Nature.com をご利用いただきありがとうございます。ご利用のブラウザのバージョンでは、CSS のサポートが制限されています。最適な表示のために、ブラウザの最新バージョンをご利用いただくか、Internet Explorer の互換モードを無効にしてください。サポートを継続するため、当面の間、このサイトはスタイルと JavaScript を無効にして表示しています。
プロピオン酸（PPA）は、自閉症スペクトラム症などの神経発達障害におけるミトコンドリア機能不全の役割を研究するために用いられています。PPAはミトコンドリアの生合成、代謝、およびターンオーバーを阻害することが知られています。しかし、ミトコンドリアの動態、分裂、融合に対するPPAの影響は、これらのメカニズムの複雑な時間的性質のために依然として不明瞭です。本研究では、補完的な定量的イメージング技術を用いて、ニューロン様SH-SY5Y細胞におけるミトコンドリアの超微細構造、形態、および動態にPPAがどのように影響するかを調査します。PPA（5 mM）は、ミトコンドリア面積（p < 0.01）、フェレ径および周長（p < 0.05）、および領域2（p < 0.01）の有意な減少を引き起こしました。ミトコンドリアイベントロケーター解析では、分裂および融合イベントの有意な増加（p < 0.05）が示され、ストレス条件下でもミトコンドリアネットワークの完全性が維持されました。さらに、cMYC（p < 0.0001）、NRF1（p < 0.01）、TFAM（p < 0.05）、STOML2（p < 0.0001）、OPA1（p < 0.05）のmRNA発現は有意に減少しました。これは、ストレス条件下で機能を維持するために、ミトコンドリアの形態、生合成、およびダイナミクスがリモデリングされていることを示しています。本データは、PPAがミトコンドリアのダイナミクスに及ぼす影響に関する新たな知見を提供し、ミトコンドリアのストレス応答に関与する複雑な制御機構を研究するためのイメージング技術の有用性を浮き彫りにしています。
ミトコンドリアは、エネルギー産生と生合成という典型的な役割に加え、様々な細胞機能において不可欠な役割を果たしています。ミトコンドリア代謝は、カルシウムシグナル伝達、代謝および酸化還元恒常性、炎症シグナル伝達、エピジェネティック修飾、細胞増殖、分化、そしてプログラム細胞死の重要な調節因子です1。特に、ミトコンドリア代謝は神経細胞の発達、生存、そして機能に極めて重要であり、神経病理の様々な症状に広く関与していることが示唆されています2,3,4。
過去10年間で、代謝状態は神経発生、分化、成熟、可塑性の中心的な制御因子として浮上してきました5,6。近年、ミトコンドリアの形態とダイナミクスは、細胞内に健康なミトコンドリアのプールを維持する動的なプロセスである有糸分裂において特に重要な要素となっています。ミトコンドリアのダイナミクスは、ミトコンドリアの生合成とエネルギー代謝から、ミトコンドリアの分裂、融合、輸送、クリアランスに至るまで、複雑に相互依存する経路によって制御されています7,8。これらの統合メカニズムのいずれかが破綻すると、健康なミトコンドリアネットワークの維持が損なわれ、神経発達に重大な機能的影響を及ぼします9,10。実際、ミトコンドリアのダイナミクスの調節不全は、自閉スペクトラム症（ASD）11,12を含む多くの精神疾患、神経変性疾患、神経発達疾患で観察されています。
ASDは、複雑な遺伝的およびエピジェネティックな構造を持つ、異質な神経発達障害です。ASDの遺伝性は議論の余地がありませんが、その根底にある分子病因は依然として十分に解明されていません。前臨床モデル、臨床研究、マルチオミクス分子データセットから蓄積されたデータは、ASDにおけるミトコンドリア機能不全の証拠を増やしています13,14。私たちは以前、ASD患者コホートでゲノムワイドDNAメチル化スクリーニングを実施し、ミトコンドリア代謝経路に沿ってクラスター化した差次的メチル化遺伝子を特定しました15。その後、ミトコンドリア生合成とダイナミクスの中心的制御因子の差次的メチル化が、ASDにおけるmtDNAコピー数の増加と尿中代謝プロファイルの変化と関連していることを報告しました16。私たちのデータは、ミトコンドリアのダイナミクスと恒常性がASDの病態生理において中心的な役割を果たしていることを示す証拠を増やしています。したがって、ミトコンドリアの動態、形態、機能の関係についての機構的理解を深めることは、二次的なミトコンドリア機能不全を特徴とする神経疾患に関する進行中の研究の重要な目標です。
ミトコンドリアのストレス応答における特定遺伝子の役割を研究するために、分子生物学的手法がしばしば用いられます。しかし、このアプローチは、有糸分裂制御機構の多面性と時間的性質によって限界が生じる可能性があります。さらに、ミトコンドリア遺伝子の差次的発現は、特に限られた数の遺伝子のみが通常解析されるため、機能変化の間接的な指標となります。そのため、ミトコンドリアの機能と生体エネルギーを研究するための、より直接的な方法が提案されています17。ミトコンドリアの形態は、ミトコンドリアのダイナミクスと密接に関連しています。ミトコンドリアの形状、接続性、および構造は、エネルギー産生、ミトコンドリアおよび細胞の生存に不可欠です5,18。さらに、有糸分裂の様々な構成要素は、ミトコンドリアの形態変化に焦点を当てており、これはミトコンドリア機能不全の有用なエンドポイントとして機能し、その後のメカニズム研究の基礎を提供する可能性があります。
ミトコンドリアの形態は透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて直接観察することができ、細胞の超微細構造を詳細に研究することができます。TEMは、遺伝子転写、タンパク質発現、あるいは細胞集団におけるミトコンドリアの機能パラメータのみに頼るのではなく、個々のミトコンドリアの解像度でミトコンドリアクリステの形態、形状、構造を直接可視化します17,19,20。さらに、TEMは、ミトコンドリアの機能と恒常性維持に重要な役割を果たす小胞体やオートファゴソームなどのミトコンドリアと他の細胞小器官との相互作用の研究を容易にします21,22。したがって、特定の経路や遺伝子に焦点を当てる前に、TEMはミトコンドリア機能不全を研究するための良い出発点となります。ミトコンドリアの機能が神経病理学にますます関連してくるにつれて、in vitro 神経細胞モデルでミトコンドリアの形態と動態を直接的かつ定量的に研究できることが明らかに必要になっています。
