Nature.comにご訪問いただきありがとうございます。お使いのブラウザのバージョンはCSSのサポートが制限されています。最適な閲覧体験のために、最新のブラウザをご利用いただくか、Internet Explorerの互換表示モードをオフにすることをお勧めします。当面の間、継続的なサポートを確保するため、スタイルシートとJavaScriptを使用せずにサイトを表示いたします。
高濃度インスリン含有ナノ粒子（NP）は、様々な剤形で多様な用途が見出されている。本研究では、凍結乾燥および噴霧乾燥プロセスが、凍結保護剤としてマンニトールを使用した場合と使用しない場合における、インスリン含有キトサンナノ粒子の構造に及ぼす影響を評価することを目的とする。また、これらのナノ粒子を再溶解することで品質を評価した。脱水前、キトサン/トリポリリン酸ナトリウム/インスリン架橋ナノ粒子の粒子サイズは318 nmに最適化され、PDIは0.18、封入効率は99.4%、含有率は25.01%であった。再溶解後、マンニトールを使用しない凍結乾燥法で製造されたものを除き、すべてのナノ粒子は球状粒子構造を維持した。噴霧乾燥法で脱水したマンニトール含有ナノ粒子と比較して、マンニトールフリー噴霧乾燥ナノ粒子は平均粒子径が最も小さかった。乾燥または凍結乾燥技術により、サイズ（376 nm）と最高負荷量（25.02%）が、同様のカプセル化率（98.7%）とPDI（0.20）で得られました。マンニトールを使用せずに噴霧乾燥によって乾燥させたナノ粒子は、インスリンの放出速度が最も速く、細胞への取り込み効率も最も高くなりました。この研究は、噴霧乾燥が従来の凍結乾燥法と比較して凍結保護剤を必要とせずにインスリンナノ粒子を脱水できることを示しており、より大きな負荷容量、より少ない添加剤要件、および運用コストの大きな利点をもたらします。
1922年に発見されて以来1,2,3、インスリンとその製剤は、1型糖尿病（T1DM）と2型糖尿病（T2DM）の患者の命を救ってきました。しかし、インスリンは高分子量タンパク質としての性質上、凝集しやすく、タンパク質分解酵素によって分解され、初回通過効果によって体外に排出されてしまいます。1型糖尿病と診断された人は、生涯にわたってインスリン注射が必要です。2型糖尿病と最初に診断された多くの患者も、長期にわたるインスリン注射を必要とします。毎日のインスリン注射は、これらの人々にとって深刻な痛みと不快感の原因となり、精神衛生にも悪影響を及ぼします。そのため、経口インスリン投与など、不快感の少ない他のインスリン投与方法が広く研究されています5。これは、世界中で約50億人の糖尿病患者の生活の質を回復させる可能性を秘めているためです。
ナノ粒子技術は、経口インスリンの投与において大きな進歩をもたらしました4,6,7。インスリンを効果的にカプセル化して分解から保護し、特定の身体部位に標的送達します。しかし、ナノ粒子製剤の使用には、主に粒子懸濁液の安定性の問題により、いくつかの制限があります。保管中に凝集が発生する可能性があり、これによりインスリンを搭載したナノ粒子の生物学的利用能が低下します8。さらに、インスリンナノ粒子（NP）の安定性を確保するには、ナノ粒子とインスリンのポリマーマトリックスの化学的安定性も考慮する必要があります。現在、凍結乾燥技術は、保管中の望ましくない変化を防ぎながら安定したNPを作成するためのゴールドスタンダードです9。
しかし、凍結乾燥では、ナノ粒子の球状構造が氷結晶の機械的ストレスの影響を受けないように、凍結保護剤を添加する必要があります。凍結保護剤が重量比の大部分を占めるため、凍結乾燥後のインスリンナノ粒子の含有量が大幅に減少します。そのため、インスリンの治療域を達成するには大量の乾燥ナノ粒子が必要となるため、製造されたインスリンナノ粒子は、経口錠剤や経口フィルムなどの乾燥粉末製剤の製造には不向きであることが多いのです。
スプレードライは、医薬品業界で液体相から乾燥粉末を製造するための、よく知られた安価な工業規模のプロセスです10,11。粒子形成プロセスを制御することで、いくつかの生物活性化合物を適切にカプセル化できます12,13。さらに、経口投与用のカプセル化タンパク質を調製するための効果的な技術となっています。スプレードライ中、水は非常に速く蒸発するため、粒子コアの温度を低く保つことができ11,14、熱に弱い成分のカプセル化への応用が可能になります。スプレードライの前に、コーティング材料をカプセル化成分を含む溶液と十分に均質化する必要があります11,14。凍結乾燥とは異なり、スプレードライでのカプセル化前の均質化は、脱水中のカプセル化効率を向上させます。スプレードライカプセル化プロセスは凍結保護剤を必要としないため、スプレードライは高負荷含有量の乾燥ナノ粒子の製造に使用できます。
