドリアのダイナミクスと恒常性がASDの病態生理において中心的な役割を果たしているという証拠をますます多く提供しています。したがって、ミトコンドリアの動態、形態、機能の関係性に関するメカニズム的理解を深めることは、二次的なミトコンドリア機能障害を特徴とする神経疾患に関する継続的な研究の重要な目標である。
分子生物学的手法は、ミトコンドリアのストレス応答における特定の遺伝子の役割を研究するためによく用いられる。しかし、このアプローチは、有糸分裂制御機構の多面的かつ時間的な性質によって制限される可能性がある。さらに、ミトコンドリア遺伝子の差次的発現は、特に通常分析される遺伝子の数が限られているため、機能変化の間接的な指標である。そのため、ミトコンドリア機能と生体エネルギーを研究するためのより直接的な方法が提案されている17。ミトコンドリアの形態は、ミトコンドリアのダイナミクスと密接に関連している。ミトコンドリアの形状、連結性、構造は、エネルギー産生とミトコンドリアおよび細胞の生存にとって重要である5,18。さらに、有糸分裂のさまざまな構成要素は、ミトコンドリアの形態の変化に焦点を当てており、これはミトコンドリア機能不全の有用なエンドポイントとして機能し、その後のメカニズム研究の基礎を提供する可能性がある。
透過型電子顕微鏡（TEM）を用いることでミトコンドリアの形態を直接観察することができ、細胞の超微細構造を詳細に研究することが可能になります。TEMは、細胞集団における遺伝子転写、タンパク質発現、またはミトコンドリア機能パラメーターだけに頼るのではなく、個々のミトコンドリアの解像度でミトコンドリアクリステの形態、形状、構造を直接可視化します17,19,20。さらに、TEMは、ミトコンドリアの機能と恒常性において重要な役割を果たす小胞体やオートファゴソームなどの他の細胞小器官とミトコンドリアとの相互作用の研究を容易にします21,22。したがって、TEMは、特定の経路や遺伝子に焦点を当てる前に、ミトコンドリア機能障害を研究するための良い出発点となります。ミトコンドリアの機能が神経病理学においてますます重要になるにつれ、試験管内神経細胞モデルにおいてミトコンドリアの形態と動態を直接的かつ定量的に研究できる能力が明らかに必要とされている。
本稿では、自閉スペクトラム症におけるミトコンドリア機能障害の神経細胞モデルにおけるミトコンドリアダイナミクスを検討する。我々は以前、ミトコンドリアプロピオニル-CoAカルボキシラーゼ酵素PCCのサブユニットであるプロピオニル-CoAカルボキシラーゼβ（PCCB）のメチル化異常をASDで報告した15。PCCの調節異常は、プロピオン酸（PPA）23,24,25を含むプロピオニル誘導体の毒性蓄積を引き起こすことが知られている。PPAは、生体内で神経代謝を阻害し行動を変化させることが示されており、ASDに関与する神経発達メカニズムを研究するための確立された動物モデルである26,27,28。さらに、PPAは、試験管内でミトコンドリア膜電位、生合成、呼吸を阻害することが報告されており、神経細胞におけるミトコンドリア機能障害のモデル化に広く用いられている29,30。しかしながら、PPA誘発性ミトコンドリア機能障害がミトコンドリアの形態および動態に及ぼす影響については、依然として十分に解明されていない。
本研究では、相補的なイメージング技術を用いて、SH-SY5Y細胞におけるPPAがミトコンドリアの形態、動態、および機能に及ぼす影響を定量化した。まず、ミトコンドリアの形態および超微細構造の変化を可視化するためのTEM法を開発した17,31,32。ミトコンドリアの動的な性質33を考慮し、ミトコンドリアイベントローカライザー（MEL）解析を用いて、PPAストレス下における分裂と融合イベントのバランス、ミトコンドリア数、および体積の変化を定量化した。最後に、ミトコンドリアの形態および動態が、生合成、分裂、および融合に関与する遺伝子の発現変化と関連しているかどうかを調べた。これらの結果を総合すると、ミトコンドリアの動態を制御するメカニズムの複雑さを解明することの難しさが明らかになった。 SH-SY5Y細胞における有糸分裂の測定可能な収束的終点として、ミトコンドリア形態の研究において透過型電子顕微鏡（TEM）が有用であることを強調する。さらに、TEMデータは、代謝ストレスに対する動的な事象も捉えるイメージング技術と組み合わせることで、最も豊富な情報が得られることを強調する。神経細胞の有糸分裂を支える分子制御機構のさらなる解明は、神経系および神経変性疾患におけるミトコンドリアの役割に関する重要な知見をもたらす可能性がある。
ミトコンドリアストレスを誘導するために、SH-SY5Y細胞を3 mMおよび5 mMプロピオン酸ナトリウム（NaP）を用いてPPAで処理した。TEMの前に、サンプルは高圧凍結および凍結を用いて極低温サンプル調製に供した（図1a）。我々は、3つの生物学的複製にわたるミトコンドリア集団の8つの形態学的パラメータを測定するために、自動化されたミトコンドリア画像解析パイプラインを開発した。PPA処理により、4つのパラメータ（面積2、面積、周囲長、およびフェレット径）が有意に変化することがわかった（図1b～e）。面積2は、3 mMおよび5 mMのPPA処理の両方で有意に減少した（それぞれp = 0.0183およびp = 0.002）（図1b）が、面積（p = 0.003）、周囲長（p = 0.0106）、およびフェレット径はすべて有意に減少した。 5 mM 処理群では、対照群と比較して有意な減少 (p = 0.0172) が見られました (図 1c – e)。