この記事は「マメ科植物の病原菌や害虫に対する抵抗力の向上」という研究テーマの一部です。全5件の記事をご覧ください。
植物の壊死性真菌病の原因菌であるSclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Baryは、多段階の戦略を用いて様々な宿主植物に感染します。本研究では、他の必須アミノ酸の合成を促進する非タンパク質アミノ酸であるジアミンL-オルニチンを、Pseudomonas sclerotiorumによって引き起こされる白カビ病に対するPhaseolus vulgaris L.の分子、生理、生化学的応答を強化するための代替管理戦略として提案します。in vitro実験では、L-オルニチンが用量依存的にS. pyrenoidosaの菌糸成長を著しく阻害することが示されました。さらに、温室条件下で白カビ病の重症度を著しく軽減することができました。また、L-オルニチンは処理した植物の成長を促進し、試験したL-オルニチン濃度が処理した植物に対して植物毒性を示さないことを示しました。さらに、L-オルニチンは非酵素的抗酸化物質（総可溶性フェノール類およびフラボノイド）と酵素的抗酸化物質（カタラーゼ（CAT）、ペルオキシダーゼ（POX）、ポリフェノールオキシダーゼ（PPO））の発現を増強し、3つの抗酸化物質関連遺伝子（PvCAT1、PvSOD、PvGR）の発現を増加させた。さらに、インシリコ解析により、S. sclerotiorumゲノムに推定オキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（SsOAH）タンパク質が存在することが明らかになり、機能解析、保存ドメイン、トポロジーの観点から、Aspergillus fijiensis（AfOAH）およびPenicillium sp.（PlOAH）のオキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（SsOAH）タンパク質と非常に類似していた。興味深いことに、ジャガイモデキストロースブロス（PDB）培地にL-オルニチンを添加すると、S. sclerotiorum菌糸体におけるSsOAH遺伝子の発現が有意に減少した。同様に、L-オルニチンを外因的に投与すると、処理した植物から採取した菌糸体におけるSsOAH遺伝子の発現が有意に減少した。最後に、L-オルニチンの投与により、PDB培地および感染葉の両方におけるシュウ酸分泌が有意に減少した。結論として、L-オルニチンは、感染植物の酸化還元状態の維持と防御応答の強化に重要な役割を果たしている。本研究の結果は、白かび病を制御し、豆類生産やその他の作物への影響を軽減するための革新的で環境に優しい方法の開発に役立つ可能性がある。
壊死性真菌 Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary によって引き起こされる白カビ病は、収量を著しく減少させる壊滅的な病気であり、世界のインゲンマメ (Phaseolus vulgaris L.) 生産に深刻な脅威を与えている (Bolton et al., 2006)。Sclerotinia sclerotiorum は、600 種を超える植物に広く宿主を持ち、非特異的に宿主組織を急速に軟化させる能力を持つ、最も制御が難しい土壌伝染性真菌植物病原体の 1 つである (Liang and Rollins, 2018)。好ましくない条件下では、生活環の重要な段階を経て、土壌中で「菌核」と呼ばれる黒くて硬い種子状の構造として、または感染した植物の菌糸体や茎髄で白くてふわふわした成長物として、長期間休眠状態になる (Schwartz et al., 2005)。 S. sclerotiorumは菌核を形成する能力があり、これにより感染した圃場で長期間生存し、病気の間も存続することができる（Schwartz et al., 2005）。菌核は栄養分が豊富で、土壌中で長期間生存することができ、その後の感染の主要な接種源となる（Schwartz et al., 2005）。好ましい条件下では、菌核は発芽して空気中に胞子を放出し、花、茎、莢など、植物の地上部全体に感染する可能性がある（Schwartz et al., 2005）。
Sclerotinia sclerotiorum は、宿主植物に感染するために、菌核の発芽から症状の発現まで一連の協調的な事象を含む多段階戦略を使用します。最初に、S. sclerotiorum は子嚢盤と呼ばれるキノコ状の構造から浮遊胞子（子嚢胞子と呼ばれる）を生成し、それが空気中に飛散して感染した植物残骸上で非運動性の菌核に発達します (Bolton et al., 2006)。次に、菌は病原性因子であるシュウ酸を分泌し、植物細胞壁の pH を制御し、酵素分解と組織侵入を促進し (Hegedus and Rimmer, 2005)、宿主植物の酸化バーストを抑制します。この酸性化プロセスは植物細胞壁を弱め、真菌細胞壁分解酵素（CWDE）の正常かつ効率的な働きに好ましい環境を提供し、病原体が物理的な障壁を乗り越えて宿主組織に侵入することを可能にする（Marciano et al., 1983）。侵入後、S. sclerotiorumはポリガラクツロナーゼやセルラーゼなどの多数のCWDEを分泌し、感染組織内での拡散を促進して組織壊死を引き起こす。病斑と菌糸マットの進行は、白カビ病の特徴的な症状につながる（Hegedus and Rimmer, 2005）。一方、宿主植物はパターン認識受容体（PRR）を介して病原体関連分子パターン（PAMP）を認識し、一連のシグナル伝達イベントを引き起こし、最終的に防御応答を活性化する。