本研究では、イオンゲル法を用いてキトサンとトリポリリン酸ナトリウムを架橋することにより、インスリンを封入したナノ粒子を製造したことを報告する。イオンゲル化は、特定の条件下で2つ以上のイオン種間の静電相互作用によりナノ粒子を製造できる調製法である。最適化されたキトサン/トリポリリン酸ナトリウム/インスリン架橋ナノ粒子の脱水には、凍結乾燥法と噴霧乾燥法の両方が用いられた。脱水後、SEMにより形態が分析された。サイズ分布、表面電荷、PDI、封入効率、および封入量を測定することにより、それらの再結合能力が評価された。異なる脱水法によって製造された再溶解ナノ粒子の品質は、インスリン保護、放出挙動、および細胞取り込み効率を比較することによっても評価された。
混合溶液のpHとキトサンとインスリンの比率は、イオン架橋ゲル化プロセスに直接影響するため、最終的なナノ粒子の粒子サイズと封入効率（EE）に影響を与える2つの重要な要因です。混合溶液のpHは、粒子サイズと封入効率と高い相関関係があることが示されました（図1a）。図1aに示すように、pHが4.0から6.0に増加すると、平均粒子サイズ（nm）は減少し、EEは大幅に増加しましたが、pHが6.5に増加すると、平均粒子サイズは増加し始め、EEは変化しませんでした。キトサンとインスリンの比率が増加すると、平均粒子サイズも増加します。さらに、キトサン/インスリンの質量比が2.5:1（w/w）を超えると、ナノ粒子のEEに変化は見られませんでした（図1b）。したがって、本研究における最適な調製条件（pH 6.0、キトサン/インスリン質量比2.5:1) を用いて、さらなる研究のためにインスリン含有ナノ粒子を調製した。この調製条件では、インスリンナノ粒子の平均粒子サイズは 318 nm (図 1c) に最適化され、PDI は 0.18、埋め込み効率は 99.4%、ゼータ電位は 9.8 mV、インスリン含有量は 25.01% (m/m) であった。透過型電子顕微鏡 (TEM) の結果に基づくと、最適化されたナノ粒子はほぼ球形で、比較的均一なサイズで離散的であった (図 1d)。
インスリンナノ粒子のパラメータ最適化: (a) pH がインスリンナノ粒子の平均直径と封入効率 (EE) に及ぼす影響 (キトサンとインスリンの質量比 5:1 で調製)、(b) キトサンとインスリンの質量比がインスリンナノ粒子の平均直径と封入効率 (EE) に及ぼす影響 (pH 6 で調製)、(c) 最適化されたインスリンナノ粒子の粒子サイズ分布、(d) 最適化されたインスリンナノ粒子の TEM 顕微鏡写真。
キトサンはpKaが6.5の弱電解質であることがよく知られています。酸性媒体では、主アミノ基が水素イオンによってプロトン化されるため、正に帯電します15。そのため、負に帯電した高分子をカプセル化するためのキャリアとしてよく使用されます。本研究では、等電点が5.3のインスリンをカプセル化するためにキトサンを使用しました。キトサンはコーティング材料として使用されるため、その割合が増加すると、ナノ粒子の外層の厚さが相応に増加し、平均粒子サイズが大きくなります。さらに、キトサンのレベルが高いほど、より多くのインスリンをカプセル化できます。私たちのケースでは、キトサンとインスリンの比率が2.5:1に達したときにEEが最高になり、比率がさらに増加し​​てもEEに大きな変化はありませんでした。
キトサンとインスリンの比率に加えて、pHもNPの調製において重要な役割を果たしました。Ganら17は、pHがキトサンナノ粒子の粒子サイズに及ぼす影響を研究しました。彼らは、pHが6.0に達するまで粒子サイズが継続的に減少し、pH > 6.0で粒子サイズが著しく増加することを発見しました。これは、我々の観察と一致しています。この現象は、pHが増加するとインスリン分子が負の表面電荷を獲得し、キトサン/トリポリリン酸ナトリウム（TPP）複合体との静電相互作用が促進され、結果として粒子サイズが小さくなり、EEが高くなるという事実によるものです。しかし、pHを6.5に調整すると、キトサン上のアミノ基が脱プロトン化され、キトサンが折り畳まれます。したがって、高いpHは、アミノイオンがTPPとインスリンに露出するのを減らし、結果として架橋が少なくなり、最終的な平均粒子サイズが大きくなり、EEが低くなります。