面積と周囲長の有意な減少は、5 mM PPA で処理した細胞ではミトコンドリアがより小さく丸みを帯びており、これらのミトコンドリアは対照細胞のものよりも細長くなかったことを示しています。これは、粒子の端間の最大距離の減少を示す独立したパラメータであるフェレット径の有意な減少とも一致しています。クリステの超微細構造の変化が観察されました。PPA ストレスの影響下でクリステが目立たなくなりました (図 1a、パネル B)。ただし、すべての画像がクリステの超微細構造を明確に反映しているわけではないため、これらの変化の定量的分析は行われませんでした。これらの TEM データは、次の 3 つの可能性のあるシナリオを反映している可能性があります。(1) PPA は分裂を促進するか融合を阻害し、既存のミトコンドリアのサイズを縮小させます。 （２）生合成の促進により、より小型の新しいミトコンドリアが生成される、または（３）両方のメカニズムが同時に誘導される。これらの状態はTEMでは区別できないが、顕著な形態学的変化は、PPAストレス下でのミトコンドリアの恒常性および動態の変化を示している。我々はその後、これらの動態とそれらの根底にある潜在的なメカニズムをさらに特徴づけるために、追加のパラメーターを検討した。
プロピオン酸（PPA）はミトコンドリアの形態を変化させる。（a）透過型電子顕微鏡（TEM）の代表的な画像。PPA処理濃度が増加するにつれてミトコンドリアのサイズが減少し、ミトコンドリアがより小さく丸みを帯びるようになる。それぞれ0 mM（未処理）、3 mM、5 mM。赤い矢印はミトコンドリアを示す。（b～e）24時間PPA処理したSH-SY5Y細胞をTEM用に準備し、Fiji/ImageJを使用して結果を解析した。8つのパラメーターのうち4つは、コントロール（未処理、0 mM PPA）細胞と処理済み（3 mMおよび5 mM PPA）細胞の間で有意差を示した。（b）領域2、（c）面積、（d）周囲長、（e）フェレット径。一元配置分散分析（コントロール対処理）とダネットの多重比較検定を使用して有意差（p < 0.05）を判定した。データポイントは各細胞の平均ミトコンドリア値を表し、エラーバーは平均値±標準誤差を表します。表示されているデータはn=3、各反復につき少なくとも24個の細胞、合計266枚の画像が解析されたことを示しています。*はp<0.05、**はp<0.01を示します。
ミトコンドリアのダイナミクスがPPAにどのように反応するかをさらに特徴づけるために、テトラメチルローダミンエチルエステル（TMRE）でミトコンドリアを染色し、タイムラプス顕微鏡とMEL分析を使用して、3 mMおよび5 mMのPPAで24時間後のミトコンドリアの位置と量を定量化した。分裂および融合イベントの処理。（図2a）。MEL分析後、ミトコンドリア構造の数とその平均体積を定量化するために、ミトコンドリアをさらに分析した。 3 mM で発生する分裂イベントの数 [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] は、対照と比較して 5 mM で発生する分裂イベントの数 [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] および融合イベント [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] と比較して、わずかではあるが有意に増加していることが観察された (図 3b)。ミトコンドリアの数は、3 mM [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] および 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] の両方で有意に増加したが (図 3c)、各ミトコンドリア構造の平均体積は変化しなかった (図 3c)。3d)。これらのことから、ミトコンドリアダイナミクスの再構築は、ミトコンドリアネットワークの完全性を維持する代償反応として機能していることが示唆される。3 mM PPAにおける分裂イベント数の増加は、ミトコンドリア数の増加が部分的にミトコンドリア分裂によるものであることを示唆しているが、平均ミトコンドリア体積が実質的に変化していないことを考慮すると、追加の代償反応として生合成を排除することはできない。しかし、これらのデータは、TEMで観察されたより小さく丸いミトコンドリア構造と一致しており、PPAによって誘発されるミトコンドリアダイナミクスの大きな変化も示している。
プロピオン酸（PPA）は、ネットワークの完全性を維持するために動的なミトコンドリアのリモデリングを誘導します。SH-SY5Y細胞を培養し、3 mMおよび5 mMのPPAで24時間処理した後、TMREおよびHoechst 33342で染色し、MEL分析を行いました。（a）各条件における時間2（t2）でのカラーおよび二値化された最大強度投影を示す代表的なタイムラプス顕微鏡画像。各二値画像で示された選択された領域は、時間の経過に伴う動態を示すために、3つの異なる時間フレーム（t1～t3）で強調表示され、3Dで表示されます。融合イベントは緑色で強調表示され、分裂イベントは緑色で強調表示されます。赤色で表示されます。（b）条件ごとの動的イベントの平均数。（c）細胞あたりのミトコンドリア構造の平均数。（d）細胞あたりの各ミトコンドリア構造の平均体積（µm3）。示されているデータは、処理グループごとにn = 15個の細胞を代表するものです。表示されている誤差範囲は平均値±標準誤差を表し、スケールバーは10μm、*p<0.05です。