本稿では、自閉スペクトラム症におけるミトコンドリア機能不全の神経細胞モデルを用いて、ミトコンドリアの動態を解析する。我々は以前、ASD15において、ミトコンドリアプロピオニルCoAカルボキシラーゼ酵素PCCのサブユニットであるプロピオニルCoAカルボキシラーゼβ（PCCB）の特異的メチル化を報告した。PCCの調節不全は、プロピオン酸（PPA）を含むプロピオニル誘導体の毒性蓄積を引き起こすことが知られている23,24,25。PPAは、生体内で神経細胞の代謝を阻害し、行動を変化させることが示されており、ASDに関与する神経発達メカニズムを研究するための確立された動物モデルである26,27,28。さらに、PPAは生体外でミトコンドリア膜電位、生合成、呼吸を阻害することが報告されており、ニューロンにおけるミトコンドリア機能不全のモデルとして広く用いられている29,30。しかし、PPA 誘発性のミトコンドリア機能障害がミトコンドリアの形態と動態に与える影響については、まだ十分に解明されていません。
本研究では、SH-SY5Y細胞におけるミトコンドリアの形態、ダイナミクス、および機能に対するPPAの影響を定量化するために、相補的なイメージング技術を駆使した。まず、ミトコンドリアの形態と超微細構造の変化を可視化するための透過型電子顕微鏡（TEM）法を開発した17,31,32。ミトコンドリアの動的性質33を考慮し、ミトコンドリアイベントローカライザー（MEL）解析を用いて、PPAストレス下における分裂と融合のバランス、ミトコンドリアの数と体積の変化を定量化した。最後に、ミトコンドリアの形態とダイナミクスが、生合成、分裂、および融合に関与する遺伝子の発現変化と関連しているかどうかを検証した。これらのデータを総合すると、ミトコンドリアのダイナミクスを制御するメカニズムの複雑さを解明することの難しさが明らかになる。 SH-SY5Y細胞におけるミトコンドリア形態を、測定可能な収束エンドポイントとして研究する上での透過型電子顕微鏡（TEM）の有用性を強調する。さらに、代謝ストレスに応答する動的なイベントも捉えるイメージング技術と組み合わせることで、透過型電子顕微鏡（TEM）データから最も豊富な情報が得られることを強調する。神経細胞の有糸分裂を支える分子制御機構のさらなる解明は、神経系および神経変性疾患におけるミトコンドリア構成要素に関する重要な知見をもたらす可能性がある。
ミトコンドリアストレスを誘発するため、SH-SY5Y細胞を3 mMおよび5 mMのプロピオン酸ナトリウム（NaP）を含むPPAで処理しました。TEMの前に、サンプルは高圧凍結および凍結による極低温サンプル調製にかけられました（図1a）。3つの生物学的反復にわたってミトコンドリア集団の8つの形態学的パラメータを測定するための自動化されたミトコンドリア画像解析パイプラインを開発しました。PPA処理により、面積2、面積、周囲、およびフェレ径の4つのパラメータが有意に変化することが分かりました（図1b～e）。面積2は、3 mMおよび5 mMのPPA処理の両方で有意に減少しました（それぞれp = 0.0183およびp = 0.002）（図1b）が、面積（p = 0.003）、周囲（p = 0.0106）、およびフェレ径はすべて有意に減少しました。 5 mM 処理群では、対照群と比較して有意な減少 (p = 0.0172) が認められました (図 1c–e)。面積と円周の有意な減少は、5 mM PPA で処理した細胞のミトコンドリアが小さく丸みを帯びており、これらのミトコンドリアが対照細胞よりも伸長していないことを示した。これはまた、粒子端間の最大距離の減少を示す独立したパラメータであるフェレ径の有意な減少とも一致する。クリステの超微細構造の変化が観察され、クリステは PPA ストレスの影響下では顕著ではなくなった (図 1a、パネル B)。ただし、すべての画像がクリステの超微細構造を明確に反映しているわけではないため、これらの変化の定量分析は実施しなかった。これらの TEM データは、次の 3 つのシナリオを反映している可能性がある。(1) PPA は核分裂を促進するか融合を阻害し、既存のミトコンドリアのサイズを縮小させる。 (2) 生合成の促進により、より小型の新しいミトコンドリアが生成される、または (3) 両方のメカニズムが同時に誘導される。これらの状態は透過型電子顕微鏡（TEM）では区別できないものの、顕著な形態変化は、PPAストレス下におけるミトコンドリアの恒常性とダイナミクスの変化を示唆している。その後、これらのダイナミクスとその背後にある潜在的なメカニズムをさらに詳細に特徴付けるために、追加のパラメータを探索した。
プロピオン酸（PPA）はミトコンドリアの形態を変化させます。（a）代表的な透過型電子顕微鏡（TEM）画像。PPA処理量の増加に伴い、ミトコンドリアのサイズが減少し、ミトコンドリアはより小さく丸みを帯びることがわかります。それぞれ、0 mM（未処理）、3 mM、5 mMです。赤い矢印はミトコンドリアを示します。（b～e）PPAで24時間処理したSH-SY5Y細胞をTEM用に調製し、結果をFiji/ImageJを使用して分析しました。8つのパラメーターのうち4つで、コントロール（未処理、0 mM PPA）細胞と処理済み（3 mMおよび5 mM PPA）細胞の間で有意差が見られました。（b）領域2、（c）面積、（d）周囲、（e）フェレ径。一元配置分散分析（コントロール vs. 処理）およびダネットの多重比較検定を使用して有意差を判定しました（p < 0.05）。データポイントは各細胞におけるミトコンドリア値の平均を表し、エラーバーは平均値±標準誤差（SEM）を表します。データはn = 3、反復あたり少なくとも24個の細胞を対象とし、合計266枚の画像を解析しました。*はp < 0.05、**はp < 0.01を示します。