数十年にわたる病害防除の努力にもかかわらず、他の商業作物と同様に、インゲンマメにおいても、病原体の抵抗性、生存力、適応性のため、適切な抵抗性遺伝資源の不足が依然として続いている。そのため、病害管理は非常に困難であり、耕種的手法、生物的防除、化学殺菌剤を組み合わせた統合的かつ多面的な戦略が必要となる（O'Sullivan et al., 2021）。白絹病の化学的防除は、殺菌剤を正しく適切な時期に散布すれば、病害の蔓延を効果的に抑制し、感染の深刻度を軽減し、収量損失を最小限に抑えることができるため、最も効果的である。しかし、殺菌剤の過剰使用や過度の依存は、S. sclerotiorumの抵抗性株の出現につながり、非標的生物、土壌の健康、水質に悪影響を及ぼす可能性がある（Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024）。そのため、環境に優しい代替手段を見つけることが最優先事項となっている。
プトレシン、スペルミジン、スペルミン、カダベリンなどのポリアミン（PA）は、土壌伝染性植物病原菌に対する有望な代替手段となり、有害な化学殺菌剤の使用を完全にまたは部分的に削減できる可能性がある（Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024）。高等植物では、PAは細胞分裂、分化、非生物的および生物的ストレスへの応答など、多くの生理学的プロセスに関与している（Killiny and Nehela, 2020）。これらは抗酸化物質として働き、活性酸素種（ROS）の除去を助け、酸化還元恒常性を維持し（Nehela and Killiny、2023）、防御関連遺伝子を誘導し（Romero et al.、2018）、さまざまな代謝経路を調節し（Nehela and Killiny、2023）、内因性植物ホルモンを調節し（Nehela and Killiny、2019）、全身獲得抵抗性（SAR）を確立し、植物と病原体の相互作用を調節します（Nehela and Killiny、2020; Asija et al.、2022; Czerwoniec、2022）。植物の防御におけるPAの具体的なメカニズムと役割は、植物種、病原体、および環境条件によって異なることに留意する価値があります。植物で最も豊富なPAは、必須ポリアミンL-オルニチンから生合成されます（Killiny and Nehela、2020）。
L-オルニチンは植物の成長と発達において複数の役割を果たします。例えば、これまでの研究では、イネ（Oryza sativa）において、オルニチンは窒素循環（Liu et al., 2018）、イネの収量、品質、香り（Lu et al., 2020）、および水分ストレス応答（Yang et al., 2000）に関与している可能性が示されています。さらに、L-オルニチンの外因性施用は、テンサイ（Beta vulgaris）の干ばつ耐性を著しく向上させ（Hussein et al., 2019）、タマネギ（Allium Cepa）（Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021）およびカシューナッツ（Anacardium occidentale）（da Rocha et al., 2012）の塩ストレスを軽減しました。L-オルニチンが非生物的ストレス防御において果たす可能性のある役割は、処理された植物におけるプロリン蓄積への関与によるものと考えられます。例えば、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ（デルタ-OAT）やプロリンデヒドロゲナーゼ（ProDH1およびProDH2）遺伝子など、プロリン代謝に関連する遺伝子は、非宿主のPseudomonas syringae株に対するNicotiana benthamianaおよびArabidopsis thalianaの防御に関与していることが以前に報告されている（Senthil-KumarおよびMysore、2012）。一方、真菌のオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）は病原体の増殖に必要である（Singhら、2020）。宿主誘導遺伝子サイレンシング（HIGS）を介してFusarium oxysporum f. sp. lycopersiciのODCを標的にすると、トマト植物のフザリウム萎凋病に対する抵抗性が著しく向上した（Singhら、2020）。しかしながら、植物病原体などの生物的ストレスに対する外因性オルニチン投与の潜在的な役割は十分に研究されていない。さらに重要なことに、オルニチンが病害抵抗性に及ぼす影響、およびそれに伴う生化学的・生理学的現象は、依然としてほとんど解明されていない。