プロピオン酸（PPA）はミトコンドリアダイナミクスに関連する遺伝子の転写抑制を引き起こします。SH-SY5Y細胞を3および5 mMのPPAで24時間処理しました。相対的な遺伝子定量はRT-qPCRを使用して実行し、B2Mで正規化しました。ミトコンドリア生合成遺伝子は(a) cMYC、(b) TFAM、(c) NRF1、(d) NFE2L2です。ミトコンドリア融合および分裂遺伝子は(e) STOML2、(f) OPA1、(g) MFN1、(h) MFN2、(i) DRP1です。有意差(p < 0.05)は、一元配置分散分析(コントロール vs. 処理)およびDunnettの多重比較検定を使用してテストしました。*はp < 0.05、**はp < 0.01、****はp < 0.0001を示します。棒グラフは平均発現量±標準誤差（SEM）を表します。示されているデータは、n = 3（STOML2、OPA1、TFAM）、n = 4（cMYC、NRF1、NFE2L2）、およびn = 5（MFN1、MFN2、DRP1）の生物学的複製に基づいています。
TEMとMELの解析結果を合わせると、PPAがミトコンドリアの形態とダイナミクスを変化させることが示唆される。しかし、これらのイメージング技術では、これらのプロセスを駆動する根本的なメカニズムについての洞察は得られない。そこで、PPA処理に対するミトコンドリアのダイナミクス、生合成、および有糸分裂の9つの主要な調節因子のmRNA発現を調べた。3 mMおよび5 mMのPPAで24時間処理した後、細胞骨髄腫癌遺伝子（cMYC）、核呼吸因子（NRF1）、ミトコンドリア転写因子1（TFAM）、NFE2様転写因子BZIP（NFE2L2）、ガストリン様タンパク質2（STOML2）、視神経萎縮1（OPA1）、ミトフシン1（MFN1）、ミトフシン2（MFN2）、およびダイナミン関連タンパク質1（DRP1）を定量した。 3 mM (それぞれ p = 0.0053、p = 0.0415、p < 0.0001) および 5 mM (それぞれ p = 0.0031、p = 0.0233、p < 0.0001) PPA 処理を観察した (図 3a–c)。mRNA 発現の減少は用量依存的であった。cMYC、NRF1、TFAM の発現は、3 mM ではそれぞれ 5.7 倍、2.6 倍、1.9 倍に減少し、5 mM ではそれぞれ 11.2 倍、3 倍、2.2 倍に減少した。対照的に、中心的な酸化還元生合成遺伝子 NFE2L2 は、PPA のどの濃度でも変化しなかったが、同様の用量依存的な発現減少傾向が観察された (図 3d)。
また、分裂と融合の調節に関与する古典的な遺伝子の発現も調べた。STOML2は融合、ミトファジー、生合成に関与すると考えられており、その発現は3 mM（2.4倍の変化）および5 mM（2.8倍の変化）のPPAによって有意に減少した（p < 0.0001）（図1）。3d）。同様に、OPA1融合遺伝子の発現は3 mM（1.6倍の変化）および5 mM（1.9倍の変化）のPPAで減少した（それぞれp = 0.006およびp = 0.0024）（図3f）。しかし、24時間のPPAストレス下では、融合遺伝子MFN1、MFN2、または分裂遺伝子DRP1の発現に有意な差は見られなかった（図3g～i）。さらに、同じ条件下では、4つの融合および分裂タンパク質（OPA1、MFN1、MFN2、およびDRP1）のレベルは変化しなかったことがわかりました（図4a～d）。これらのデータは、ある時点におけるデータであり、PPAストレスの初期段階におけるタンパク質の発現や活性レベルの変化を反映していない可能性があることに注意することが重要です。しかし、cMYC、NRF1、TFAM、STOML2、およびOPA1の発現の大幅な減少は、ミトコンドリアの代謝、生合成、および動態の転写調節異常が著しいことを示しています。さらに、これらのデータは、ミトコンドリア機能の最終状態の変化を直接研究するためのイメージング技術の有用性を強調しています。
プロピオン酸（PPA）処理後、融合因子および分裂因子タンパク質のレベルは変化しなかった。SH-SY5Y細胞を3および5 mMのPPAで24時間処理した。タンパク質レベルはウェスタンブロット分析により定量し、発現レベルは総タンパク質に対して正規化した。標的タンパク質および総タンパク質の平均タンパク質発現と代表的なウェスタンブロットを示す。a – OPA1、b – MFN1、c – MFN2、d – DRP1。棒グラフは平均±SEMを表し、示されているデータはn = 3の生物学的複製を代表するものである。多重比較（p < 0.05）は、一元配置分散分析およびダネット検定を用いて行った。元のゲルおよびブロットは図S1に示す。
ミトコンドリア機能障害は、代謝性疾患、心血管疾患、筋疾患から神経疾患に至るまで、多系統疾患と関連しています1,10。多くの神経変性疾患はミトコンドリア機能障害と関連しており、脳の生涯を通じてこれらの細胞小器官が重要であることを示しています。これらの疾患には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ASD3,4,18が含まれます。しかし、これらの疾患を研究するための脳組織へのアクセスは、特にメカニズムレベルでは困難であり、細胞モデルシステムが代替手段として必要となります。本研究では、PPA処理したSH-SY5Y細胞を用いた細胞モデルシステムを使用して、神経疾患、特に自閉症スペクトラム障害で観察されるミトコンドリア機能障害を再現します。このPPAモデルを使用してニューロンのミトコンドリアダイナミクスを研究することで、ASDの病因に関する洞察が得られる可能性があります。