ミトコンドリアのダイナミクスがPPAにどのように反応するかをさらに詳細に解析するため、ミトコンドリアをテトラメチルローダミンエチルエステル（TMRE）で染色し、タイムラプス顕微鏡とMEL解析を用いて、3 mMおよび5 mM PPAで24時間処理後のミトコンドリアの位置を特定し、定量化した。分裂および融合イベントの処理。（図2a）。MEL解析後、ミトコンドリアをさらに分析し、ミトコンドリア構造の数と平均体積を定量化した。 3 mM では分裂イベント数 [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] が分裂 [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] および融合 [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] と比較してわずかながら有意な増加が見られました (図 3b)。ミトコンドリアの数は 3 mM [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] と 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] の両方で有意に増加しましたが (図 3c)、各ミトコンドリア構造の平均容積は変化しませんでした (図 3c)。これらを総合すると、ミトコンドリアダイナミクスのリモデリングは、ミトコンドリアネットワークの完全性を維持するための代償反応として機能していることが示唆されます。3 mM PPAにおける分裂イベント数の増加は、ミトコンドリア数の増加が部分的にミトコンドリア分裂によるものであることを示唆していますが、ミトコンドリアの平均容積は実質的に変化しないことを考えると、生合成が追加の代償反応として作用する可能性も排除できません。しかしながら、これらのデータは、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察されたミトコンドリアのより小さく丸い構造と一致しており、PPAによって誘発されるミトコンドリアダイナミクスの顕著な変化も示しています。
プロピオン酸（PPA）は、ミトコンドリアの動的なリモデリングを引き起こし、ネットワークの完全性を維持します。SH-SY5Y細胞を培養し、3 mMおよび5 mMのPPAで24時間処理した後、TMREおよびHoechst 33342で染色し、MEL分析を行いました。（a）各条件における時間2（t2）での色と2値化最大強度投影を示す代表的なタイムラプス顕微鏡画像。各2値画像で示された選択領域は、経時的なダイナミクスを示すために、3つの異なる時間枠（t1～t3）で強調表示され、3Dで表示されます。融合イベントは緑色で強調表示され、分裂イベントは緑色で強調表示されます。赤色で表示されます。（b）条件ごとの動的イベントの平均数。（c）細胞あたりのミトコンドリア構造の平均数。（d）細胞あたりの各ミトコンドリア構造の平均体積（µm3）。示されたデータは、処理群あたりn = 15細胞の代表値です。示されているエラーバーは平均±SEMを表し、スケールバー = 10 μm、* p < 0.05。
プロピオン酸（PPA）は、ミトコンドリアのダイナミクスに関連する遺伝子の転写抑制を引き起こす。SH-SY5Y細胞を3 mMおよび5 mMのPPAで24時間処理した。RT-qPCRを用いて相対的な遺伝子定量を行い、B2Mで正規化した。ミトコンドリア生合成遺伝子（a）cMYC、（b）TFAM、（c）NRF1、（d）NFE2L2。ミトコンドリア融合・分裂遺伝子（e）STOML2、（f）OPA1、（g）MFN1、（h）MFN2、（i）DRP1。有意差（p < 0.05）は、一元配置分散分析（対照群 vs. 処理群）およびダネットの多重比較検定を用いて検定した。*はp < 0.05、**はp < 0.01、****はp < 0.0001を示す。バーは平均発現±SEMを表す。示されたデータは、n = 3（STOML2、OPA1、TFAM）、n = 4（cMYC、NRF1、NFE2L2）、およびn = 5（MFN1、MFN2、DRP1）の生物学的反復を表す。
TEMおよびMEL解析のデータは、PPAがミトコンドリアの形態と動態を変化させることを示唆している。しかしながら、これらの画像化技術では、これらのプロセスを引き起こす根本的なメカニズムについての知見は得られない。そこで我々は、PPA処理に対するミトコンドリアの動態、生合成、および有糸分裂を制御する9つの主要な因子のmRNA発現を調べた。3 mMおよび5 mM PPA処理後24時間で、細胞性骨髄腫癌遺伝子（cMYC）、核呼吸因子（NRF1）、ミトコンドリア転写因子1（TFAM）、NFE2様転写因子BZIP（NFE2L2）、ガストリン様タンパク質2（STOML2）、視神経萎縮因子1（OPA1）、マイトフューシン1（MFN1）、マイトフューシン2（MFN2）、およびダイナミン関連タンパク質1（DRP1）を定量した。 3 mM（それぞれp = 0.0053、p = 0.0415、p < 0.0001）および5 mM（それぞれp = 0.0031、p = 0.0233、p < 0.0001）のPPA処理を観察しました（図3a–c）。mRNA発現の減少は用量依存的であり、cMYC、NRF1、TFAMの発現は3 mMでそれぞれ5.7、2.6、1.9倍減少し、5 mMではそれぞれ11.2、3、2.2倍減少しました。対照的に、中枢酸化還元生合成遺伝子NFE2L2はPPAのいずれの濃度でも変化しませんでしたが、同様の用量依存的な発現減少傾向が観察されました（図3d）。
分裂と融合の制御に関わる古典的遺伝子の発現も調べた。STOML2は融合、マイトファジー、生合成に関与すると考えられており、その発現は3 mM（2.4倍の変化）および5 mM（2.8倍の変化）のPPAによって有意に減少した（p < 0.0001）（図1）。3d）。同様に、OPA1融合遺伝子の発現は3 mM（1.6倍の変化）および5 mM（1.9倍の変化）のPPAで減少した（それぞれp = 0.006およびp = 0.0024）（図3f）。しかし、24時間のPPAストレス下では、融合遺伝子MFN1、MFN2、または分裂遺伝子DRP1の発現に有意差は見られなかった（図3g–i）。さらに、4つの融合タンパク質および分裂タンパク質（OPA1、MFN1、MFN2、DRP1）のレベルは、同一条件下で変化しなかったことを明らかにしました（図4a～d）。これらのデータは特定の時点を反映したものであり、PPAストレスの初期段階におけるタンパク質発現や活性レベルの変化を反映していない可能性があることに留意することが重要です。しかしながら、cMYC、NRF1、TFAM、STOML2、およびOPA1の発現の有意な減少は、ミトコンドリアの代謝、生合成、およびダイナミクスにおける転写調節異常を示唆しています。さらに、これらのデータは、ミトコンドリア機能の最終状態の変化を直接研究するためのイメージング技術の有用性を浮き彫りにしています。
