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高負荷量のインスリンナノ粒子（NP）は、様々な剤形で様々な用途が見出されています。本研究では、凍結乾燥および噴霧乾燥プロセスが、凍結保護剤としてマンニトールの有無にかかわらず、インスリン負荷キトサンナノ粒子の構造に及ぼす影響を評価することを目的としています。また、これらのナノ粒子を再溶解して品質を評価しました。脱水前のキトサン/トリポリリン酸ナトリウム/インスリン架橋ナノ粒子の粒子サイズは318 nmに最適化され、PDIは0.18、カプセル化効率は99.4％、負荷率は25.01％でした。再構成後、マンニトールを使用しない凍結乾燥法で製造されたものを除くすべてのナノ粒子は、球状の粒子構造を維持しました。いずれかのスプレーで脱水したマンニトール含有ナノ粒子と比較して、マンニトールを含まない噴霧乾燥ナノ粒子は、乾燥または凍結乾燥技術によるカプセル化率 (98.7%) および PDI (0.20) は同等ですが、平均粒子サイズ (376 nm) および充填量 (25.02%) が最も小さいものが得られました。マンニトールを使用しない噴霧乾燥による乾燥したナノ粒子では、インスリンの放出が最も速く、細胞への取り込みの効率が最も高くなりました。この研究は、噴霧乾燥により、従来の凍結乾燥法と比較して凍結保護剤を必要とせずにインスリンナノ粒子を脱水できるため、充填容量が大きく、添加剤の必要性が低く、運用コストが大幅に削減されるという大きな利点があることを示しています。
1922 年の発見以来1,2,3、インスリンおよびその医薬品は、1 型糖尿病 (T1DM) および 2 型糖尿病 (T1DM) の患者の命を救ってきました。しかし、高分子タンパク質であるという特性上、インスリンは凝集しやすく、タンパク質分解酵素により分解され、初回通過効果により排除されます。1 型糖尿病と診断された人は、生涯にわたってインスリン注射が必要です。最初に 2 型糖尿病と診断された患者の多くも、長期のインスリン注射が必要です。これらの人々にとって、毎日のインスリン注射は日常的な痛みと不快感の深刻な原因であり、精神衛生に悪影響を及ぼします。その結果、経口インスリン投与などの不快感の少ない他の形態のインスリン投与が、世界中で約 50 億人の糖尿病患者の生活の質を回復させる可能性があるとして、広く研究されています5。
ナノ粒子技術は、経口インスリンの摂取の試みにおいて大きな進歩をもたらしました4,6,7。インスリンを効果的にカプセル化し、分解から保護して、特定の身体部位に標的を絞って送達するもの。ただし、ナノ粒子製剤の使用には、主に粒子懸濁液の安定性の問題により、いくつかの制限があります。保管中に凝集が発生する可能性があり、インスリンを搭載したナノ粒子の生物学的利用能が低下します8。さらに、インスリンナノ粒子 (NP) の安定性を確保するには、ナノ粒子とインスリンのポリマーマトリックスの化学的安定性も考慮する必要があります。現在、凍結乾燥技術は、保管中の望ましくない変化を防ぎながら安定した NP を作成するためのゴールドスタンダードです9。
しかし、凍結乾燥では、NP の球状構造が氷結晶の機械的ストレスの影響を受けないようにするために、凍結保護剤を添加する必要があります。凍結保護剤が重量比の大部分を占めるため、凍結乾燥後のインスリンナノ粒子の充填量が大幅に減少します。したがって、生成されたインスリン NP は、インスリンの治療濃度域を達成するために大量の乾燥ナノ粒子が必要になるため、経口錠剤や経口フィルムなどの乾燥粉末製剤の製造には不向きであることがよくあります。
スプレー乾燥は、製薬業界で液相から乾燥粉末を製造するためのよく知られた安価な工業規模のプロセスです10,11。粒子形成プロセスを制御することで、いくつかの生理活性化合物を適切にカプセル化できます12, 13。さらに、経口投与用のカプセル化されたタンパク質を調製するための効果的な技術になっています。スプレー乾燥中は、水が非常に速く蒸発するため、粒子コアの温度を低く保つことができ11,14、熱に弱い成分をカプセル化するために使用できます。スプレー乾燥の前に、コーティング材料をカプセル化する成分を含む溶液で完全に均質化する必要があります11,14。凍結乾燥とは異なり、スプレー乾燥でのカプセル化前の均質化により、脱水中のカプセル化効率が向上します。スプレー乾燥カプセル化プロセスでは凍結保護剤が必要ないため、スプレー乾燥を使用して、高負荷量の乾燥NPを製造できます。