凍結乾燥および噴霧乾燥されたナノ粒子の形態学的特性の分析は、より優れた脱水および粉末形成技術の選択に役立つ。好ましい方法は、薬物の安定性、均一な粒子形状、高い薬物含有量、および元の溶液への良好な溶解性を提供する必要がある。本研究では、2つの技術をより適切に比較するために、脱水中に1%マンニトールを含む、または含まないインスリンナノ粒子を使用した。マンニトールは、凍結乾燥および噴霧乾燥用のさまざまな乾燥粉末製剤において、増量剤または凍結保護剤として使用される。図2aに示すように、マンニトールを含まない凍結​​乾燥インスリンナノ粒子では、走査型電子顕微鏡（SEM）下で、大きく不規則で粗い表面を持つ非常に多孔質の粉末構造が観察された。脱水後の粉末中に検出された離散粒子はごくわずかであった（図2e）。これらの結果は、凍結保護剤なしでは、凍結乾燥中にほとんどのナノ粒子が分解されたことを示している。1%マンニトールを含む凍結乾燥および噴霧乾燥インスリンナノ粒子では、滑らかな表面を持つ球状ナノ粒子が観察された。観察された（図 2b、d、f、h）。マンニトールなしで噴霧乾燥したインスリンナノ粒子は球形のままであったが、表面にしわが寄っていた（図 2c）。球形としわのある表面については、以下の放出挙動と細胞取り込み試験でさらに詳しく説明する。乾燥したナノ粒子の目に見える外観に基づくと、マンニトールなしで噴霧乾燥したナノ粒子と、凍結乾燥およびマンニトールありで噴霧乾燥したナノ粒子の両方から、細かいナノ粒子粉末が得られた（図 2f、g、h）。粒子表面間の表面積が大きいほど溶解度が高くなり、したがって放出速度も高くなる。
異なる脱水インスリンナノ粒子の形態: (a) マンニトールを含まない凍結​​乾燥インスリンナノ粒子の SEM 画像; (b) マンニトールを含む凍結乾燥インスリンナノ粒子の SEM 画像; (c) マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリンナノ粒子の SEM 画像; (d) マンニトールを含む噴霧乾燥インスリンナノ粒子の SEM 画像; (e) マンニトールを含まない凍結​​乾燥インスリンナノ粒子粉末の画像; (f) マンニトールを含む凍結乾燥インスリンナノ粒子の画像; (g) マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリンナノ粒子粉末の画像; (h) マンニトールを含む噴霧乾燥インスリンナノ粒子粉末の画像。
凍結乾燥中、マンニトールは凍結保護剤として働き、ナノ粒子を非晶質の形態に保ち、氷結晶による損傷を防ぎます19。対照的に、噴霧乾燥では凍結工程はありません。したがって、この方法ではマンニトールは必要ありません。実際、マンニトールなしで噴霧乾燥したナノ粒子は、前述のように、より細かいナノ粒子を生成しました。しかし、マンニトールは噴霧乾燥プロセスで充填剤として働き、ナノ粒子に球状の構造を与えることができます20（図2d）。これにより、カプセル化されたナノ粒子の均一な放出挙動が得られます。さらに、マンニトールを含む凍結乾燥および噴霧乾燥したインスリンナノ粒子の両方でいくつかの大きな粒子が検出されることは明らかです（図2b、d）。これは、カプセル化されたインスリンとともに粒子コアにマンニトールが蓄積したためと考えられます。キトサン層について。本研究では、脱水後も球状構造が損なわれないように、マンニトールとキトサンの比率を5:1に維持し、多量の充填剤によって乾燥ナノ粒子の粒子サイズを大きくできることに留意すべきである。
フーリエ変換赤外減衰全反射（FTIR-ATR）分光法により、遊離インスリン、キトサン、キトサン、TPP、およびインスリンの物理的混合物を特性評価した。すべての脱水ナノ粒子は、FTIR-ATR分光法を用いて特性評価した。特に、マンニトールで凍結乾燥したカプセル化ナノ粒子、およびマンニトールありとなしで噴霧乾燥したナノ粒子において、1641、1543、および1412 cm-1のバンド強度が観察された（図3）。以前に報告したように、これらの強度の増加は、キトサン、TPP、およびインスリン間の架橋に関連していた。キトサンとインスリンの相互作用の調査では、インスリンを封入したキトサンナノ粒子のFTIRスペクトルにおいて、キトサンバンドがインスリンのバンドと重なり、カルボニル強度（1641 cm-1）およびアミン（1543 cm-1）ベルトが増加していることが示された。TPPのトリポリリン酸基はアンモニウム基に結合している。キトサンは1412 cm-1にバンドを形成する。
遊離インスリン、キトサン、キトサン/TPP/インスリンの物理的混合物、および異なる方法で脱水されたナノ粒子のFTIR-ATRスペクトル。