プロピオン酸（PPA）処理後、融合因子および分裂因子タンパク質レベルは変化しなかった。SH-SY5Y細胞を3 mMおよび5 mM PPAで24時間処理した。タンパク質レベルはウェスタンブロット解析により定量化し、発現レベルは総タンパク質に対して正規化した。標的タンパク質および総タンパク質の平均タンパク質発現量と代表的なウェスタンブロットを示す。a – OPA1、b – MFN1、c – MFN2、d – DRP1。バーは平均±SEMを表し、示されたデータはn = 3の生物学的反復の代表値である。一元配置分散分析およびダネット検定を用いて多重比較（p < 0.05）を行った。元のゲルとブロットを図S1に示す。
ミトコンドリア機能不全は、代謝、心血管、筋肉の疾患から神経疾患に至るまで、多臓器疾患と関連しています1,10。多くの神経変性疾患および神経変性疾患はミトコンドリア機能不全と関連しており、脳の生涯を通じてこれらの器官が重要であることが強調されています。これらの疾患には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ASD3,4,18が含まれます。しかし、これらの疾患を研究するために脳組織にアクセスすることは、特にメカニズムレベルでは困難であり、細胞モデルシステムが必要な代替手段となっています。本研究では、PPA処理したSH-SY5Y細胞を用いた細胞モデルシステムを用いて、神経疾患、特に自閉スペクトラム症で観察されるミトコンドリア機能不全を再現します。このPPAモデルを用いてニューロンにおけるミトコンドリアの動態を研究することで、ASDの病因への洞察が得られる可能性があります。
ミトコンドリアの形態変化を観察するためにTEMを用いる可能性を検討した。TEMの有効性を最大限に引き出すには、正しく使用する必要があることに留意する必要がある。凍結標本を作製することで、細胞成分を固定すると同時にアーティファクトの形成を低減することで、神経構造をより良好に保存することができる34。これに一致して、ニューロン様SH-SY5Y細胞は、細胞内小器官が損なわれておらず、ミトコンドリアが伸長していることが観察された（図1a）。これは、神経細胞モデルにおけるミトコンドリアの形態研究において、凍結標本作製技術の有用性を強調している。TEMデータの客観的な分析には定量的な測定が不可欠であるが、ミトコンドリアの形態変化を確認するために測定すべき具体的なパラメータについては、未だコンセンサスが得られていない。ミトコンドリアの形態を定量的に調べた多数の研究17,31,32 に基づいて、面積、面積2、アスペクト比、周囲長、円形度、度、フェレ径、および真円度の 8 つの形態パラメータを測定する自動化されたミトコンドリア画像分析パイプラインを開発しました。
その中で、PPA は面積 2、面積、周囲長、およびフェレ径を有意に減少させました (図 1b–e)。これは、ミトコンドリアが小さくなり、より丸くなったことを示しており、PPA30 誘発性ミトコンドリアストレスの 72 時間後にミトコンドリア面積が減少することを示す以前の研究と一致しています。これらの形態学的特徴は、ミトコンドリア分裂を示唆している可能性があります。これは、ミトコンドリアネットワークから損傷した成分を隔離し、マイトファジーによる分解を促進するために必要なプロセスです35,36,37。一方、平均的なミトコンドリアの大きさの減少は、小さな新生ミトコンドリアの形成をもたらす生合成の増加と関連している可能性があります。分裂または生合成の増加は、ミトコンドリアストレスに対して有糸分裂を維持するための代償反応を表しています。ただし、ミトコンドリアの成長の低下、融合の障害、またはその他の状態を除外することはできません。
TEM で作成された高解像度の画像により、個々のミトコンドリアのレベルで形態学的特徴を判定できますが、この方法では単一時点の 2 次元スナップショットが生成さ れます。代謝ストレスに対する動的応答を調べるために、TMRE でミトコンドリアを染色し、MEL 分析を備えたタイムラプス顕微鏡を使用しました。これにより、時間の経過に伴うミトコンドリアネットワークの変化をハイスループットで 3D で視覚化できます33,38。PPA ストレス下では、ミトコンドリアのダイナミクスにわずかながらも重要な変化が観察されました (図 2)。3 mM では、分裂イベントの数が大幅に増加しましたが、融合イベントはコントロールと同じままでした。5 mM PPA では分裂イベントと融合イベントの両方の数の増加が観察されましたが、これらの変化はほぼ比例しており、分裂と融合の速度論が高濃度で平衡に達することを示唆しています (図 2b)。ミトコンドリアの平均容積は3 mM PPAと5 mM PPAのいずれにおいても変化がなく、ミトコンドリアネットワークの完全性が維持されていることを示しています（図2d）。これは、動的なミトコンドリアネットワークが軽度の代謝ストレスに反応し、ネットワークの断片化を引き起こすことなく効果的に恒常性を維持する能力を反映しています。3 mM PPAでは、分裂の増加は新たな平衡状態への移行を促進するのに十分ですが、高濃度PPAによって誘発されるストレスへの応答には、より深刻な運動学的リモデリングが必要です。
ミトコンドリア数は両PPAストレス濃度で増加したが、平均ミトコンドリア容積には有意な変化が見られなかった（図2c）。これは、ミトコンドリア新生の増加または分裂の増加によるものと考えられるが、平均ミトコンドリア容積の有意な減少が見られなかったことから、生合成が増加した可能性が高い。しかしながら、図2のデータは、ミトコンドリア分裂の上方制御と一致する分裂イベント数の増加、およびミトコンドリア新生と一致するイベント数の増加という、2つの代償メカニズムの存在を裏付けている。最終的に、軽度ストレスに対する動的代償は、分裂、融合、新生、およびマイトファジーを含む同時進行のプロセスで構成されている可能性がある。これまでの著者らは、PPAが有糸分裂30,39およびマイトファジー29を促進することを示しているが、本研究では、PPAに応答したミトコンドリアの分裂および融合ダイナミクスのリモデリングの証拠を示している。これらのデータは、TEM によって観察された形態学的変化を裏付けるものであり、PPA 誘発性のミトコンドリア機能障害に関連するメカニズムについてのさらなる洞察を提供します。