本研究では、イオンゲル法を用いてキトサンとトリポリリン酸ナトリウムを架橋結合させることによりインスリンを充填したNPを製造したことを報告します。イオンゲル化は、特定の条件下で2つ以上のイオン種間の静電相互作用を介してナノ粒子を製造できる調製方法です。凍結乾燥と噴霧乾燥の両方の技術を使用して、最適化されたキトサン/トリポリリン酸ナトリウム/インスリン架橋ナノ粒子を脱水しました。脱水後、その形態をSEMで分析しました。サイズ分布、表面電荷、PDI、カプセル化効率、および充填量を測定して、再結合能力を評価しました。異なる脱水方法で製造された再可溶化ナノ粒子の品質も、インスリン保護、放出挙動、および細胞取り込み効率を比較することにより評価しました。
混合溶液のpHとキトサンとインスリンの比率は、イオントロピックゲル化プロセスに直接影響するため、最終的なナノ粒子の粒子サイズとカプセル化効率（EE）に影響を与える2つの重要な要因です。混合溶液のpHは、粒子サイズとカプセル化効率と高い相関関係にあることが示されました（図1a）。図1aに示すように、pHが4.0から6.0に増加すると、平均粒子サイズ（nm）が減少し、EEが大幅に増加しましたが、pHが6.5に増加すると、平均粒子サイズが増加し始め、EEは変化しませんでした。キトサンとインスリンの比率が増加すると、平均粒子サイズも増加します。さらに、キトサン/インスリンの質量比が2.5:1（w/w）を超えるナノ粒子を調製した場合、EEに変化は見られませんでした（図1b）。したがって、本研究における最適な調製条件（pH 6.0、キトサン/インスリン質量比2.5:1) を用いてインスリン充填ナノ粒子を調製し、さらなる研究を行いました。この製造方法では、インスリンナノ粒子の平均粒子サイズは 318 nm に最適化され (図 1c)、PDI は 0.18、埋め込み効率は 99.4%、ゼータ電位は 9.8 mv、インスリン充填率は 25.01% (m/m ) でした。透過型電子顕微鏡 (TEM) の結果によると、最適化されたナノ粒子はほぼ球形で、比較的均一なサイズで離散的でした (図 1d)。
インスリンナノ粒子のパラメータ最適化：（a）インスリンナノ粒子の平均直径とカプセル化効率（EE）に対するpHの影響（キトサンとインスリンの質量比5：1で調製）。（b）キトサンとインスリンの質量比がインスリンNPの平均直径とカプセル化効率（EE）に与える影響（pH 6で調製）。（c）最適化されたインスリンナノ粒子の粒度分布。（d）最適化されたインスリンNPのTEM顕微鏡写真。
キトサンは pKa が 6.5 の弱い高分子電解質であることはよく知られています。キトサンの主なアミノ基は水素イオンによってプロトン化されるため、酸性媒体では正に帯電します15。そのため、負に帯電した高分子をカプセル化するキャリアとしてよく使用されます。この研究では、等電点が 5.3 のインスリンをカプセル化するためにキトサンを使用しました。キトサンはコーティング材料として使用されているため、キトサンの割合が増加すると、ナノ粒子の外層の厚さもそれに応じて増加し、平均粒子サイズが大きくなります。さらに、キトサンのレベルが高いほど、より多くのインスリンをカプセル化できます。私たちのケースでは、キトサンとインスリンの比率が 2.5:1 に達したときに EE が最高になり、比率が増加し続けても EE に大きな変化はありませんでした。
キトサンとインスリンの比率のほかに、pH も NP の調製に重要な役割を果たしました。Gan ら17 は、キトサン ナノ粒子の粒子サイズに対する pH の影響を調査しました。彼らは、pH が 6.0 に達するまで粒子サイズが継続的に減少し、pH > 6.0 で粒子サイズの大幅な増加が観察されたことを発見しました。これは、私たちの観察と一致しています。この現象は、pH の上昇に伴ってインスリン分子が負の表面電荷を獲得し、キトサン/トリポリリン酸ナトリウム (TPP) 複合体との静電相互作用に有利になり、粒子サイズが小さくなり、EE が高くなるためです。ただし、pH を 6.5 に調整すると、キトサンのアミノ基が脱プロトン化され、キトサンが折り畳まれました。したがって、pH が高いと、TPP およびインスリンへのアミノイオンの露出が少なくなり、架橋が少なくなり、最終的な平均粒子サイズが大きくなり、EE が低くなります。