さらに、これらの結果はSEMで示された結果と一致しており、マンニトールを添加して噴霧乾燥および凍結乾燥した場合、カプセル化されたナノ粒子は無傷のままであったが、マンニトールがない場合は噴霧乾燥のみでカプセル化された粒子が生成されたことが示された。対照的に、マンニトールなしで凍結乾燥したナノ粒子のFTIR-ATRスペクトル結果は、キトサン、TPP、およびインスリンの物理的混合物と非常によく似ていた。この結果は、マンニトールなしで凍結乾燥したナノ粒子には、キトサン、TPP、およびインスリン間の架橋がもはや存在しないことを示している。凍結保護剤なしで凍結乾燥するとナノ粒子の構造が破壊され、これはSEMの結果（図2a）で確認できる。脱水インスリンナノ粒子の形態およびFTIRの結果に基づいて、再構成実験には凍結乾燥、噴霧乾燥、およびマンニトールフリーのナノ粒子のみを使用し、マンニトールフリーナノ粒子は分解したため、使用しなかった。脱水時のナノ粒子について議論する。
脱水は長期保存および他の製剤への再加工に使用されます。乾燥ナノ粒子が保存後に再構成できる能力は、錠剤やフィルムなどのさまざまな製剤での使用にとって重要です。マンニトールがない噴霧乾燥インスリンナノ粒子の平均粒子サイズは、再構成後にわずかに増加しただけであることがわかりました。一方、マンニトールを含む噴霧乾燥および凍結乾燥インスリンナノ粒子の粒子サイズは大幅に増加しました（表1）。本研究のすべてのナノ粒子を再結合した後、PDIとEEは有意に変化しませんでした（p > 0.05）（表1）。この結果は、ほとんどの粒子が再溶解後もそのまま残っていることを示しています。しかし、マンニトールの添加により、凍結乾燥および噴霧乾燥マンニトールナノ粒子のインスリン負荷が大幅に減少しました（表1）。対照的に、マンニトールなしで噴霧乾燥したナノ粒子のインスリン負荷量は以前と同じままでした（表1）。
薬物送達目的で使用する場合、ナノ粒子の負荷量が重要であることはよく知られています。負荷量の少ないナノ粒子の場合、治療閾値に達するには非常に大量の材料が必要です。しかし、このような高濃度のナノ粒子の高粘度は、それぞれ経口投与と注射剤製剤の不便さと困難につながります22。さらに、インスリンナノ粒子は錠剤や粘性のあるバイオフィルムを作るためにも使用できます23、24。これには、低負荷レベルで大量のナノ粒子を使用する必要があり、経口用途には適さない大きな錠剤と厚いバイオフィルムになります。したがって、インスリン負荷量の多い脱水ナノ粒子が非常に望ましいです。私たちの結果は、マンニトールを含まない噴霧乾燥ナノ粒子の高インスリン負荷量が、これらの代替送達方法に多くの魅力的な利点をもたらす可能性があることを示唆しています。
脱水したすべてのナノ粒子は冷蔵庫に3か月間保管した。SEMの結果、脱水したすべてのナノ粒子の形態は3か月の保管期間中に大きく変化しなかったことが示された（図4）。水で再構成した後、すべてのナノ粒子はEEがわずかに減少し、3か月の保管期間中に約少量（約5％）のインスリンを放出した（表2）。しかし、すべてのナノ粒子の平均粒子サイズは増加した。マンニトールなしで噴霧乾燥したナノ粒子の粒子サイズは525 nmに増加したが、マンニトールを使用して噴霧乾燥および凍結乾燥したナノ粒子の粒子サイズはそれぞれ872 nmおよび921 nmに増加した（表2）。
3か月間保存した様々な脱水インスリンナノ粒子の形態：（a）マンニトールを含む凍結乾燥インスリンナノ粒子のSEM画像；（b）マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリンナノ粒子のSEM画像；（c）マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリンナノ粒子のSEM画像。
さらに、マンニトールで噴霧乾燥および凍結乾燥した再構成インスリンナノ粒子には沈殿物が見られました（図S2）。これは、大きな粒子が水中に適切に懸濁していないことが原因である可能性があります。上記の結果はすべて、噴霧乾燥技術がインスリンナノ粒子を脱水から保護できること、および充填剤や凍結保護剤を使用せずに高濃度のインスリンナノ粒子が得られることを示しています。