TEM 解析および MEL 解析では、観察された形態変化の根底にある遺伝子制御機構の直接的な証拠が得られなかったため、ミトコンドリアの代謝、生合成、および動態に関与する遺伝子の RNA 発現を調べた。cMYC がん原遺伝子は、ミトコンドリア、解糖、アミノ酸および脂肪酸代謝の制御に関与する転写因子である40。さらに、cMYC は、NRF1 および TFAM41 など、ミトコンドリアの転写、翻訳、および複合体の組み立てに関与する約 600 個のミトコンドリア遺伝子の発現を制御することが知られている。NRF1 および TFAM は、有糸分裂の中心的な制御因子であり、PGC-1α の下流で作用して mtDNA 複製を活性化する。この経路は、cAMP および AMPK シグナル伝達によって活性化され、エネルギー消費および代謝ストレスに敏感である。また、ミトコンドリア生合成の酸化還元調節因子である NFE2L2 を調べ、PPA の効果が酸化ストレスによって媒介されるかどうかを調べました。
NFE2L2の発現は変化しなかったものの、3 mMおよび5 mM PPA処理24時間後、cMYC、NRF1、TFAMの発現は用量依存的に一貫して減少した（図3a–c）。cMYC発現のダウンレギュレーションは、ミトコンドリアストレスへの応答として以前に報告されており42、逆に、cMYC発現のダウンレギュレーションは、ミトコンドリア代謝、ネットワーク接続性、膜分極をリモデリングすることでミトコンドリア機能不全を引き起こす可能性がある43。興味深いことに、cMYCはミトコンドリアの分裂と融合の制御にも関与しており42,43、細胞分裂中のDRP1リン酸化とミトコンドリア局在を増加させる44ことや、神経幹細胞におけるミトコンドリアの形態リモデリングを媒介することが知られている45。実際、cMYC欠損線維芽細胞はミトコンドリアの大きさが縮小しており、これはPPA43ストレスによって誘発される変化と一致しています。これらのデータは、cMYCとミトコンドリアの動態との間に興味深いがまだ解明されていない関係性を示しており、PPAストレス誘発性リモデリングの今後の研究にとって興味深いターゲットとなります。
NRF1 および TFAM の減少は、cMYC が重要な転写活性化因子としての役割と一致している。これらのデータは、PPA が 22 時間で NRF1 mRNA の発現を減少させ、それが ATP 枯渇および ROS46 の増加と関連していることを示した、ヒト大腸がん細胞の以前の研究とも一致している。これらの著者らはまた、TFAM の発現は 8.5 時間で増加したが、22 時間でベースラインのレベルに戻ったと報告している。対照的に、Kim ら (2019) は、SH-SY5Y 細胞で PPA ストレスの 4 時間後に TFAM mRNA の発現が大幅に減少したことを示したが、72 時間後には TFAM タンパク質の発現が大幅に増加し、mtDNA のコピー数が大幅に増加した。したがって、24 時間後に観察されたミトコンドリア生合成遺伝子の数の減少は、ミトコンドリアの数の増加がそれより早い時点での生合成の活性化と関連している可能性を排除するものではない。これまでの研究で、PPAはSH-SY5Y細胞において4時間30分でPGC-1α mRNAおよびタンパク質を有意にアップレギュレーションし、プロピオン酸は12時間39分でPGC-1αを介して子牛肝細胞のミトコンドリア生合成を促進することが示されています。興味深いことに、PGC-1αはNRF1およびTFAMの直接的な転写調節因子であるだけでなく、分裂と融合を制御することでMFN2およびDRP1の活性を制御することも示されています47。これらを総合すると、PPAによって誘導されるミトコンドリアの代償反応を制御するメカニズムが密接に連携していることが示唆されます。さらに、本データは、PPAストレス下における生合成および代謝の転写調節の顕著な制御不全を反映しています。
STOML2、OPA1、MFN1、MFN2、DRP1遺伝子は、ミトコンドリアの分裂、融合、ダイナミクスを制御する中心的な因子です37,48,49。ミトコンドリアのダイナミクスに関与する遺伝子は他にも多数ありますが、STOML2、OPA1、MFN2はASDコホートにおいてメチル化の程度が異なることが既に明らかになっており16、複数の独立した研究で、ミトコンドリアストレスに対するこれらの転写因子の変化が報告されています50,51。52。OPA1とSTOML2の発現は、3 mMおよび5 mM PPA処理によって有意に減少しました（図3e、f）。OPA1は、MFN1および2と直接相互作用することでミトコンドリア融合を制御する古典的な因子の一つであり、クリステのリモデリングとミトコンドリアの形態形成に役割を果たしています53。 STOML2 がミトコンドリアのダイナミクスにおいて果たす正確な役割は不明ですが、ミトコンドリアの融合、生合成、ミトファジーにおいて役割を果たしていることを示唆する証拠があります。
STOML2は、ミトコンドリア呼吸共役の維持と呼吸鎖複合体の形成に関与しており54,55、癌細胞の代謝特性を大きく変化させることが示されています56。研究により、STOML2はBANおよびカルジオリピンとの相互作用を介してミトコンドリア膜電位および生合成を促進することが示されています55, 57, 58。さらに、独立した研究により、STOML2とPINK1の相互作用がミトファジーを制御することが示されています59,60。特に、STOML2はMFN2と直接相互作用して安定化することが報告されており、OPA1分解に関与するプロテアーゼを阻害することで長いOPA1アイソフォームの安定化にも重要な役割を果たしています53,61,62。PPA反応で観察されるSTOML2発現の低下は、これらの融合タンパク質がユビキチンおよびプロテアソーム依存性経路を介して分解を受けやすくなる可能性がある48。 PPA に対する動的応答における STOML2 と OPA1 の正確な役割は不明ですが、これらの融合遺伝子の発現の低下 (図 3) により、分裂と融合のバランスが崩れ、ミトコンドリアのサイズが減少する可能性があります (図 3)。1)。