凍結乾燥およびスプレー乾燥されたナノ粒子の形態学的特性を分析することで、より適切な脱水および粉末形成技術を選択することができます。好ましい方法は、薬物の安定性、均一な粒子形状、高い薬物負荷、および元の溶液への良好な溶解性を提供する必要があります。本研究では、2つの技術をよりよく比較するために、脱水中に1%マンニトールを含むまたは含まないインスリンナノ粒子を使用しました。マンニトールは、凍結乾燥およびスプレー乾燥のためのさまざまな乾燥粉末製剤において、増量剤または凍結保護剤として使用されます。図2aに示すように、マンニトールを含まない凍結​​乾燥したインスリンナノ粒子では、走査型電子顕微鏡（SEM）下で、大きく不規則で粗い表面を持つ高度に多孔質の粉末構造が観察されました。脱水後の粉末には、いくつかの離散粒子が検出されました（図2e）。これらの結果は、凍結保護剤なしで凍結乾燥中にほとんどのNPが分解したことを示しています。1%マンニトールを含む凍結乾燥およびスプレー乾燥インスリンナノ粒子では、球形ナノ粒子滑らかな表面が観察されました (図 2b、d、f、h)。マンニトールなしで噴霧乾燥したインスリンナノ粒子は球形を維持しましたが、表面にしわがありました (図 2c)。球形としわのある表面については、以下の放出挙動と細胞取り込みテストでさらに説明します。乾燥した NP の目に見える外観に基づくと、マンニトールなしで噴霧乾燥した NP と、マンニトールを加えて凍結乾燥させて噴霧乾燥した NP の両方で、微細な NP 粉末が得られました (図 2f、g、h)。粒子表面間の表面積が大きいほど、溶解度が高くなり、したがって放出速度が速くなります。
さまざまな脱水インスリン NP の形態：（a）マンニトールを含まない凍結​​乾燥インスリン NP の SEM 画像、（b）マンニトールを含む凍結乾燥インスリン NP の SEM 画像、（c）マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリン NP の SEM 画像、（d）マンニトールとともに噴霧乾燥したインスリン NP の SEM 画像、（e）マンニトールを含まない凍結​​乾燥インスリン NP 粉末の画像、（f）マンニトールを含む凍結乾燥インスリン NP の画像、（g）マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリン NP 粉末の画像、（h）マンニトールを含む噴霧乾燥インスリン NP 粉末の画像。
凍結乾燥中、マンニトールは凍結保護剤として機能し、NPをアモルファス状態に保ち、氷結晶による損傷を防ぎます19。対照的に、スプレー乾燥中は凍結ステップがありません。したがって、この方法ではマンニトールは必要ありません。実際、マンニトールなしでスプレー乾燥したNPは、前述のように、より微細なNPを生み出しました。しかし、マンニトールはスプレー乾燥プロセスで充填剤として機能し、NPをより球状の構造にすることができ20（図2d）、このようにカプセル化されたNPの均一な放出挙動を得るのに役立ちます。さらに、マンニトールを含む凍結乾燥およびスプレー乾燥したインスリンNPの両方で、いくつかの大きな粒子が検出されることは明らかです（図2b、d）。これは、カプセル化されたインスリンと一緒に粒子コアにマンニトールが蓄積するためであると考えられます。キトサン層へ。この研究では、脱水後に球状構造が損なわれないようにするために、マンニトールとキトサンの比率を5：1に保ち、大量の充填剤によって乾燥したNPの粒子サイズを拡大できることは注目に値します。
フーリエ変換赤外減衰全反射（FTIR-ATR）分光法を用いて、遊離インスリン、キトサン、キトサン、TPP、インスリンの物理的混合物を特性評価した。すべての脱水ナノ粒子は、FTIR-ATR分光法を用いて特性評価された。特に、マンニトールで凍結乾燥したカプセル化ナノ粒子、およびマンニトールの有無にかかわらず噴霧乾燥したナノ粒子では、1641、1543、および1412 cm-1のバンド強度が観察された（図3）。以前に報告されているように、これらの強度の増加は、キトサン、TPP、およびインスリン間の架橋に関連していた。キトサンとインスリン間の相互作用の調査により、インスリンを充填したキトサンナノ粒子のFTIRスペクトルにおいて、キトサンのバンドがインスリンのバンドと重なり、カルボニル強度（1641 cm-1）とアミン強度（1543 cm-1）が増加することが示された。TPPのトリポリリン酸基はアンモニウム基に結合している。キトサンでは1412 cm-1にバンドを形成します。
遊離インスリン、キトサン、キトサン/TPP/インスリンの物理的混合物、およびさまざまな方法で脱水された NP の FTIR-ATR スペクトル。