脱水後の酵素消化に対するナノ粒子の保護能力を実証するため、pH = 2.5の培地でペプシン、トリプシン、およびα-キモトリプシンを用いてインスリン保持を試験した。脱水したナノ粒子のインスリン保持を、調製したばかりのナノ粒子のインスリン保持と比較し、遊離インスリンをネガティブコントロールとして使用した。本研究では、遊離インスリンは3種類の酵素処理すべてにおいて4時間以内に急速に消失した（図5a～c）。一方、マンニトールで凍結乾燥したナノ粒子、およびマンニトールの有無にかかわらず噴霧乾燥したナノ粒子のインスリン消失試験では、これらのナノ粒子は酵素消化に対して有意に高い保護効果を示し、これは調製したばかりのインスリンナノ粒子と同様であった（図1）。5a～c）。ペプシン、トリプシン、およびα-キモトリプシン中のナノ粒子の助けにより、それぞれ4時間以内に50%、60%、および75%以上のインスリンが保護された。 （図5a～c）。このインスリン保護能力により、血流へのインスリン吸収率が高まる可能性がある25。これらの結果は、マンニトールの有無にかかわらず噴霧乾燥およびマンニトールを使用した凍結乾燥により、脱水後もナノ粒子のインスリン保護能力を維持できることを示唆している。
脱水インスリンナノ粒子の保護と放出挙動：（a）ペプシン溶液中のインスリンの保護；（b）トリプシン溶液中のインスリンの保護；（c）α-キモトリプシン溶液によるインスリンの保護；（d）pH = 2.5溶液中の脱水ナノ粒子の放出挙動；（e）pH = 6.6溶液中の脱水ナノ粒子の放出挙動；（f）pH = 7.0溶液中の脱水ナノ粒子の放出挙動。
新鮮に調製および再構成した乾燥インスリンナノ粒子を、胃、十二指腸、および上部小腸のpH環境をシミュレートする様々な緩衝液（pH = 2.5、6.6、7.0）中で37℃でインキュベートし、インスリン抵抗性に対するインスリンの効果を調べた。異なる環境下での放出挙動。消化管断片。pH = 2.5 では、インスリンを封入した NP と再溶解した乾燥インスリン NP は、最初の 1 時間以内に初期バースト放出を示し、その後 5 時間にわたってゆっくりと放出されました (図 5d)。この初期の急速な放出は、粒子の内部構造に完全に固定されていないタンパク質分子の表面からの急速な脱着の結果である可能性が最も高いです。pH = 6.5 では、試験溶液の pH が NP 調製溶液の pH と類似していたため、インスリンを封入した NP と再構成した乾燥インスリン NP は 6 時間にわたって滑らかでゆっくりとした放出を示しました (図 5e)。pH = 7 では、NP は不安定で、最初の 2 時間以内にほぼ完全に分解しました (図 5f)。これは、より高い pH でキトサンの脱プロトン化が起こり、その結果、ポリマー ネットワークがよりコンパクトではなくなり、封入されたインスリンが放出されるためです。
さらに、マンニトールなしで噴霧乾燥したインスリンNPは、他の脱水NPよりも速い放出プロファイルを示しました（図5d～f）。前述のように、マンニトールなしで乾燥させた再構成インスリンNPは最小の粒子サイズを示しました。小さな粒子はより大きな表面積を提供するため、関連する薬物のほとんどが粒子の表面またはその近くに存在し、迅速な薬物放出につながります26。
ナノ粒子の細胞毒性はMTTアッセイによって調べられた。図S4に示すように、脱水されたすべてのナノ粒子は50～500μg/mlの濃度で細胞生存率に有意な影響を与えないことがわかり、すべての脱水されたナノ粒子は治療域に到達するために安全に使用できることが示唆された。
肝臓は、インスリンが生理機能を発揮する主要な臓器です。HepG2細胞は、in vitro肝細胞取り込みモデルとして一般的に使用されるヒト肝癌細胞株です。ここでは、HepG2細胞を使用して、凍結乾燥法および噴霧乾燥法で脱水したナノ粒子の細胞内取り込みを評価しました。フローサイトメトリーと視覚を用いた共焦点レーザー走査による細胞内取り込みは、25 μg/mLの濃度の遊離FITCインスリン、新鮮に調製したFITCインスリン含有ナノ粒子、および同等のインスリン濃度の脱水FITCインスリン含有ナノ粒子と数時間インキュベートした後に、定量顕微鏡（CLSM）観察を実施しました。マンニトールを含まない凍結​​乾燥ナノ粒子は脱水中に破壊され、このテストでは評価されませんでした。新鮮に調製したインスリン含有ナノ粒子、マンニトールを含む凍結乾燥ナノ粒子、およびマンニトールの有無にかかわらず噴霧乾燥したナノ粒子の細胞内蛍光強度（図）。 6a）は、遊離インスリン群と比較してそれぞれ4.3倍、2.6倍、2.4倍、4.1倍高かった（図6b）。これらの結果は、カプセル化されたインスリンが遊離インスリンよりも細胞への取り込みが強力であることを示唆しており、これは主に、本研究で製造されたインスリンを封入したナノ粒子のサイズが小さいことによるものである。