我々は、TEM を用いてミトコンドリア形態の変化を観察する可能性を探った。TEM の効果を最大限に引き出すには、正しく使用する必要があることに留意することが重要である。凍結標本の作製により、細胞成分を固定し、アーティファクトの形成を減らすことで、神経構造をより良く保存することができる 34。これと一致して、我々は、神経細胞様 SH-SY5Y 細胞が完全な細胞内小器官と伸長したミトコンドリアを有していることを観察した (図 1a)。これは、神経細胞モデルにおけるミトコンドリア形態の研究に凍結標本作製技術が有用であることを示している。定量的測定は TEM データの客観的な分析に不可欠であるが、ミトコンドリア形態の変化を確認するために測定すべき特定のパラメータについてはまだ合意が得られていない。ミトコンドリアの形態を定量的に調べた多数の研究17,31,32に基づき、面積、面積2、アスペクト比、周囲長、円形度、度、フェレット径、真円度という8つの形態学的パラメータを測定する自動ミトコンドリア画像解析パイプラインを開発しました。
その中で、PPAは面積2、面積、周囲長、およびフェレット径を著しく減少させた（図1b～e）。これは、ミトコンドリアがより小さく丸みを帯びたことを示しており、PPA30誘発性ミトコンドリアストレス72時間後にミトコンドリア面積が減少することを示した以前の研究と一致している。これらの形態学的特徴は、ミトコンドリア分裂を示している可能性があり、これは損傷した構成要素をミトコンドリアネットワークから隔離し、ミトファジー35,36,37を介してそれらの分解を促進するために必要なプロセスである。一方、平均ミトコンドリアサイズの減少は、生合成の増加に関連している可能性があり、その結果、小さな新生ミトコンドリアが形成される。分裂または生合成の増加は、ミトコンドリアストレスに対する有糸分裂を維持するための代償反応を表している。ただし、ミトコンドリアの成長の減少、融合の障害、またはその他の状態は排除できない。
TEMによって作成された高解像度画像では、個々のミトコンドリアのレベルで形態学的特徴を決定できますが、この方法では、ある時点での2次元のスナップショットしか得られません。代謝ストレスに対する動的な応答を研究するために、ミトコンドリアをTMREで染色し、MEL解析を用いたタイムラプス顕微鏡を使用しました。これにより、時間の経過に伴うミトコンドリアネットワークの変化をハイスループットで3D可視化できます33,38。PPAストレス下でミトコンドリアダイナミクスに微妙だが重要な変化が見られました（図2）。3 mMでは、分裂イベントの数が有意に増加しましたが、融合イベントはコントロールと同じままでした。5 mM PPAでは、分裂イベントと融合イベントの両方の数が増加しましたが、これらの変化はほぼ比例しており、分裂と融合の速度論は高濃度で平衡に達することを示唆しています（図2b）。 3 mM PPAと5 mM PPAの両方でミトコンドリアの平均体積は変化せず、ミトコンドリアネットワークの完全性が維持されていることが示された（図2d）。これは、動的なミトコンドリアネットワークが軽度の代謝ストレスに反応して、ネットワークの断片化を引き起こすことなく効果的に恒常性を維持できる能力を反映している。3 mM PPAでは、分裂の増加は新しい平衡状態への移行を促進するのに十分であるが、より高濃度のPPAによって誘発されるストレスに反応するには、より深刻な動態的リモデリングが必要となる。
PPAストレス濃度が2つの場合、ミトコンドリアの数は増加しましたが、平均ミトコンドリア体積は有意に変化しませんでした（図2c）。これは、生合成の増加または分裂の増加による可能性がありますが、平均ミトコンドリア体積の有意な減少がないことを考えると、生合成が増加している可能性が高いです。しかし、図2のデータは、2つの代償機構の存在を支持しています。1つは、ミトコンドリア分裂のアップレギュレーションと一致する分裂イベント数の増加、もう1つは、ミトコンドリア生合成と一致するイベント数の増加です。最終的に、軽度のストレスに対する動的な代償は、分裂、融合、生合成、およびミトファジーを含む同時プロセスから構成される可能性があります。以前の著者らは、PPAが有糸分裂30,39とミトファジー29を促進することを示しましたが、我々はPPAに応答してミトコンドリアの分裂と融合ダイナミクスの再構築の証拠を提供します。これらのデータは、TEMで観察された形態学的変化を裏付けるとともに、PPA誘発性ミトコンドリア機能障害に関連するメカニズムについてさらなる知見を提供する。
TEM解析もMEL解析も、観察された形態変化の根底にある遺伝子制御機構の直接的な証拠を提供しなかったため、ミトコンドリアの代謝、生合成、およびダイナミクスに関与する遺伝子のRNA発現を調べた。cMYCプロトオンコジーンは、ミトコンドリア、解糖、アミノ酸および脂肪酸代謝の調節に関与する転写因子である40。さらに、cMYCは、NRF1およびTFAM41を含む、ミトコンドリアの転写、翻訳、および複合体アセンブリに関与する約600のミトコンドリア遺伝子の発現を調節することが知られている。NRF1およびTFAMは、PGC-1αの下流で作用してmtDNA複製を活性化する、有糸分裂の2つの中心的な調節因子である。この経路はcAMPおよびAMPKシグナル伝達によって活性化され、エネルギー消費および代謝ストレスに敏感である。PPAの影響が酸化ストレスによって媒介されるかどうかを判断するために、ミトコンドリア生合成の酸化還元調節因子であるNFE2L2も調べた。