さらに、これらの結果はSEMで示された結果と一致しており、カプセル化されたNPはマンニトールで噴霧および凍結乾燥されたときに両方とも無傷のままであったが、マンニトールがない場合、噴霧乾燥のみがカプセル化された粒子を生成した。対照的に、マンニトールなしで凍結乾燥したNPのFTIR-ATRスペクトルの結果は、キトサン、TPP、およびインスリンの物理的混合物と非常に類似していた。この結果は、キトサン、TPP、およびインスリン間の架橋が、マンニトールなしで凍結乾燥したNPにはもはや存在しないことを示している。NPの構造は、凍結保護剤なしで凍結乾燥中に破壊され、SEM結果（図2a）で確認できる。脱水インスリンNPの形態とFTIR結果に基づいて、凍結乾燥、噴霧乾燥、およびマンニトールフリーのNPのみが再構成実験に使用され、マンニトールフリーのNPは、脱水時のマンニトールを含まないNP。議論します。
脱水は、長期保存および他の製剤への再処理に使用されます。保存後に乾燥 NP を再構成できるかどうかは、錠剤やフィルムなどのさまざまな製剤で使用するために重要です。マンニトールが存在しない噴霧乾燥インスリン NP の平均粒子サイズは、再構成後にわずかにしか増加しませんでした。一方、マンニトールを添加した噴霧乾燥および凍結乾燥インスリンナノ粒子の粒子サイズは大幅に増加しました (表 1)。本研究では、すべての NP を再結合した後、PDI と EE に有意な変化はありませんでした (p > 0.05) (表 1)。この結果は、再溶解後もほとんどの粒子がそのまま残っていることを示しています。ただし、マンニトールを添加すると、凍結乾燥および噴霧乾燥したマンニトールナノ粒子のインスリン負荷が大幅に減少しました (表 1)。
薬物送達目的で使用する場合、ナノ粒子の充填が非常に重要であることはよく知られています。充填量の少ない NP の場合、治療閾値に到達するのに非常に大量の材料が必要です。しかし、このような高 NP 濃度の高粘度は、経口投与と注射剤のそれぞれで不便さと困難をもたらします 22 。さらに、インスリン NP は錠剤と粘性バイオフィルムの製造にも使用できます 23, 24 。これには、低充填レベルで大量の NP を使用する必要があり、結果として経口用途には適さない大きな錠剤と厚いバイオフィルムが生成されます。したがって、インスリン充填量の多い脱水 NP が非常に望ましいです。私たちの研究結果は、マンニトールを含まない噴霧乾燥 NP の高インスリン充填が、これらの代替送達方法に多くの魅力的な利点を提供できることを示唆しています。
すべての脱水NPは冷蔵庫に3か月間保管されました。SEMの結果は、すべての脱水NPの形態が3か月の保管中に大きな変化がなかったことを示し（図4）、水で再構成した後、すべてのNPはEEがわずかに減少し、3か月の保管期間中に少量（約5％）のインスリンを放出しました（表2）。ただし、すべてのナノ粒子の平均粒子サイズは増加しました。マンニトールなしで噴霧乾燥したNPの粒子サイズは525 nmに増加しましたが、マンニトールを含む噴霧乾燥および凍結乾燥NPの粒子サイズはそれぞれ872 nmと921 nmに増加しました（表2）。
3 か月間保存したさまざまな脱水インスリン NP の形態：（a）マンニトールを含む凍結乾燥インスリン NP の SEM 画像、（b）マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリンナノ粒子の SEM 画像、（c）マンニトールを含まない噴霧乾燥インスリン NP の SEM 画像。
さらに、マンニトールで噴霧乾燥し凍結乾燥した再構成インスリンナノ粒子に沈殿物が見られました (図 S2)。これは、大きな粒子が水中に適切に懸濁していないことが原因である可能性があります。上記の結果はすべて、噴霧乾燥技術によりインスリンナノ粒子を脱水から保護でき、充填剤や凍結保護剤を使用せずにインスリンナノ粒子を高充填できることを示しています。
脱水後の酵素消化に対するNPの保護能力を実証するために、ペプシン、トリプシン、およびα-キモトリプシンを含むpH = 2.5培地でインスリン保持をテストしました。脱水NPのインスリン保持を新鮮に調製したNPのインスリン保持と比較し、遊離インスリンをネガティブコントロールとして使用しました。この研究では、遊離インスリンは3つの酵素処理すべてで4時間以内に急速なインスリン排出を示しました（図5a〜c）。対照的に、マンニトールで凍結乾燥したNPと、マンニトールの有無で噴霧乾燥したNPのインスリン排出テストでは、これらのNPが酵素消化に対して有意に高い保護を示し、新鮮に調製されたインスリンNPの保護と同様でした（図1）。5a-c）。ペプシン、トリプシン、およびα-キモトリプシンのナノ粒子の助けを借りて、50％、60％、および75％以上のインスリンを4時間以内に保護することができました。それぞれ h です (図 5a – c)。このインスリン保護能力により、血流へのインスリン吸収が高まる可能性が高くなります25。これらの結果は、マンニトールの有無にかかわらずスプレー乾燥とマンニトールを使用した凍結乾燥により、脱水後の NP のインスリン保護能力が維持できることを示唆しています。