一方、OPA1タンパク質発現は24時間後も変化しなかったが、MFN1、MFN2、DRP1のmRNAおよびタンパク質レベルはPPA処理後に有意に変化しなかった（図3g-i、図4）。これは、ミトコンドリアの融合と分裂に関与するこれらの因子の調節に変化がないことを示唆しているのかもしれない。しかし、これら4つの遺伝子のそれぞれが、タンパク質活性を制御する転写後修飾（PTM）によっても調節されていることは注目に値します。OPA1には、ミトコンドリア内でタンパク質分解的に切断されて2つの異なるアイソフォームを生成する8つの選択的スプライスバリアントがあります63。長いアイソフォームと短いアイソフォームのバランスが、最終的にミトコンドリアの融合とミトコンドリアネットワークの維持におけるOPA1の役割を決定します64。 DRP1 の活性はカルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) のリン酸化によって制御され、DRP1 の分解はユビキチン化と SUMO 化によって制御されます65。最後に、DRP1 と MFN1/2 はどちらも GTPase であるため、ミトコンドリアでの GTP 産生速度によって活性が影響を受ける可能性があります66。そのため、これらのタンパク質の発現が一定であっても、これはタンパク質の活性や局在が変化していないことを反映しているとは限りません67,68。実際、既存の PTM タンパク質レパートリーは、急性ストレス応答の媒介を担う第一線の防御として機能することがよくあります。私たちのモデルでは、中程度の代謝ストレスが存在するため、PTM によって融合タンパク質と分裂タンパク質の活性が高まり、mRNA またはタンパク質レベルでこれらの遺伝子をさらに活性化することなく、ミトコンドリアの完全性を十分に回復できる可能性があります。
上記のデータを総合すると、ミトコンドリア形態の複雑かつ時間依存的な制御と、そのメカニズムを解明する上での課題が浮き彫りになります。遺伝子発現を研究するには、まず経路内の特定の標的遺伝子を特定する必要があります。しかし、我々のデータは、同じ経路内の遺伝子が同じストレスに対して同じように反応するわけではないことを示しています。実際、過去の研究では、同じ経路内の異なる遺伝子が異なる時間的応答プロファイルを示す可能性があることが示されています30,46。さらに、転写と遺伝子機能の関係を破壊する複雑な転写後メカニズムが存在します。プロテオーム研究は、PTMとタンパク質機能の影響に関する知見を提供しますが、低スループット法、高いS/N比、解像度の低さなどの課題も抱えています。
このような状況において、TEM と MEL を用いたミトコンドリアの形態研究は、ミトコンドリアのダイナミクスと機能の関係や、それが疾患に及ぼす影響に関する根本的な疑問を解決する大きな可能性を秘めています。最も重要なのは、TEM が、ミトコンドリアの機能不全とダイナミクスの収束エンドポイントとしてミトコンドリアの形態を直接測定する方法を提供することです51。MEL はまた、三次元細胞環境における分裂と融合イベントを直接可視化する方法も提供し、遺伝子発現の変化がない場合でも動的なミトコンドリアリモデリングを定量化できます33。ここでは、二次性ミトコンドリア疾患におけるミトコンドリアイメージング技術の有用性について取り上げます。これらの疾患は通常、急性のミトコンドリア損傷ではなく、ミトコンドリアネットワークの微妙なリモデリングを特徴とする慢性の軽度代謝ストレスを特徴とします。しかし、慢性ストレス下で有糸分裂を維持するために必要なミトコンドリアの代償は、重大な機能的結果をもたらします。神経科学の観点では、これらの補償メカニズムをより深く理解することで、ミトコンドリア機能不全に関連する多面的神経病理学に関する重要な情報が得られる可能性があります。
最終的に、我々のデータは、神経細胞ミトコンドリアの動態を制御する遺伝子発現、タンパク質修飾、およびタンパク質活性間の複雑な相互作用の機能的帰結を理解するためのイメージング技術の有用性を浮き彫りにしています。我々は、ASDのミトコンドリア構成要素への洞察を得るため、PPAを用いて神経細胞モデルにおけるミトコンドリア機能不全をモデル化しました。PPAを投与したSH-SY5Y細胞は、ミトコンドリアの形態変化を示しました。ミトコンドリアは小型で丸くなり、TEM観察ではクリステの輪郭が不明瞭でした。MEL解析により、これらの変化は、軽度の代謝ストレスに反応してミトコンドリアネットワークを維持するための分裂および融合イベントの増加と同時に起こることが示されました。さらに、PPAはミトコンドリア代謝および恒常性の転写調節を著しく阻害します。我々は、PPAストレスによって破壊される主要なミトコンドリア制御因子としてcMYC、NRF1、TFAM、STOML2、およびOPA1を同定し、これらの因子がPPA誘導性のミトコンドリア形態および機能変化を媒介する役割を果たしている可能性を示唆した。PPA誘導性の遺伝子発現およびタンパク質活性、局在、および翻訳後修飾における時間的変化をより詳細に解析するには、今後の研究が必要である。本データは、ミトコンドリアストレス応答を媒介する制御機構の複雑性と相互依存性を浮き彫りにし、より標的を絞ったメカニズム研究における透過型電子顕微鏡（TEM）などのイメージング技術の有用性を実証している。
SH-SY5Y細胞株（ECACC、94030304-1VL）はSigma-Aldrichから購入しました。SH-SY5Y細胞は、20%ウシ胎児血清（FBS）（10493106、ThermoFisher Scientific）および1%ペニシリン-ストレプトマイシン（P4333-20ML、Sigma-Aldrich）を添加した25cm2フラスコ内で、ダルベッコ改変イーグル培地/F-12栄養混合物（DMEM/F-12）およびL-グルタミン（SC09411、ScienCell）を用いて、37℃、5% CO2で培養しました。細胞は0.05%トリプシン-EDTA（15400054、ThermoFisher Scientific）を用いて80%コンフルエンスまで継代培養し、300 gで遠心分離後、約7 × 105細胞/mlの密度で播種した。すべての実験は、継代数19～22の未分化SH-SY5Y細胞を用いて実施した。PPAはNaPとして投与する。NaP粉末（CAS番号137-40-6、化学式C3H5NaO2、P5436-100G、Sigma-Aldrich）をMilliQ温水に溶解し、濃度1 Mになるように調製し、4 °Cで保存する。投与当日に、この溶液を1 M PPAで3 mMに希釈し、さらに5 mM PPAを無血清培地（L-グルタミン添加DMEM/F-12）で希釈する。すべての実験における処理濃度は、PPA無添加（0 mM、対照）、3 mM、および5 mM PPAでした。実験は少なくとも3回の生物学的反復実験で実施されました。