NFE2L2の発現は変化しなかったものの、3 mMおよび5 mMのPPAで24時間処理した後、cMYC、NRF1、TFAMの発現が用量依存的に一貫して減少することがわかった（図3a～c）。cMYCの発現低下は、ミトコンドリアストレスへの応答として以前に報告されており42、逆に、cMYCの発現低下は、ミトコンドリア代謝、ネットワーク接続性、膜分極の再構築によりミトコンドリア機能不全を引き起こす可能性がある43。興味深いことに、cMYCはミトコンドリアの分裂と融合の調節にも関与しており42,43、細胞分裂中にDRP1のリン酸化とミトコンドリア局在を増加させることが知られており44、神経幹細胞におけるミトコンドリアの形態再構築を媒介することも知られている45。実際、cMYC欠損線維芽細胞はミトコンドリアのサイズが縮小しており、これはPPA43ストレスによって誘発される変化と一致する。これらのデータは、cMYCとミトコンドリアダイナミクスの間の興味深い、しかしまだ不明な関係を示しており、PPAストレス誘発性リモデリングに関する今後の研究における興味深い標的となる。
NRF1とTFAMの減少は、cMYCが重要な転写活性化因子としての役割を担っていることと一致しています。これらのデータは、ヒト結腸癌細胞における以前の研究とも一致しており、PPAが22時間後にNRF1 mRNAの発現を減少させ、それがATPの枯渇とROS46の増加に関連していたことを示しています。これらの著者らはまた、TFAMの発現が8.5時間後に増加したが、22時間後にはベースラインレベルに戻ったと報告しています。対照的に、Kimら（2019）は、SH-SY5Y細胞において4時間のPPAストレス後にTFAM mRNAの発現が有意に減少したことを示しましたが、72時間後にはTFAMタンパク質の発現が有意に増加し、mtDNAコピー数も有意に増加しました。したがって、24時間後に観察されたミトコンドリア生合成遺伝子の数の減少は、ミトコンドリア数の増加が、より早い時点での生合成の活性化に関連している可能性を排除するものではありません。これまでの研究では、PPAはSH-SY5Y細胞において4時間30分でPGC-1α mRNAおよびタンパク質を著しく上方制御し、一方プロピオン酸は12時間39分でP​​GC-1αを介して仔牛肝細胞におけるミトコンドリア生合成を促進することが示されている。興味深いことに、PGC-1αはNRF1およびTFAMの直接的な転写調節因子であるだけでなく、分裂および融合を調節することによってMFN2およびDRP1の活性を調節することも示されている47。これらのことから、PPAによって誘導されるミトコンドリアの代償応答を調節するメカニズムが密接に連動していることが強調される。さらに、我々のデータは、PPAストレス下での生合成および代謝の転写調節の著しい調節異常を反映している。
STOML2、OPA1、MFN1、MFN2、DRP1遺伝子は、ミトコンドリアの分裂、融合、ダイナミクスの中心的な調節因子である37,48,49。ミトコンドリアのダイナミクスに関与する遺伝子は他にも多数あるが、STOML2、OPA1、MFN2は以前にASDコホートでメチル化の差異が認められており16、いくつかの独立した研究では、ミトコンドリアストレスに応答してこれらの転写因子に変化が生じることが報告されている50,51。52. OPA1とSTOML2の両方の発現は、3 mMおよび5 mM PPA処理によって有意に減少した（図3e、f）。OPA1は、MFN1および2との直接的な相互作用を介してミトコンドリア融合の古典的な調節因子の1つであり、クリステのリモデリングとミトコンドリアの形態に役割を果たしている53。 STOML2がミトコンドリアの動態において果たす正確な役割は依然として不明であるが、ミトコンドリアの融合、生合成、およびミトファジーに関与していることを示唆する証拠がある。
STOML2はミトコンドリア呼吸結合と呼吸鎖複合体の形成の維持に関与しており54,55、がん細胞の代謝特性を大きく変化させることが示されている56。研究によると、STOML2はBANおよびカルジオリピンとの相互作用を介してミトコンドリア膜電位と生合成を促進することが示されている55, 57, 58。さらに、独立した研究では、STOML2とPINK1の相互作用がミトファジーを調節することが示されている59,60。注目すべきことに、STOML2はMFN2と直接相互作用して安定化することが報告されており、OPA1分解に関与するプロテアーゼを阻害することによって長いOPA1アイソフォームを安定化させる上でも重要な役割を果たしている53,61,62。PPA反応で観察されるSTOML2発現の減少は、これらの融合タンパク質をユビキチンおよびプロテアソーム依存性経路による分解に対してより感受性にする可能性がある48。 PPAに対する動的な応答におけるSTOML2とOPA1の正確な役割は不明であるが、これらの融合遺伝子の発現低下（図3）は分裂と融合のバランスを崩し、ミトコンドリアサイズの減少（図3）につながる可能性がある。1)