脱水インスリン NP の保護および放出挙動: (a) ペプシン溶液中のインスリンの保護。(b) トリプシン溶液中のインスリンの保護。(c) α-キモトリプシン溶液によるインスリンの保護。(d) pH = 2.5 溶液中の脱水 NP の放出挙動。(e) pH = 6.6 溶液中の脱水 NP の放出挙動。(f) pH = 7.0 溶液中の脱水 NP の放出挙動。
新しく調製および再構成された乾燥インスリンNPを、胃、十二指腸、上部小腸のpH環境をシミュレートするさまざまな緩衝液（pH = 2.5、6.6、7.0）で37°Cでインキュベートし、インスリンがインスリン抵抗性に及ぼす影響を調べました。異なる環境での放出挙動。消化管の断片。pH = 2.5 では、インスリン負荷 NP および再溶解した乾燥インスリン NP は、最初の 1 時間以内に最初のバースト放出を示し、次の 5 時間にわたってゆっくりと放出されました (図 5d)。最初の急速な放出は、粒子の内部構造に完全に固定化されていないタンパク質分子の急速な表面脱着の結果である可能性が最も高いです。pH = 6.5 では、試験溶液の pH が NP で調製した溶液の pH と類似していたため、インスリン負荷 NP および再構成した乾燥インスリン NP は 6 時間にわたってスムーズかつゆっくりとした放出を示しました (図 5e)。pH = 7 では、NP は不安定で、最初の 2 時間以内にほぼ完全に分解しました (図 5f)。
さらに、マンニトールなしで噴霧乾燥したインスリンNPは、他の脱水NPよりも速い放出プロファイルを示しました（図5d〜f）。前述のように、マンニトールなしで乾燥させた再構成インスリンNPは、最も小さい粒子サイズを示しました。粒子が小さいと表面積が大きくなるため、関連する薬剤の大部分が粒子表面またはその近くにあることになり、結果として薬剤が急速に放出されます26。
NP の細胞毒性は MTT アッセイによって調査されました。図 S4 に示すように、すべての脱水 NP は 50～500 μg/ml の濃度で細胞生存率に有意な影響を与えないことが判明しており、すべての脱水 NP は治療域に到達するために安全に使用できることが示唆されています。
肝臓は、インスリンが生理的機能を発揮する主要な臓器です。HepG2細胞は、in vitro肝細胞取り込みモデルとして一般的に使用されるヒト肝癌細胞株です。ここでは、凍結乾燥法およびスプレー乾燥法を使用して脱水したNPの細胞取り込みを評価するためにHepG2細胞を使用しました。25μg/mLの濃度の遊離FITCインスリン、調製したばかりのFITCインスリン負荷NP、および等量のインスリン濃度の乾燥FITCインスリン負荷NPとともに数時間インキュベートした後、フローサイトメトリーと視覚を使用した共焦点レーザースキャンによって細胞取り込みを測定しました。定量顕微鏡（CLSM）観察を実施しました。マンニトールを含まない凍結​​乾燥NPは脱水中に破壊されたため、このテストでは評価しませんでした。調製したばかりのインスリン負荷NP、マンニトールを含む凍結乾燥NP、およびマンニトールを含むおよび含まないスプレー乾燥NPの細胞内蛍光強度は、 (図 6a) はそれぞれ遊離インスリンの 4.3、2.6、2.4、4.1 倍でした。FITC インスリン グループ (図 6b)。これらの結果は、主に本研究で生成されたインスリン搭載ナノ粒子のサイズが小さいため、カプセル化されたインスリンは遊離インスリンよりも細胞への取り込みがより強力であることを示唆しています。
新しく調製した NP および脱水した NP を 4 時間インキュベートした後の HepG2 細胞の取り込み: (a) HepG2 細胞による FITC インスリンの取り込みの分布。(b) フローサイトメトリーで分析した蛍光強度の幾何平均 (n = 3)、*遊離インスリンと比較した P < 0.05。