マメ科植物におけるSclerotinia sclerotiorum感染の複雑さを理解することは、効果的な防除戦略の開発にとって重要です。本研究では、ジアミンであるL-オルニチンが、マメ科植物のSclerotinia sclerotiorum感染に対する防御機構と抵抗性を高める上で重要な役割を果たす可能性を明らかにすることを目的としました。L-オルニチンは、感染植物の防御応答を高めるだけでなく、酸化還元状態の維持にも重要な役割を果たすと仮説を立てました。L-オルニチンの潜在的な効果は、酵素的および非酵素的抗酸化防御機構の調節、ならびに真菌の病原性/毒性因子および関連タンパク質への干渉に関連していると考えられます。L-オルニチンのこの二重の機能性により、白かび病の影響を軽減し、一般的なマメ科作物のこの強力な真菌病原体に対する抵抗性を高めるための持続可能な戦略として有望な候補となります。本研究の結果は、白かび病を制御し、マメ科植物の生産への影響を軽減するための革新的で環境に優しい方法の開発に役立つ可能性があります。
本研究では、感受性の高い市販のインゲンマメ品種であるギザ3（Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3）を実験材料として使用した。健全な種子は、エジプト農業研究センター（ARC）の畑作物研究所（FCRI）の豆類研究部門から提供された。5粒の種子を、温室条件下（25 ± 2 °C、相対湿度 75 ± 1%、8 時間明期/16 時間暗期）で、S. sclerotiorum に感染した土壌を入れたプラスチックポット（内径 35 cm、深さ 50 cm）に播種した。播種後 7～10 日（DPS）に、苗を間引いて、各ポットに均一に成長し、完全に展開した葉が 3 枚の苗だけを残した。すべての鉢植え植物は、2 週間に 1 回水やりを行い、その品種に推奨される施肥量を毎月施した。
L-オルニチンジアミン（別名：（+）-（S）-2,5-ジアミノペンタン酸；Sigma-Aldrich社、ドイツ、ダルムシュタット）の500 mg/L濃度を調製するために、まず50 mgを100 mLの滅菌蒸留水に溶解した。次に、この原液を希釈し、その後の実験に使用した。簡単に説明すると、6種類のL-オルニチン濃度（12.5、25、50、75、100、および125 mg/L）を試験管内で試験した。さらに、滅菌蒸留水を陰性対照（モック）として使用し、市販の殺菌剤「Rizolex-T」50%水和剤（トクロホスメチル20% + チラム30%；KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company、エジプト、ガルビア県、カフル・エル・ザヤット）を陽性対照として使用した。市販の殺菌剤「Rizolex-T」は、5つの濃度（2、4、6、8、10 mg/L）でin vitro試験を行った。
白カビの典型的な症状（感染率：10～30％）を示すインゲンマメの茎と莢のサンプルを商業農場から採取した。感染した植物材料のほとんどは種/品種（感受性のある商業品種Giza 3）で特定できたが、特に地元の市場から入手したものは種が不明であった。採取した感染材料は、まず0.5％次亜塩素酸ナトリウム溶液で3分間表面消毒し、滅菌蒸留水で数回すすぎ、余分な水分を除去するために滅菌ろ紙で拭き取った。次に、感染した器官を中央組織（健全な組織と感染した組織の間）から細かく切り、ポテトデキストロース寒天培地（PDA）で培養し、菌核形成を促進するために25±2℃で12時間明/12時間暗のサイクルで5日間培養した。菌糸先端法も混合培養または汚染培養から真菌分離株を精製するために使用した。精製された真菌分離株は、まず培養形態学的特徴に基づいて同定され、次に顕微鏡的特徴に基づいてS. sclerotiorumであることが確認された。最後に、精製されたすべての分離株について、感受性の高いインゲンマメ品種Giza 3に対する病原性を試験し、コッホの原則を満たしていることを確認した。
さらに、最も侵襲性の高い S. sclerotiorum 分離株 (分離株 #3) は、White ら (1990) および Baturo-Ciesniewska ら (2017) によって記載された内部転写スペーサー (ITS) 配列に基づいてさらに確認されました。簡単に説明すると、分離株はポテトデキストロースブロス (PDB) で培養され、25 ± 2 °C で 5〜7 日間インキュベートされました。その後、菌糸体が収集され、ガーゼで濾過され、滅菌水で 2 回洗浄され、滅菌ろ紙で乾燥されました。ゲノム DNA は、Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka、1997; Atallah ら、2022、2024) を使用して分離されました。次に、特異的プライマーペアITS1/ITS4（TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC、予想サイズ：540 bp）（Baturo-Ciesniewska et al., 2017）を使用してITS rDNA領域を増幅した。精製したPCR産物をシーケンス解析に提出した（Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.）。ITS rDNA配列は、サンガーシーケンス法を使用して双方向にシーケンス解析した。アセンブルされたクエリ配列は、BLASTnソフトウェアを使用して、GenBankおよびNational Center for Biotechnology Information（NCBI、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）の最新データと比較した。