一方、OPA1タンパク質の発現は24時間後も変化せず、MFN1、MFN2、またはDRP1のmRNAおよびタンパク質レベルはPPA処理後も有意な変化を示さなかった（図3g-i、図4）。これは、ミトコンドリアの融合と分裂に関与するこれらの因子の調節に変化がないことを示している可能性がある。しかし、これら4つの遺伝子のそれぞれが、タンパク質活性を制御する転写後修飾（PTM）によっても調節されていることに留意すべきである。OPA1には8つの代替スプライスバリアントがあり、ミトコンドリア内でタンパク質分解的に切断されて2つの異なるアイソフォームが生成される63。長いアイソフォームと短いアイソフォームのバランスが、最終的にミトコンドリアの融合とミトコンドリアネットワークの維持におけるOPA1の役割を決定する64。 DRP1 の活性はカルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) のリン酸化によって調節され、DRP1 の分解はユビキチン化と SUMO 化によって調節される 65。最後に、DRP1 と MFN1/2 はどちらも GTPase であるため、活性はミトコンドリアでの GTP 産生速度によって影響を受ける可能性がある 66。したがって、これらのタンパク質の発現は一定のままであるが、これはタンパク質の活性や局在の変化を反映していない可能性がある 67,68。実際、既存の PTM タンパク質レパートリーは、急性ストレス応答を媒介する第一線の防御として機能することが多い。我々のモデルで中程度の代謝ストレスが存在する場合、PTM は融合タンパク質と分裂タンパク質の活性の増加を促進し、mRNA またはタンパク質レベルでのこれらの遺伝子の追加的な活性化を必要とせずにミトコンドリアの完全性を十分に回復させる可能性が高い。
総合すると、上記のデータは、ミトコンドリア形態の複雑で時間依存的な制御と、これらのメカニズムを解明することの難しさを浮き彫りにしている。遺伝子発現を研究するには、まず経路内の特定の標的遺伝子を特定する必要がある。しかし、我々のデータは、同じ経路内の遺伝子が同じストレスに対して同じように反応するとは限らないことを示している。実際、以前の研究では、同じ経路内の異なる遺伝子が異なる時間的応答プロファイルを示す可能性があることが示されている30,46。さらに、転写と遺伝子機能の関係を阻害する複雑な転写後メカニズムが存在する。プロテオミクス研究は、PTMとタンパク質機能の影響についての洞察を提供することができるが、低スループット法、高い信号対雑音比、解像度の低さなどの課題も抱えている。
このような状況において、TEMとMELを用いたミトコンドリア形態の研究は、ミトコンドリアの動態と機能の関係、そしてそれが疾患にどのように影響するかについての根本的な疑問に取り組む大きな可能性を秘めている。最も重要なのは、TEMがミトコンドリアの機能不全と動態の収束エンドポイントとしてミトコンドリア形態を直接測定する方法を提供することである⁵¹。MELもまた、3次元の細胞環境における分裂と融合イベントを直接可視化する方法を提供し、遺伝子発現の変化がない場合でも動的なミトコンドリアリモデリングを定量化することを可能にする³³。ここでは、二次性ミトコンドリア疾患におけるミトコンドリアイメージング技術の有用性を強調する。これらの疾患は通常、急性ミトコンドリア損傷ではなく、ミトコンドリアネットワークの微妙なリモデリングを特徴とする慢性的な軽度の代謝ストレスによって特徴付けられる。しかし、慢性ストレス下で有糸分裂を維持するために必要なミトコンドリア補償は、深刻な機能的影響をもたらす。神経科学の分野において、これらの代償機構をより深く理解することは、ミトコンドリア機能障害に関連する多面的神経病理に関する重要な情報を提供する可能性がある。
最終的に、我々のデータは、神経細胞のミトコンドリアダイナミクスを制御する遺伝子発現、タンパク質修飾、およびタンパク質活性間の複雑な相互作用の機能的影響を理解するためのイメージング技術の有用性を強調している。我々は、ASDのミトコンドリア成分に関する知見を得るために、神経細胞モデルでミトコンドリア機能障害をモデル化するためにPPAを使用した。PPAで処理したSH-SY5Y細胞は、ミトコンドリアの形態に変化を示した。TEMで観察すると、ミトコンドリアは小さく丸くなり、クリステは不明瞭になった。MEL解析によると、これらの変化は、軽度の代謝ストレスに応答してミトコンドリアネットワークを維持するために分裂と融合イベントの増加と同時に発生する。さらに、PPAはミトコンドリア代謝と恒常性の転写調節を著しく阻害する。我々は、PPAストレスによって阻害される主要なミトコンドリア調節因子としてcMYC、NRF1、TFAM、STOML2、およびOPA1を同定し、これらがPPA誘発性のミトコンドリア形態および機能の変化を媒介する役割を担っている可能性を示唆した。PPA誘発性の遺伝子発現、タンパク質活性、局在、および翻訳後修飾における時間的変化をより詳細に特徴づけるためには、今後の研究が必要である。我々のデータは、ミトコンドリアストレス応答を媒介する調節機構の複雑さと相互依存性を浮き彫りにし、より的を絞ったメカニズム研究においてTEMやその他のイメージング技術が有用であることを示している。