同様に、CLSM 画像は、新しく調製した FITC インスリン負荷 NP および FITC インスリン負荷スプレー乾燥 NP (マンニトールなし) の FITC 蛍光強度が、他のサンプルのものよりもはるかに強いことを示しました (図 6a)。さらに、マンニトールを添加すると、溶液の粘度が高くなったことで細胞取り込みに対する抵抗が増加し、インスリン増殖が減少しました。これらの結果は、マンニトールを含まないスプレー乾燥 NP は、再溶解後に粒子サイズが凍結乾燥 NP よりも小さいため、最高の細胞取り込み効率を示したことを示唆しています。
キトサン（平均分子量 100 KDa、75～85% 脱アセチル化）は、Sigma-Aldrich（カナダ、オンタリオ州オークビル）から購入しました。トリポリリン酸ナトリウム（TPP）は、VWR（米国、ペンシルバニア州ラドナー）から購入しました。本研究で使用した組み換えヒトインスリンは、Fisher Scientific（米国、マサチューセッツ州ウォルサム）から入手しました。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識ヒトインスリンおよび 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）は、Sigma-Aldrich（カナダ、オンタリオ州オークビル）から購入しました。HepG2 細胞株は、ATCC（米国、バージニア州マナサス）から入手しました。その他の試薬はすべて分析グレードまたはクロマトグラフィーグレードでした。
0.1%酢酸を含む再蒸留水（DD水）に溶解して1mg/mlのCS溶液を調製します。TPPとインスリンの1mg/ml溶液は、それぞれDD水と0.1%酢酸に溶解して調製します。プレエマルジョンは、ポリトロンPCU-2-110高速ホモジナイザー（Brinkmann Ind. Westbury、NY、USA）を使用して調製しました。調製プロセスは次のとおりです。まず、TPP溶液2mlをインスリン溶液4mlに加え、混合物を30分間撹拌して完全に混合します。次に、混合溶液をシリンジで高速撹拌（10,000rpm）しながらCS溶液に滴下します。混合物を氷浴中で高速撹拌（15,000rpm）しながら30分間保持し、特定のpHに調整して架橋インスリンNPを得ました。インスリンNPの粒子サイズを測定後、プローブ型超音波処理装置（UP 200ST、Hielscher Ultrasonics、テルトウ、ドイツ）を使用して、氷浴中でさらに30分間超音波処理しました。
インスリン NPS は、Litesizer 500 (Anton Paar、グラーツ、オーストリア) を用いて動的光散乱 (DLS) 測定により、25°C の DD 水で希釈して Z 平均径、多分散指数 (PDI)、ゼータ電位を検査しました。形態とサイズ分布は、Hitachi H7600 透過型電子顕微鏡 (TEM) (Hitachi、東京、日本) で特性評価し、その後、Hitachi イメージング ソフトウェア (Hitachi、東京、日本) を使用して画像を分析しました。インスリン NP のカプセル化効率 (EE) と負荷容量 (LC) を評価するために、NP を分子量カットオフ 100 kDa の限外濾過チューブにピペットで移し、500 xg で 30 分間遠心分離しました。濾液中のカプセル化されていないインスリンは、クォータナリー ポンプ、オートサンプラー、カラムヒーター、およびDAD検出器を備えたシステムで分析した。インスリンはC18カラム（Zorbax、3.5μm、4.6mm×150mm、Agilent、米国）で分析し、214nmで検出した。移動相はアセトニトリルと水（0.1%TFA含有）、グラジエント比10/90～100/0で、10分間分析した。移動相は1.0ml/分の流速でポンプで送液した。カラム温度は20℃に設定した。式（1）と式（2）を使用してEEとLCのパーセンテージを計算した。
インスリン NPを最適化するために、2.0～4.0のさまざまなCS/インスリン比をテストしました。調製中に、インスリン/TPP混合物を一定に保ちながら、異なる量のCS溶液を加えました。インスリンNPは、すべての溶液（インスリン、TPP、CS）を加えた後、混合物のpHを慎重に制御することにより、4.0～6.5のpH範囲で調製されました。インスリンNPの形成を最適化するために、さまざまなpH値とCS/インスリン質量比でインスリンナノ粒子のEEと粒子サイズを評価しました。