新鮮に調製したナノ粒子および脱水したナノ粒子を4時間培養した後のHepG2細胞の取り込み：（a）HepG2細胞によるFITC-インスリンの取り込み分布。（b）フローサイトメトリーで分析した蛍光強度の幾何平均（n = 3）、*P < 0.05は遊離インスリンと比較。
同様に、CLSM画像では、新たに調製したFITC-インスリン含有ナノ粒子とFITC-インスリン含有スプレードライナノ粒子（マンニトールなし）のFITC蛍光強度が、他のサンプルよりもはるかに強いことが示されました（図6a）。さらに、マンニトールの添加により、溶液の粘度が高くなり、細胞への取り込みに対する抵抗が増加し、インスリン増殖が減少しました。これらの結果は、再溶解後の粒子サイズが凍結乾燥ナノ粒子よりも小さいため、マンニトールを含まないスプレードライナノ粒子が最も高い細胞取り込み効率を示したことを示唆しています。
キトサン（平均分子量100 kDa、脱アセチル化度75～85%）はSigma-Aldrich社（カナダ、オンタリオ州オークビル）から購入した。トリポリリン酸ナトリウム（TPP）はVWR社（米国ペンシルベニア州ラドナー）から購入した。本研究で使用した組換えヒトインスリンはFisher Scientific社（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から入手した。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識ヒトインスリンおよび4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）はSigma-Aldrich社（カナダ、オンタリオ州オークビル）から購入した。HepG2細胞株はATCC社（米国バージニア州マナサス）から入手した。その他の試薬はすべて分析用またはクロマトグラフィー用グレードである。
0.1%酢酸を含む二回蒸留水（DD水）に溶解して、1 mg/mlのCS溶液を調製する。DD水と0.1%酢酸にそれぞれ溶解して、1 mg/mlのTPP溶液とインスリン溶液を調製する。プレエマルジョンは、ポリトロンPCU-2-110高速ホモジナイザー（Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA）を用いて調製した。調製手順は以下のとおりである。まず、2 mlのTPP溶液を4 mlのインスリン溶液に加え、混合物を30分間攪拌して完全に混合する。次に、混合溶液をシリンジを通してCS溶液に高速攪拌（10,000 rpm）しながら滴下する。混合物を氷浴中で30分間高速攪拌（15,000 rpm）し、特定のpHに調整して架橋インスリンナノ粒子を得る。インスリンナノ粒子は、プローブ型超音波処理装置（UP 200ST、Hielscher Ultrasonics、ドイツ、テルツォウ）を使用して氷浴中でさらに30分間超音波処理された。
インスリンナノ粒子は、25℃のDD水で希釈し、Litesizer 500（Anton Paar、オーストリア、グラーツ）を用いた動的光散乱（DLS）測定により、Z平均直径、多分散指数（PDI）、およびゼータ電位を測定した。形態およびサイズ分布は、日立H7600透過型電子顕微鏡（TEM）（日立、東京、日本）で特性評価し、その後、日立イメージングソフトウェア（日立、東京、日本）を使用して画像を解析した。インスリンナノ粒子の封入効率（EE）および負荷容量（LC）を評価するために、ナノ粒子を分子量カットオフ100 kDaの限外ろ過チューブにピペットで分注し、500 xgで30分間遠心分離した。ろ液中の未封入インスリンは、四元ポンプ、オートサンプラー、カラムヒーターとDAD検出器。インスリンはC18カラム（Zorbax、3.5 μm、4.6 mm × 150 mm、Agilent、米国）で分析され、214 nmで検出された。移動相はアセトニトリルと水で、0.1% TFAを含み、グラジエント比は10/90から100/0で、10分間実行した。移動相は1.0 ml/minの流量でポンプで送液した。カラム温度は20 °Cに設定した。式(1)と式(2)を使用してEEとLCの割合を計算する。
インスリンナノ粒子を最適化するために、2.0～4.0の範囲でさまざまなCS/インスリン比をテストしました。調製中にCS溶液をさまざまな量で添加し、インスリン/TPP混合比は一定に保ちました。すべての溶液（インスリン、TPP、CS）を添加した後、混合液のpHを注意深く制御することにより、pH範囲4.0～6.5でインスリンナノ粒子を調製しました。インスリンナノ粒子の形成を最適化するために、さまざまなpH値とCS/インスリン質量比でインスリンナノ粒子のEEと粒子サイズを評価しました。