SH-SY5Y細胞株（ECACC、94030304-1VL）はSigma-Aldrich社から購入した。SH-SY5Y細胞は、20%ウシ胎児血清（FBS）（10493106、ThermoFisher Scientific）および1%ペニシリン-ストレプトマイシン（P4333-20ML、Sigma-Aldrich）を添加した25 cm2フラスコ内で、ダルベッコ改変イーグル培地/F-12栄養混合物（DMEM/F-12）およびL-グルタミン（SC09411、ScienCell）を用いて、37℃、5% CO2の条件下で培養した。細胞は、0.05% トリプシン-EDTA (15400054、ThermoFisher Scientific) を使用して 80% コンフルエンスになるまで継代培養し、300 g で遠心分離し、約 7 × 10⁵ 細胞/ml の密度で播種した。すべての実験は、継代 19～22 の未分化 SH-SY5Y 細胞で実施した。PPA は NaP として投与する。NaP 粉末 (CAS No. 137-40-6、化学式 C3H5NaO2、P5436-100G、Sigma-Aldrich) を温かい MilliQ 水に溶解して 1 M の濃度にし、4 °C で保存する。処理当日、この溶液を 1 M PPA で希釈して、無血清培地 (L-グルタミンを含む DMEM/F-12) で 3 mM および 5 mM PPA にする。すべての実験における処理濃度は、PPAなし（0 mM、対照）、3 mM、および5 mMのPPAとした。実験は少なくとも3回の生物学的反復で実施した。
SH-SY5Y細胞を5.5 × 10⁵細胞/mlの割合で25 cm⁵フラスコに播種し、24時間培養した。PPA処理は、24時間の培養前にフラスコに加えた。通常の哺乳類組織継代培養プロトコル（上記参照）に従って細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを100 µlの2.5%グルタルアルデヒド、1× PBSに再懸濁し、処理するまで4 °Cで保存した。SH-SY5Y細胞を短時間遠心分離して細胞をペレット化し、2.5%グルタルアルデヒド、1× PBS溶液を除去した。沈殿物を蒸留水で調製した4%アガロースゲルに再懸濁した（アガロースと沈殿物の体積比は1:1）。アガロース片を平らなプレート上のグリッドに置き、高圧凍結前に1-ヘキサデセンでコーティングした。サンプルは、-90℃の100%乾燥アセトン中で24時間凍結した。その後、温度を-80℃に上げ、1%四酸化オスミウムと0.1%グルタルアルデヒドの溶液を加えた。サンプルは-80℃で24時間保存した。その後、温度を数日間かけて徐々に室温まで上げた。-80℃から-50℃で24時間、-30℃で24時間、-10℃で24時間、そして最後に室温まで上げた。
極低温処理後、試料に樹脂を含浸させ、ライカ・ライヘルト・ウルトラカットS超ミクロトーム（ライカマイクロシステムズ社製）を用いて超薄切片（約100 nm）を作製した。切片は2%酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。試料は、200 kV（Lab6トランスミッター）で動作するFEI Tecnai 20透過型電子顕微鏡（サーモフィッシャー社（旧FEI社）、オランダ、アイントホーフェン）と、Tridiemエネルギーフィルターを備えたGatan CCDカメラ（Gatan社、英国）を用いて観察した。
各技術的複製において、少なくとも 24 個の単一細胞画像を取得し、合計 266 枚の画像を取得しました。すべての画像は、関心領域 (ROI) マクロとミトコンドリア マクロを使用して解析されました。ミトコンドリア マクロは、公開されている方法 17,31,32 に基づいており、Fiji/ImageJ69 で TEM 画像の半自動バッチ処理を可能にします。簡単に言うと、画像は反転され、ローリング ボール背景減算 (半径 60 ピクセル) と FFT バンドパス フィルタ (それぞれ 60 ピクセルと 8 ピクセルの上限と下限を使用) および 5% の方向許容による垂直線抑制を使用して反転されます。処理された画像は、最大エントロピー アルゴリズムを使用して自動的に閾値処理され、バイナリ マスクが生成されます。生の TEM 画像で手動で選択された ROI に関連付けられた画像領域が抽出され、ミトコンドリアが特徴付けられ、形質膜やその他の高コントラスト領域が除外されます。抽出された各 ROI について、600 ピクセルより大きいバイナリ粒子が分析され、Fiji/ImageJ の組み込み測定機能を使用して、粒子の面積、周囲長、長軸と短軸、フェレット径、真円度、および円形度が測定されました。Merrill、Flippo、および Strack (2017) に従って、これらのデータから面積 2、粒子のアスペクト比 (長軸と短軸の比)、および形状係数 (FF) が計算されました。ここで、FF = 周囲長 2/4π x 面積です。パラメトリック式の定義は、Merrill、Flippo、および Strack (2017) に記載されています。言及されているマクロは GitHub で入手できます (データ利用可能性に関する声明を参照)。平均して、PPA 処理ごとに約 5,600 個の粒子が分析され、合計で約 17,000 個の粒子が分析されました (データは示されていません)。
SH-SH5Y細胞を8チャンバー培養皿（ThermoFisher、#155411）に入れ、一晩接着させた後、TMRE 1:1000（ThermoFisher、#T669）とHoechst 33342 1:200（Sigma-Aldrich、H6024）で染色した。画像は405 nmと561 nmのレーザーを使用して10分間の環境で取得し、生画像は12の連続した時点で画像フレーム間のazステップが0.2 μmの10枚の画像マイクログラフを含むzスタックとして取得した。画像は、LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27レンズを使用してCarl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1超解像プラットフォーム（Carl Zeiss、Oberkochen、ドイツ）で収集した。画像は、以前に説明したパイプラインとImageJプラグインを使用してImageJで解析され、融合および分裂イベント、ミトコンドリア構造の平均数、および細胞あたりの平均ミトコンドリア体積が測定されました33。MELマクロはGitHubで入手可能です（データ可用性に関する声明を参照）。