SH-SY5Y細胞を25cm5フラスコに5.5×105細胞/mlの割合で播種し、24時間培養した。24時間のインキュベーション前にPPA処理剤をフラスコに加えた。通常の哺乳類組織の継代培養プロトコル（上記）に従って細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを100µlの2.5%グルタルアルデヒド、1×PBSに再懸濁し、処理まで4°Cで保存した。SH-SY5Y細胞を軽く遠心分離して細胞をペレット化し、2.5%グルタルアルデヒド、1×PBS溶液を除去した。沈殿物を蒸留水で調製した4%アガロースゲルに再懸濁した（アガロースと沈殿物の体積比は1:1）。アガロース片を平板上のグリッドに置き、高圧凍結前に1-ヘキサデセンでコーティングした。サンプルは100%乾燥アセトン中で-90℃で24時間凍結した。その後、温度を-80℃に上げ、1%四酸化オスミウムと0.1%グルタルアルデヒドの溶液を加えた。サンプルは-80℃で24時間保存した。その後、数日かけて温度を徐々に室温まで上げた。-80℃から-50℃まで24時間、-30℃まで24時間、-10℃まで24時間、そして最後に室温まで昇温した。
凍結調製後、試料を樹脂で浸漬し、Leica Reichert UltracutSウルトラミクロトーム（Leica Microsystems）を用いて超薄切片（約100 nm）を作製した。切片は2%酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。試料は、200 kV（Lab6トランスミッター）で作動するFEI Tecnai 20透過型電子顕微鏡（ThermoFisher（旧FEI）、アイントホーフェン、オランダ）と、Tridiemエネルギーフィルターを搭載したGatan CCDカメラ（Gatan、英国）を用いて観察した。
各テクニカルレプリケートでは、少なくとも 24 枚の単一細胞画像が取得され、合計 266 枚の画像が作成されました。すべての画像は、関心領域 (ROI) マクロとミトコンドリア マクロを使用して分析されました。ミトコンドリア マクロは公開されている方法 17,31,32 に基づいており、Fiji/ImageJ69 で TEM 画像を半自動でバッチ処理できます。簡単に言うと、画像は、ローリング ボール背景減算 (半径 60 ピクセル)、FFT バンドパス フィルター (上限 60 ピクセル、下限 8 ピクセル)、および方向許容値 5% の垂直線抑制を使用して反転および反転されます。処理された画像は、最大エントロピー アルゴリズムを使用して自動的にしきい値化され、バイナリ マスクが生成されます。生の TEM 画像で手動で選択された ROI に関連付けられた画像領域が抽出され、ミトコンドリアが特徴付けられ、細胞膜とその他の高コントラスト領域が除外されました。抽出された各ROIについて、600ピクセルを超えるバイナリ粒子が分析され、Fiji/ImageJの組み込み測定機能を使用して、粒子の面積、周囲長、長径と短径、フェレ径、真円度、円形度が測定されました。Merrill、Flippo、およびStrack（2017）に従い、面積2、粒子アスペクト比（長軸と短軸の比）、および形状係数（FF）がこれらのデータから計算されました。ここで、FF = 周囲長 2/4π x 面積です。パラメーターの式の定義は、Merrill、Flippo、およびStrack（2017）に記載されています。言及されているマクロはGitHubで入手できます（データ利用可能性に関する声明を参照）。平均して、PPA処理ごとに約5,600個の粒子が分析され、合計で約17,000個の粒子が分析されました（データは示していません）。
SH-SH5Y細胞を8チャンバー培養皿（ThermoFisher、#155411）に置き、一晩接着させた後、TMRE 1:1000（ThermoFisher、#T669）およびHoechst 33342 1:200（Sigma-Aldrich、H6024）と共にインキュベートした。染色。画像は405 nmおよび561 nmレーザーを用いて10分間の環境で取得し、生画像は12の連続した時点における画像フレーム間のazステップが0.2μmの10枚の画像顕微鏡写真を含むzスタックとして取得しました。画像は、LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27レンズを使用して、Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1超解像プラットフォーム（Carl Zeiss、オーバーコッヘン、ドイツ）を使用して収集しました。画像は、前述のパイプラインとImageJプラグインを用いてImageJで解析され、融合および分裂イベント、ミトコンドリア構造の平均数、および細胞あたりの平均ミトコンドリア容積を測定しました33。MELマクロはGitHubで入手可能です（データ利用可能性に関する声明を参照）。
SH-SY5Y細胞は、処理前に6ウェルプレートで0.3 × 106細胞/mLの密度で24時間培養した。RNAは、Quick-RNA™ Miniprepプロトコル（ZR R1055、Zymo Research）を用いて抽出したが、若干の改変を加えた。すなわち、各ウェルにRNA溶解バッファー300μlを添加し、最終ステップとしてDNase/RNase溶出バッファー30μlを用いて各サンプルを溶解した。-フリー水。全サンプルは、NanoDrop ND-1000 UV-Vis分光光度計を用いて量と品質を確認した。細胞溶解物からの総タンパク質は、RIPA溶解バッファー200μlを用いて採取し、タンパク質濃度はBradfordタンパク質アッセイ70を用いて定量した。