クエリ配列は、分子進化遺伝学解析パッケージ（MEGA-11; バージョン 11）（Kumar et al., 2024）の ClustalW を使用して、NCBI GenBank の最新データから取得した他の 20 株の S. sclerotiorum 株/分離株（補足表 S1）と比較されました。進化解析は、最尤法と一般時間可逆ヌクレオチド置換モデル（Nei および Kumar、2000）を使用して実行されました。最も高い対数尤度を持つツリーが示されています。ヒューリスティック検索の初期ツリーは、近隣結合（NJ）ツリー（Kumar et al., 2024）と最大節約（MP）ツリーの間でより高い対数尤度を持つツリーを選択することによって選択されます。NJ ツリーは、一般時間可逆モデル（Nei および Kumar、2000）を使用して計算されたペアワイズ距離行列を使用して構築されました。
L-オルニチンと殺菌剤「Rizolex-T」の抗菌活性を寒天拡散法により試験管内で測定した。方法：L-オルニチン原液（500 mg/L）を適量取り、10 mlのPDA栄養培地とよく混ぜて、最終濃度がそれぞれ12.5、25、50、75、100、125 mg/Lの溶液を調製した。殺菌剤「Rizolex-T」の5つの濃度（2、4、6、8、10 mg/L）と滅菌蒸留水を対照として用いた。培地が固まった後、直径4 mmのSclerotinia sclerotiorum培養物の新鮮な菌糸塊をペトリ皿の中央に移し、菌糸が対照ペトリ皿全体を覆うまで25±2℃で培養し、その後菌の成長を記録した。式1を用いて、S. sclerotiorumの放射状成長阻害率を計算してください。
実験は2回繰り返され、各対照群/実験群につき6つの生物学的複製、各生物学的複製につき5つの鉢（1鉢あたり2株）が用いられた。実験結果の正確性、信頼性、再現性を確保するため、各生物学的複製は2回（2回の技術的複製）分析された。さらに、プロビット回帰分析を用いて、半数阻害濃度（IC50）およびIC99（Prentice、1976）を算出した。
温室条件下でのL-オルニチンの可能性を評価するために、2つの連続した鉢実験を実施した。簡単に説明すると、鉢に滅菌した粘土と砂の混合土（3:1）を入れ、新たに調製したS. sclerotiorumの培養液を接種した。まず、S. sclerotiorumの最も侵襲性の高い分離株（分離株#3）を、菌核を1つ半分に切り、PDA培地に下向きに置き、25℃で24時間連続暗所で4日間培養して菌糸の成長を促し、培養した。次に、先端から直径5mmの寒天プラグを4つ採取し、小麦と米ぬかの滅菌混合物（1:1、v/v）100gを接種し、すべてのフラスコを25±2℃で12時間明/12時間暗サイクルで5日間培養して菌核の形成を促した。土壌を加える前に、すべてのフラスコの内容物を十分に混合して均一性を確保した。次に、病原菌の濃度を一定に保つため、各鉢に100gの菌糸形成用ふすま混合物を加えた。接種した鉢に水をやり、菌の生育を促した後、7日間温室に置いた。
次に、ギザ3種の種子を各鉢に5粒ずつ播種した。L-オルニチンと殺菌剤リゾレックスTで処理した鉢では、滅菌した種子をまず、最終IC99濃度がそれぞれ約250 mg/Lと50 mg/Lとなるように、2種類の化合物の水溶液に2時間浸漬し、その後1時間風乾してから播種した。一方、種子は陰性対照として滅菌蒸留水に浸漬した。10日後、最初の水やりの前に、苗を間引き、各鉢に2本の苗だけを残した。さらに、S. sclerotiorumによる感染を確実にするため、同じ生育段階（10日）のインゲンマメの茎を滅菌メスで2か所切断し、コロニー形成した糠混合物を各傷口に約0.5 gずつ入れ、その後、高湿度で接種したすべての植物の感染と病気の進行を促した。対照植物にも同様に傷をつけ、同量（0.5g）の滅菌済みで細菌が繁殖していないふすま混合物を傷口に置き、高湿度下で維持することで、病害発生の環境をシミュレートし、処理群間の一貫性を確保した。
処理方法：インゲンマメの苗に、L-オルニチン（250 mg/l）または殺菌剤リゾレックス-T（50 mg/l）の水溶液500 mlを土壌灌漑により与え、その後、10日間隔で3回処理を繰り返した。プラセボ処理対照群には、滅菌蒸留水500 mlを与えた。すべての処理は温室条件下（25 ± 2℃、相対湿度75 ± 1%、明期8時間/暗期16時間）で実施した。すべての鉢は2週間ごとに水やりを行い、特定の品種の推奨事項および製造元の指示に従って、バランスの取れたNPK肥料（20-20-20、硫黄3.6%、TE微量元素；Zain Seeds、エジプト）を濃度3～4 g/lで葉面散布により毎月処理した。特に明記しない限り、処理後72時間（hpt）の各生物学的複製から完全に展開した成熟葉（上から2番目と3番目の葉）を採取し、均質化してプールし、-80℃で保存して、酸化ストレス指標、脂質過酸化、酵素的および非酵素的抗酸化物質、遺伝子発現のin situ組織化学的局在化を含むが、これらに限定されないさらなる分析に用いた。
白カビ感染の強度は、接種後21日目（dpi）に毎週、PetzoldtとDicksonのスケール（1996）をTeranら（2006）が修正した1～9のスケール（補足表S2）を用いて評価した。簡単に説明すると、接種点からインゲンマメの茎と枝を調べ、節間と節に沿った病斑の進行を追跡した。次に、接種点から茎または枝の最も遠い点までの病斑の距離を測定し、病斑の位置に基づいて1～9のスコアを割り当てた。ここで、（1）は接種点付近に目に見える感染がないことを示し、（2～9）は節/節間に沿った病斑の大きさと進行が徐々に増加していることを示す（補足表S2）。白カビ感染の強度は、式2を用いてパーセンテージに変換した。