SH-SY5Y細胞は、処理前に6ウェルプレートで0.3 × 10⁶細胞/mLの密度で24時間培養した。RNAは、Quick-RNA™ Miniprepプロトコル（ZR R1055、Zymo Research）を若干変更して抽出した。各ウェルに300 μlのRNA溶解バッファーを加えてから取り出し、最終ステップとして30 μlのDNase/RNase溶出液で各サンプルを溶解した。すべてのサンプルは、NanoDrop ND-1000 UV-Vis分光光度計を使用して量と品質を確認した。細胞溶解液からの総タンパク質は、200 μlのRIPA溶解バッファーを使用して得られ、タンパク質濃度はBradfordタンパク質アッセイ70を使用して定量した。
cDNA合成は、Tetro™ cDNA合成キット（BIO-65043、Meridian Bioscience）を用いて、製造元の指示に従って一部変更を加えて実施した。cDNAは、総RNA 0.7～1 μgを用いて20 μlの反応で合成した。プライマーは、既報の論文42、71、72、73、74、75、76、77、78（表S1）から選択し、付属のプローブはIntegrated DNA TechnologiesのPrimerQuestツールを使用して設計した。すべての対象遺伝子は、核B2M遺伝子で正規化した。STOML2、NRF1、NFE2L2、TFAM、cMYC、OPA1の遺伝子発現はRT-qPCRで測定した。マスターミックスには、LUNA Taqポリメラーゼ（M3003L、New England Biolabs）、10 μMのフォワードプライマーとリバースプライマー、cDNA、およびPCRグレードの水が含まれており、各反応の最終容量は10 μLです。分裂および分裂遺伝子（DRP1、MFN1/2）の発現は、TaqManマルチプレックスアッセイを使用して測定しました。Luna Universal Probe qPCR Master Mix（M3004S、New England Biolabs）は、製造元の指示に従って、若干の変更を加えて使用しました。マルチプレックスRT-qPCRマスターミックスには、1X LUNA Taqポリメラーゼ、10 μMのフォワードプライマーとリバースプライマー、10 μMのプローブ、cDNA、およびPCRグレードの水が含まれており、各反応の最終容量は20 μLです。RT-qPCRは、Rotor-Gene Q 6-plex（QIAGEN RG—シリアル番号：R0618110）を使用して実施しました。サイクリング条件は表S1に示されています。すべてのcDNAサンプルは3回増幅され、10倍希釈系列を用いて標準曲線が作成された。データの再現性を確保するため、サイクル閾値標準偏差（Ct）が0.5を超える3回増幅サンプルの外れ値は解析から除外された30,72。相対的な遺伝子発現は2-ΔΔCt法を用いて計算された79。
タンパク質サンプル（60 μg）をLaemmliローディングバッファーと2:1の比率で混合し、12%無色タンパク質ゲル（Bio-Rad #1610184）で電気泳動した。タンパク質はTrans-Blot Turboシステム（#170-4155、Bio-Rad）を使用してPVDF（ポリフッ化ビニリデン）メンブレン（#170-84156、Bio-Rad）に転写した。メンブレンをブロッキングし、適切な一次抗体（OPA1、MFN1、MFN2、およびDRP1）（1:1000希釈）と48時間インキュベートした後、二次抗体（1:10,000）と1時間インキュベートした。その後、Clarity Western ECL Substrate（#170-5061、Bio-Rad）を使用してメンブレンを画像化し、Bio-Rad ChemiDoc MPシステムを使用して記録した。ウェスタンブロット解析にはImageLabバージョン6.1を使用しました。元のゲルとブロットは図S1に示されています。抗体情報は表S2に記載されています。
データセットは、少なくとも 3 つの独立したサンプルの平均値と平均値の標準誤差 (SEM) として示されています。データセットは、正規分布と等しい標準偏差を仮定して分析に進む前に、シャピロ・ウィルク検定を使用して正規性の検定を行いました (特に明記されていない限り)。さらに、フィッシャーの MEL LSD (p < 0.05)、一元配置分散分析 (処理群と対照群の平均)、およびダネットの多重比較検定を使用してデータセットを分析し、有意性 (p < 0.05) を判定しました。有意な p 値は、グラフに *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001 として示されています。すべての統計分析とグラフは、GraphPad Prism 9.4.0 を使用して実行および生成されました。
TEM画像解析用のFiji/ImageJマクロはGitHubで公開されています：https://github.com/caaja/TEMMitoMacro。ミトコンドリアイベントロケーター（MEL）マクロもGitHubで公開されています：https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin。
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