cDNA合成は、Tetro™ cDNA合成キット（BIO-65043、Meridian Bioscience社製）を用いて、製造元の指示に従い、一部改変を加えて行った。cDNAは、0.7～1μgのtotal RNAを用いて20μlの反応液で合成した。プライマーは、既発表論文42、71、72、73、74、75、76、77、78（表S1）から選択し、プローブはIntegrated DNA Technologies社のPrimerQuestツールを使用して設計した。対象遺伝子はすべて、核B2M遺伝子を基準として標準化した。STOML2、NRF1、NFE2L2、TFAM、cMYC、およびOPA1の遺伝子発現は、RT-qPCRにより測定した。マスターミックスには、LUNA Taqポリメラーゼ（M3003L、New England Biolabs）、10 μMのフォワードプライマーとリバースプライマー、cDNA、PCRグレードの水が含まれ、各反応の最終容量は10 μLとなった。分裂遺伝子と分裂遺伝子（DRP1、MFN1/2）の発現は、TaqManマルチプレックスアッセイを使用して測定した。Luna Universal Probe qPCRマスターミックス（M3004S、New England Biolabs）は、製造元の指示に従って、若干の変更を加えて使用した。マルチプレックスRT-qPCRマスターミックスには、1X LUNA Taqポリメラーゼ、10 μMのフォワードプライマーとリバースプライマー、10 μMのプローブ、cDNA、PCRグレードの水が含まれ、各反応の最終容量は20 μLとなった。RT-qPCRは、Rotor-Gene Q 6-plex（QIAGEN RG、シリアル番号：R0618110）を使用して実施した。すべてのcDNAサンプルは3回繰り返し増幅し、10倍希釈系列を用いて標準曲線を作成した。データの再現性を確保するため、3回繰り返したサンプルのうち、サイクル閾値標準偏差（Ct）が0.5を超える外れ値は解析から除外した30,72。相対遺伝子発現は2-ΔΔCt法79を用いて算出した。
タンパク質サンプル（60 μg）をLaemmliローディングバッファーと2:1の割合で混合し、12%無色タンパク質ゲル（Bio-Rad #1610184）で泳動しました。タンパク質は、Trans-Blot Turboシステム（#170-4155、Bio-Rad）を用いてPVDF（ポリフッ化ビニリデン）メンブレン（#170-84156、Bio-Rad）に転写しました。メンブレンをブロッキングし、適切な一次抗体（OPA1、MFN1、MFN2、DRP1）（1:1000希釈）で48時間インキュベートした後、二次抗体（1:10,000希釈）で1時間インキュベートしました。その後、Clarity Western ECL Substrate（#170-5061、Bio-Rad）を用いてメンブレンを画像化し、Bio-Rad ChemiDoc MPシステムで記録しました。ウェスタンブロット解析にはImageLabバージョン6.1を使用しました。オリジナルのゲルとブロットを図S1に示します。抗体情報は表S2に示します。
データセットは、少なくとも3つの独立したサンプルの平均値と平均値の標準誤差（SEM）として提示されています。データセットは、ガウス分布と標準偏差が等しいと仮定して分析を進める前に、Shapiro-Wilks検定を用いて正規性検定を行いました（特に記載がない限り）。さらに、データセットはFisherのMEL LSD（p < 0.05）、一元配置分散分析（治療群 vs. 対照群の平均）、およびDunnettの多重比較検定を用いて有意差（p < 0.05）を判定しました。有意なp値は、グラフ上で*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001として表示されます。すべての統計分析とグラフは、GraphPad Prism 9.4.0を使用して実行および生成されました。
TEM画像解析用のFiji/ImageJマクロはGitHubで公開されています：https://github.com/caaja/TEMMitoMacro。ミトコンドリアイベントロケーター（MEL）マクロはGitHubで公開されています：https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin。
Meiliana A.、Devi NM、Vijaya A. ミトコンドリア：代謝、恒常性、ストレス、老化、エピジェネティクスのマスターレギュレーター. インドネシア語. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. 統合失調症における多面的なミトコンドリア機能不全、複合体Iは病理学的標的となる可能性あり。統合失調症リソース。187, 3–10 (2017)。
Bose, A.およびBeal, MF「パーキンソン病におけるミトコンドリア機能障害」J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK、Singh TG、Mehta V. ストレスを受けたミトコンドリア：アルツハイマー病における侵入の標的. ミトコンドリア59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF, Ferreira GK ミトコンドリアと脳：生体エネルギーなど。神経毒。リソース。36, 219–238 (2019)。
Rangaraju, V. 他「多面的ミトコンドリア：ミトコンドリアの神経発達と疾患への影響」J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. および Morais, VA ニューロンにおけるミトコンドリアの生合成：その仕組みと場所。国際性。J. Mohr. 科学。22, 13059 (2021)。
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. および Zhao, J. 哺乳類ミトコンドリアダイナミクスの制御：機会と課題。front. endocrine. (ローザンヌ) 11, 374 (2020).
Khacho, M. および Slack, RS「神経新生の制御におけるミトコンドリアのダイナミクス：発達中の脳から成人の脳まで」。発達ダイナミック。247、47–53 (2018)。
投稿日時: 2024年4月1日