さらに、病害進行曲線下面積（AUDPC）は、式（Shaner and Finney、1977）を用いて計算され、最近では式3を用いてインゲンマメの白腐病（Chauhan et al.、2020）に適用されました。
ここで、Yi = 時刻 ti における病害の重症度、Yi+1 = 次の時刻 ti+1 における病害の重症度、ti = 最初の測定時刻 (日数)、ti+1 = 次の測定時刻 (日数)、n = 時刻または観測点の総数。植物の高さ (cm)、植物あたりの枝数、植物あたりの葉数などのインゲンマメの植物成長パラメータは、すべての生物学的複製において 21 日間、毎週記録された。
各生物学的反復において、処理後45日目（最後の処理から15日後）に葉サンプル（上から2番目と3番目に完全に展開した葉）を採取した。各生物学的反復は5つの鉢（1つの鉢に2株）で構成された。粉砕した組織約500 mgを、80%アセトンを用いて4℃の暗所で光合成色素（クロロフィルa、クロロフィルb、カロテノイド）の抽出に使用した。24時間後、サンプルを遠心分離し、上清を採取して、UV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて、(Lichtenthaler、1987)の方法に従って、3つの異なる波長（A470、A646、A663 nm）での吸光度を測定することにより、クロロフィルa、クロロフィルb、カロテノイド含有量を比色法で測定した。最後に、光合成色素の含有量は、Lichtenthaler（1987）によって記述された以下の式4～6を用いて計算された。
処理後 72 時間 (hpt) に、各生物学的複製から葉 (上から 2 番目と 3 番目に完全に展開した葉) を採取し、過酸化水素 (H2O2) とスーパーオキシドアニオン (O2•−) の組織化学的局在をその場で調べた。各生物学的複製は 5 つの鉢 (1 鉢あたり 2 株) で構成された。各生物学的複製は、方法の正確性、信頼性、再現性を確保するために、二重に分析 (2 つの技術的複製) した。H2O2 と O2•− は、それぞれ 0.1% 3,3′-ジアミノベンジジン (DAB; Sigma-Aldrich、ダルムシュタット、ドイツ) またはニトロブルーテトラゾリウム (NBT; Sigma-Aldrich、ダルムシュタット、ドイツ) を使用して、Romero-Puertas ら (2004) および Adam ら (1989) が記載した方法に若干の変更を加えて測定した。 H2O2 の組織化学的局在をその場で確認するために、弁尖を 10 mM Tris 緩衝液 (pH 7.8) 中の 0.1% DAB で真空浸透し、室温で 60 分間光に当ててインキュベートした。弁尖を 4:1 (v/v) エタノール:クロロホルム (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies、カイロ、エジプト) 中の 0.15% (v/v) TCA で漂白し、暗くなるまで光に当てた。同様に、O2•− の組織化学的局在を確認するために、弁を 0.1 w/v % HBT を含む 10 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.8) で真空浸透した。弁尖を室温で 20 分間光に当ててインキュベートし、上記と同様に漂白し、濃い青紫色の斑点が現れるまで光を当てた。結果として生じる茶色（H2O2の指標として）または青紫色（O2•−の指標として）の色の強度は、画像処理パッケージImageJのFijiバージョン（http://fiji.sc、2024年3月7日アクセス）を使用して評価されました。
マロンジアルデヒド（MDA；脂質過酸化のマーカーとして）は、DuとBramlage（1992）の方法を若干変更して測定した。各生物学的複製（上から2番目と3番目に完全に展開した葉）の葉を、処理後72時間（hpt）に採取した。各生物学的複製は5つの鉢（1つの鉢に2株）で構成された。各生物学的複製は、方法の正確性、信頼性、再現性を確保するために、2回（2つの技術的複製）で分析した。簡単に説明すると、0.5 gの粉砕した葉組織を、0.01%ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT；Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含む20%トリクロロ酢酸（TCA；MilliporeSigma、バーリントン、マサチューセッツ州、米国）でMDA抽出に使用した。上清中のMDA含有量は、UV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて532 nmと600 nmの吸光度を測定することにより比色法で決定し、nmol g−1 FWとして表した。
非酵素性および酵素性抗酸化物質の評価のため、処理後72時間（hpt）に、各生物学的複製から葉（上から2番目と3番目の完全に展開した葉）を採取した。各生物学的複製は5つの鉢（1つの鉢に2株）で構成された。各生物学的サンプルは2回（2つの技術サンプル）分析した。2枚の葉を液体窒素で粉砕し、酵素性および非酵素性抗酸化物質、総アミノ酸、プロリン含有量、遺伝子発現、およびシュウ酸塩定量に直接使用した。