最適化されたインスリン NP をアルミニウム容器に入れ、テープで締めた組織で覆いました。次に、ねじ止めされた容器を、トレイ乾燥機を備えた Labconco FreeZone 凍結乾燥機 (Labconco、米国ミズーリ州カンザスシティ) に入れました。24 時間のうち最初の 2 時間は温度と真空圧を -10 °C、0.350 Torr に設定し、残りの 22 時間は 0 °C、0.120 Torr に設定して、乾燥したインスリン NP を得ました。
カプセル化されたインスリンを生成するために、Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI、Flawil、スイス) を使用しました。選択された乾燥パラメータは、温度 100 °C、供給流量 3 L/分、ガス流量 4 L/分でした。
脱水前後のインスリンNPを、FTIR-ATR分光法を使用して特性評価しました。脱水ナノ粒子、遊離インスリン、キトサンを、ユニバーサルATRサンプリングアクセサリ（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を備えたSpectrum 100 FTIR分光光度計（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して分析しました。信号平均は、4000～600 cm2の周波数範囲で4 cm2の解像度で16回のスキャンから取得しました。
乾燥インスリンナノ粒子の形態は、Helios NanoLab 650集束イオンビーム走査型電子顕微鏡（FIB-SEM）（FEI社、米国オレゴン州ヒルズボロ）を用いて、凍結乾燥およびスプレー乾燥されたインスリンナノ粒子のSEM像によって評価した。主なパラメータは、電圧5 keV、電流30 mAであった。
すべての脱水インスリンNPは、dd水に再溶解されました。粒子サイズ、PDI、EE、およびLCは、前述と同じ方法を使用して再度テストされ、脱水後の品質を評価しました。無水インスリンNPの安定性は、長期保管後のNPの特性をテストすることによっても測定されました。この研究では、脱水後のすべてのNPは冷蔵庫で3か月間保管されました。3か月の保管後、NPの形態学的粒子サイズ、PDI、EE、およびLCがテストされました。
再構成した NP 5 mL を、人工胃液 (pH 1.2、1% ペプシン含有)、腸液 (pH 6.8、1% トリプシン含有)、またはキモトリプシン溶液 (100 g/mL、リン酸緩衝液、pH 7.8) を含む 45 mL に溶解し、脱水後の NP を保護するインスリンの有効性を評価しました。NP は 37°C で 100 rpm の撹拌速度でインキュベートされました。異なる時点で 500 μL の溶液を採取し、インスリン濃度を HPLC で測定しました。
調製したてのインスリンナノ粒子と脱水したインスリンナノ粒子のin vitro放出挙動を、透析バッグ法（分子量カットオフ100 kDa、Spectra Por Inc.）で試験した。調製したての乾燥ナノ粒子と再構成した乾燥ナノ粒子を、胃、十二指腸、上部小腸のpH環境をそれぞれシミュレートするために、pH 2.5、pH 6.6、pH 7.0（0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水、PBS）の液体で透析した。すべてのサンプルは、200 rpmで連続振盪しながら37°Cでインキュベートした。5 mL透析バッグの外側の液体を、0.5、1、2、3、4、6時間後に吸引し、すぐに新鮮な透析液で補充した。液体中のインスリン汚染をHPLCで分析し、遊離イオン対比からナノ粒子からのインスリン放出速度を計算した。放出されたインスリンとナノ粒子に封入された総インスリン量（式3）
ヒト肝細胞癌細胞株 HepG2 細胞を、10% ウシ胎児血清、100 IU/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシン29 を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を使用して、直径 60 mm のディッシュで培養しました。培養は 37°C、95% 相対湿度、および 5% CO2 で維持しました。取り込みアッセイでは、HepG2 細胞を 1 × 105 細胞/ml で 8 ウェル Nunc Lab-Tek チャンバースライドシステム (Thermo Fisher、NY、USA) に播種しました。細胞毒性アッセイでは、細胞を 5 × 104 細胞/ml の密度で 96 ウェルプレート (Corning、NY、USA) に播種しました。