最適化されたインスリンナノ粒子をアルミニウム容器に置き、テープでしっかりと固定したティッシュで覆いました。その後、ねじ込み式の容器をトレイ乾燥機を備えたLabconco FreeZone凍結乾燥​​機（Labconco、カンザスシティ、ミズーリ州、米国）に入れました。温度と真空圧力は、最初の2時間は-10℃、0.350 Torrに設定し、残りの22時間は0℃、0.120 Torrに設定して、乾燥したインスリンナノ粒子を得ました。
カプセル化インスリンの製造には、Buchi Mini Spray Dryer B-290（BÜCHI社、スイス、フラヴィル）を使用した。選択した乾燥パラメータは、温度100℃、供給流量3L/分、ガス流量4L/分であった。
脱水前後のインスリンナノ粒子は、FTIR-ATR分光法を用いて特性評価を行った。脱水ナノ粒子、遊離インスリン、キトサンは、汎用ATRサンプリングアクセサリ（PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を備えたSpectrum 100 FTIR分光光度計（PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を用いて分析した。信号の平均値は、4000～600 cm2の周波数範囲で4 cm2の分解能で16回のスキャンから得られた。
乾燥インスリンナノ粒子の形態は、Helios NanoLab 650集束イオンビーム走査型電子顕微鏡（FIB-SEM）（FEI社、米国オレゴン州ヒルズボロ）で撮影した凍結乾燥および噴霧乾燥インスリンナノ粒子のSEM画像によって評価した。主なパラメータは、電圧5 keV、電流30 mAであった。
脱水したインスリンナノ粒子はすべて超純水に再溶解した。脱水後の品質を評価するため、前述の方法と同じ方法で粒子サイズ、PDI、EE、LCを再度測定した。無水インスリンナノ粒子の安定性も、長期間保存後のナノ粒子の特性をテストすることで測定した。本研究では、脱水後のすべてのナノ粒子を冷蔵庫に3か月間保存した。3か月保存後、ナノ粒子の形態学的粒子サイズ、PDI、EE、LCをテストした。
脱水後のナノ粒子の保護におけるインスリンの有効性を評価するため、再構成したナノ粒子5 mLを、模擬胃液（pH 1.2、1%ペプシン含有）、腸液（pH 6.8、1%トリプシン含有）、またはキモトリプシン溶液（リン酸緩衝液中100 g/mL、pH 7.8）を含む45 mLに溶解した。これらを37℃で100 rpmの攪拌速度でインキュベートした。異なる時点で溶液500 μLを採取し、HPLCによりインスリン濃度を測定した。
新鮮に調製し脱水したインスリンナノ粒子のin vitro放出挙動を透析バッグ法（分子量カットオフ100 kDa、Spectra Por Inc.）で試験した。新鮮に調製し再構成した乾燥ナノ粒子を、それぞれ胃、十二指腸、小腸上部のpH環境をシミュレートするために、pH 2.5、pH 6.6、pH 7.0（0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水、PBS）の液体中で透析した。すべてのサンプルを37℃で200 rpmで連続振盪しながらインキュベートした。5 mL透析バッグから以下の時間（0.5、1、2、3、4、6時間）で液体を吸引し、直ちに新鮮な透析液で容量を補充した。液体中のインスリン汚染をHPLCで分析し、ナノ粒子からのインスリン放出速度を、放出された遊離インスリンとナノ粒子に封入されたインスリンの総量（式3）。
ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞は、10%ウシ胎児血清、100 IU/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて、直径60 mmのディッシュで培養した29。培養は37℃、相対湿度95%、CO2濃度5%で維持した。取り込みアッセイでは、HepG2細胞を8ウェルNunc Lab-Tekチャンバースライドシステム（Thermo Fisher、NY、USA）に1 × 10⁵細胞/mlの密度で播種した。細胞毒性アッセイでは、96ウェルプレート（Corning、NY、USA）に5 × 10⁴細胞/mlの密度で播種した。