総可溶性フェノール類は、Kahkonen ら (1999) が記載した方法を若干変更して、Folin-Ciocalteu 試薬 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して測定した。簡単に説明すると、約 0.1 g の均質化した葉組織を 20 ml の 80% メタノールで暗所で 24 時間抽出した後、遠心分離して上清を回収した。サンプル抽出液 0.1 ml を 0.5 ml の Folin-Ciocalteu 試薬 (10%) と混合し、30 秒間振とうして 5 分間暗所に置いた。次に、各チューブに 0.5 ml の 20% 炭酸ナトリウム溶液 (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company、カイロ、エジプト) を加え、よく混合して、室温で暗所で 1 時間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物の吸光度をUV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて765 nmで測定した。試料抽出物中の総可溶性フェノールの濃度は、没食子酸検量線（Fisher Scientific、ハンプトン、ニューハンプシャー州、米国）を用いて決定し、生重量1グラムあたりの没食子酸当量ミリグラム（mg GAE g-1 生重量）として表した。
総可溶性フラボノイド含有量は、Djeridane ら (2006) の方法を若干変更して測定した。簡単に説明すると、上記のメタノール抽出液 0.3 ml を 5% 塩化アルミニウム溶液 (AlCl3; Fisher Scientific、Hampton、NH、USA) 0.3 ml と混合し、激しく撹拌した後、室温で 5 分間インキュベートした。続いて、10% 酢酸カリウム溶液 (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies、カイロ、エジプト) 0.3 ml を加え、よく混合し、暗所で室温で 30 分間インキュベートした。インキュベート後、反応混合物の吸光度を UV-160A 分光光度計 (島津製作所、日本) を用いて 430 nm で測定した。試料抽出物中の総可溶性フラボノイドの濃度は、ルチン検量線（TCI America、ポートランド、オレゴン州、米国）を用いて測定し、生重量1グラムあたりのルチン当量ミリグラム（mg RE g-1 生重量）として表した。
インゲンマメの葉の総遊離アミノ酸含量は、横山と平松（2003）が提案し、Sunら（2006）が改良した方法に基づき、改良ニンヒドリン試薬（Thermo Scientific Chemicals、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を用いて測定した。簡単に説明すると、0.1 gの粉砕組織をpH 5.4緩衝液で抽出し、上清200 μLをニンヒドリン（2%）200 μLとピリジン（10%；Spectrum Chemical、ニュージャージー州ニューブランズウィック、米国）200 μLと反応させ、沸騰水浴中で30分間インキュベートした後、冷却し、UV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて580 nmで測定した。一方、プロリンはBates法（Batesら、1973）で測定した。プロリンは3%スルホサリチル酸（Thermo Scientific Chemicals、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）で抽出され、遠心分離後、上清0.5 mlを氷酢酸（Fisher Scientific、ニューハンプシャー州ハンプトン、米国）1 mlおよびニンヒドリン試薬と混合し、90℃で45分間インキュベートした後、冷却し、上記と同じ分光光度計を用いて520 nmで測定した。葉抽出物中の総遊離アミノ酸およびプロリンは、それぞれグリシンおよびプロリンの検量線（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス、米国）を用いて測定し、生重量1gあたりのmgとして表した。
抗酸化酵素の酵素活性を測定するために、約500 mgの均質化組織を、1 mM EDTA-Na2（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）および7.5%ポリビニルピロリドン（PVP；Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を含む3 mlの50 mM Tris緩衝液（pH 7.8）で抽出し、冷蔵（4 °C）下で10,000 × gで20分間遠心分離し、上清（粗酵素抽出物）を回収した（El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023）。カタラーゼ（CAT）は、2 mlの0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）および100 μlの269 mM H2O2溶液と反応させ、Aebi（1984）の方法を若干変更して（El-Nagar et al.