MTT アッセイを使用して、新しく調製され乾燥したインスリン NP の細胞毒性を評価しました30。HepG2 細胞を 5 × 104 細胞/mL の密度で 96 ウェル プレートに播種し、テスト前に 7 日間培養しました。インスリン NP は培養培地でさまざまな濃度 (50 ～ 500 μg/mL) に希釈し、細胞に投与しました。24 時間のインキュベーション後、細胞を PBS で 3 回洗浄し、0.5 mg/ml MTT を含む培地でさらに 4 時間インキュベートしました。細胞毒性は、Tecan infinite M200 pro 分光光度計プレート リーダー (Tecan、Männedorf、スイス) を使用して、570 nm で黄色のテトラゾリウム MTT から紫色のフォルマザンへの酵素還元を測定することで評価しました。
NPの細胞内取り込み効率は、共焦点レーザー走査顕微鏡法とフローサイトメトリー分析によって試験した。Nunc Lab-Tekチャンバースライドシステムの各ウェルを、遊離FITCインスリン、FITCインスリン負荷NP、および同じ濃度で再構成した25μg/mLの脱水FITCインスリンNPで処理し、4時間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定した。核は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した。インスリンの局在は、オリンパスFV1000レーザー走査/二光子共焦点顕微鏡（オリンパス、東京都新宿区）を使用して観察した。フローサイトメトリー分析では、同じ濃度の10μg/mLの遊離FITCインスリン、FITCインスリン負荷NP、および再溶解した脱水FITCインスリンNPを、HepG2細胞を播種した96ウェルプレートに加え、4時間インキュベートした。4時間のインキュベーション後、細胞を取り出し、FBSで3回洗浄した。サンプルあたり5×104個の細胞をBD LSR IIフローサイトメーター（BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）で分析した。
すべての値は平均±標準偏差として表されます。すべてのグループ間の比較は、IBM SPSS Statistics 26 for Mac（IBM、米国ニューヨーク州エンドコット）による一元配置分散分析またはt検定を使用して評価され、p < 0.05が統計的に有意であると見なされました。
この研究は、充填剤や凍結保護剤を使用した標準的な凍結乾燥法と比較して、再構成性に優れたスプレー乾燥の柔軟性と能力を実証し、高い負荷容量を実現しています。最適化されたインスリンナノ粒子は、平均粒子サイズ318 nm、カプセル化効率99.4%でした。脱水後のSEMおよびFTIRの結果から、マンニトールの有無にかかわらずスプレー乾燥したNPとマンニトールを加えて凍結乾燥したNPでのみ球状構造が維持されましたが、マンニトールなしで凍結乾燥したNPは脱水中に分解されました。再構成能力テストでは、マンニトールなしでスプレー乾燥したインスリンナノ粒子が、再構成時に最も小さい平均粒子サイズと最高の負荷を示しました。これらすべての脱水NPの放出挙動は、pH = 2.5およびpH = 7の溶液で急速に放出され、pH = 6.5.他の再溶解脱水NPと比較して、マンニトールなしで噴霧乾燥したNPは最も速い放出を示した。この結果は、細胞取り込みアッセイで観察されたものと一致しており、マンニトールの非存在下で噴霧乾燥したNPは、新鮮に調製されたNPの細胞取り込み効率をほぼ完全に維持した。これらの結果は、マンニトールを含まない噴霧乾燥によって調製された乾燥インスリンナノ粒子が、経口錠剤や生体接着フィルムなどの他の無水剤形へのさらなる加工に最も適していることを示唆している。
知的財産の問題に​​より、本研究中に生成および/または分析されたデータセットは公開されていませんが、それぞれの著者から合理的な要求に応じて入手できます。
Kagan, A. 2 型糖尿病: 社会的および科学的起源、医学的合併症、患者およびその他への影響。(McFarlane、2009)
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. インスリンカプセル化の開発：経口投与は可能になったか？J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
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