MTTアッセイを用いて、新鮮に調製した脱水インスリンNP30の細胞毒性を評価した。HepG2細胞を96ウェルプレートに5×10⁴細胞/mLの密度で播種し、試験前に7日間培養した。インスリンNPを培養培地で様々な濃度（50～500μg/mL）に希釈し、細胞に投与した。24時間培養後、細胞をPBSで3回洗浄し、0.5mg/mlのMTTを含む培地でさらに4時間培養した。細胞毒性は、Tecan infinite M200 pro分光光度計プレートリーダー（Tecan、スイス、メネドルフ）を用いて、570nmで黄色のテトラゾリウムMTTの紫色のホルマザンへの酵素的還元を測定することによって評価した。
NPの細胞内取り込み効率は、共焦点レーザー走査顕微鏡とフローサイトメトリー分析によってテストされました。Nunc Lab-Tekチャンバースライドシステムの各ウェルに、同じ濃度の遊離FITC-インスリン、FITC-インスリン搭載NP、および25 μg/mLの脱水FITC-インスリンNPを再溶解し、4時間インキュベートしました。細胞をPBSで3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定しました。核は4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色しました。インスリンの局在は、Olympus FV1000レーザー走査/二光子共焦点顕微鏡（オリンパス、東京都新宿区）を使用して観察しました。フローサイトメトリー分析では、同じ濃度の10 μg/mLの遊離FITC-インスリン、FITC-インスリン搭載NP、および再溶解した脱水FITC-インスリンナノ粒子をHepG2細胞を播種した96ウェルプレートに添加し、4時間インキュベートした。4時間のインキュベーション後、細胞を除去し、FBSで3回洗浄した。サンプルあたり5×10⁴個の細胞をBD LSR IIフローサイトメーター（BD、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）で分析した。
すべての値は平均値±標準偏差で表されます。すべてのグループ間の比較は、IBM SPSS Statistics 26 for Mac（IBM、ニューヨーク州エンディコット、米国）による一元配置分散分析またはt検定を用いて評価され、p < 0.05が統計的に有意であるとみなされました。
この研究では、スプレードライ法が、増量剤や凍結保護剤を用いた標準的な凍結乾燥法と比較して、架橋キトサン/TPP/インスリンナノ粒子の脱水において、より優れた再構成性と高い負荷容量を実現する柔軟性と能力を有することが実証されました。最適化されたインスリンナノ粒子は、平均粒子サイズ318 nm、封入効率99.4%を示しました。脱水後のSEMおよびFTIRの結果から、球状構造はマンニトールの有無にかかわらずスプレードライされたナノ粒子とマンニトールで凍結乾燥したナノ粒子でのみ維持され、マンニトールなしで凍結乾燥したナノ粒子は脱水中に分解されたことが示されました。再構成能力試験では、マンニトールなしでスプレードライされたインスリンナノ粒子が、再構成時に最も小さい平均粒子サイズと最も高い負荷量を示しました。これらの脱水されたナノ粒子の放出挙動は、pH = 2.5およびpH = 7の溶液中では急速に放出され、pH = 6.5の溶液中では非常に安定していることを示しました。他の再溶解脱水ナノ粒子と比較して、マンニトールなしで噴霧乾燥したナノ粒子が最も速い放出を示しました。この結果は、細胞取り込みアッセイで観察された結果と一致しており、マンニトールのない噴霧乾燥したナノ粒子は、新たに調製したナノ粒子の細胞取り込み効率をほぼ完全に維持しました。これらの結果は、マンニトールフリー噴霧乾燥によって調製された乾燥インスリンナノ粒子が、経口錠剤や生体接着フィルムなどの他の無水剤形へのさらなる加工に最も適していることを示唆しています。
知的財産権の問題により、本研究で生成および／または分析されたデータセットは一般には公開されていませんが、合理的な要請があれば、それぞれの著者から入手可能です。
Kagan, A. 2型糖尿病：社会的および科学的起源、医学的合併症、患者およびその他への影響。（McFarlane、2009）。
Singh, AP、Guo, Y.、Singh, A.、Xie, W.、Jiang, P. インスリンカプセル化の開発：経口投与は可能になったか？J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY、Al-Salami, H.、Dass, CR「糖尿病治療のための経口インスリン封入リポソーム送達システムの最近の進歩。解釈」J. Pharmacy.549、201–217 (2018)。