、2023; Osman et al.、2023）、その酵素活性を測定した。グアヤコール依存性ペルオキシダーゼ（POX）の酵素活性は、Harrach et al.（2009）の方法を用いて測定した。 （2008）を若干修正して（El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023）ポリフェノールオキシダーゼ（PPO）の酵素活性は、2.2 mlの100 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）、100 μlのグアヤコール（TCI chemicals、ポートランド、オレゴン州、米国）、および100 μlの12 mM H2O2との反応後に測定した。この方法は（El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023）をわずかに修正したものである。アッセイは、0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.0）で新たに調製した3 mlのカテコール溶液（Thermo Scientific Chemicals、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）（0.01 M）との反応後に実施した。 CAT活性は240 nm（A240）でのH2O2の分解をモニタリングすることで測定し、POX活性は436 nm（A436）での吸光度の増加をモニタリングすることで測定し、PPO活性はUV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて3分間、30秒ごとに495 nm（A495）での吸光度の変動を記録することで測定した。
リアルタイムRT-PCRを用いて、最後の処理から72時間後のインゲンマメの葉（上から2番目と3番目に完全に展開した葉）における、ペルオキシソームカタラーゼ（PvCAT1; GenBankアクセッション番号KF033307.1）、スーパーオキシドジスムターゼ（PvSOD; GenBankアクセッション番号XM_068639556.1）、グルタチオンレダクターゼ（PvGR; GenBankアクセッション番号KY195009.1）を含む3つの抗酸化関連遺伝子の転写レベルを検出した。簡単に説明すると、製造元のプロトコルに従って、Simply P Total RNA Extraction Kit（カタログ番号BSC52S1; BioFlux、Biori Technology、中国）を使用してRNAを分離した。次に、製造元の指示に従って、TOP script™ cDNA Synthesis Kitを使用してcDNAを合成した。上記の3つの遺伝子のプライマー配列は、補足表S3に記載されている。 PvActin-3（GenBankアクセッション番号：XM_068616709.1）をハウスキーピング遺伝子として使用し、相対的な遺伝子発現は2-ΔΔCT法（Livak and Schmittgen、2001）を用いて計算した。生物的ストレス（一般的なマメ科植物と炭疽病菌Colletotrichum lindemuthianumとの不適合相互作用）および非生物的ストレス（干ばつ、塩分、低温）下でのアクチンの安定性が実証されている（Borges et al.、2012）。
我々はまず、タンパク質間BLASTツール（BLASTp 2.15.0+）（Altschul et al., 1997, 2005）を用いて、S. sclerotiorumのオキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（OAH）タンパク質のゲノムワイドなin silico解析を行った。簡単に説明すると、Aspergillus fijiensis CBS 313.89のOAH（AfOAH; taxide: 1191702; GenBankアクセッション番号 XP_040799428.1; 342アミノ酸）とPenicillium lagenaのOAH（PlOAH; taxide: 94218; GenBankアクセッション番号 XP_056833920.1; 316アミノ酸）をクエリ配列として使用し、S. sclerotiorumの相同タンパク質（taxide: 5180）をマッピングした。 BLASTpは、国立生物工学情報センター（NCBI）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）にあるGenBankで入手可能な最新のS. sclerotiorumゲノムデータに対して実行されました。
さらに、MEGA11（Tamura et al., 2021）の最尤法とJTTマトリックスベースモデル（Jones et al., 1992）を用いて、S. sclerotiorum由来の予測OAH遺伝子（SsOAH）とA. fijiensis CBS 313.89由来のAfOAHおよびP. lagena由来のPlOAHの進化解析と系統樹を推定した。系統樹は、Constraint-Based Alignment Tool（COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi）（Papadopoulos and Agarwala, 2007）を用いて、S. sclerotiorum由来のすべての予測OAH遺伝子（SsOAH）とクエリ配列のタンパク質配列の多重アライメント解析と組み合わせた。さらに、S. sclerotiorum由来のSsOAHの最も一致するアミノ酸配列を、ClustalW（http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）を用いてクエリ配列（AfOAHおよびPlOAH）（Larkin et al., 2007）とアラインメントし、ESPriptツール（バージョン3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）を用いてアラインメントの保存領域を可視化した。
さらに、S. sclerotiorum SsOAH の予測された機能的代表ドメインと保存部位は、InterPro ツール (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) を使用して対話的に異なるファミリーに分類されました (Blum et al., 2021)。最後に、予測された S. sclerotiorum SsOAH の三次元 (3D) 構造モデリングは、Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 サーバー バージョン 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) を使用して実行され、SWISS-MODEL サーバー (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) を使用して検証されました。予測された三次元構造（PDB形式）は、UCSF-Chimeraパッケージ（バージョン1.15、https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）（Pettersen et al., 2004）を使用してインタラクティブに可視化されました。
定量的リアルタイム蛍光PCRを用いて、Sclerotinia sclerotiorumの菌糸体におけるオキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（SsOAH；GenBankアクセッション番号：XM_001590428.1）の転写レベルを測定した。簡単に説明すると、S. sclerotiorumをPDBを含むフラスコに接種し、25 ± 2 °Cの振とう培養器（モデル：I2400、New Brunswick Scientific Co.、Edison、NJ、USA）で24時間、150 rpmで振とうし、24時間連続暗所で菌糸体の成長を刺激した。その後、細胞をL-オルニチンと殺菌剤Rizolex-Tで最終IC50濃度（それぞれ約40 mg/Lと3.2 mg/L）で処理し、同じ条件下でさらに24時間培養した。インキュベーション後、培養物を2500 rpmで5分間遠心分離し、上清（菌糸体）を回収して遺伝子発現解析を行った。同様に、感染後0、24、48、72、96、120時間後に、感染組織の表面に白いカビと綿状の菌糸体が形成された感染植物から菌糸体を回収した。菌糸体からRNAを抽出し、上記のようにcDNAを合成した。SsOAHのプライマー配列は補足表S3に記載されている。SsActin（GenBankアクセッション番号：XM_001589919.1）をハウスキーピング遺伝子として使用し、2-ΔΔCT法（Livak and Schmittgen、2001）を用いて相対的な遺伝子発現を算出した。
シュウ酸は、XuとZhang（2000）の方法を若干変更して、ジャガイモデキストロースブロス（PDB）および真菌病原体Sclerotinia sclerotiorumを含む植物サンプルで測定した。簡単に説明すると、S. sclerotiorum分離株をPDBを含むフラスコに接種し、菌糸の成長を促進するために、25±2℃で3～5日間、連続暗所（24時間）で150rpmの振とう培養器（モデルI2400、New Brunswick Scientific Co.、Edison、NJ、USA）で培養した。培養後、真菌培養物をまずWhatman #1ろ紙でろ過し、次に2500rpmで5分間遠心分離して残存菌糸を除去した。上清を回収し、シュウ酸の定量測定のために4℃で保存した。植物試料の調製には、約0.1gの植物組織断片を蒸留水（毎回2ml）で3回抽出した。その後、試料を2500rpmで5分間遠心分離し、上清をワットマンNo.1ろ紙で乾式ろ過して、さらなる分析のために回収した。
シュウ酸の定量分析のために、反応混合物をガラス栓付きチューブで次の順序で調製した：0.2 mlのサンプル（またはPDB培養ろ液またはシュウ酸標準溶液）、0.11 mlのブロモフェノールブルー（BPB、1 mM；Fisher Chemical、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）、0.198 mlの1 M硫酸（H2SO4；Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies、カイロ、エジプト）、および0.176 mlの100 mM二クロム酸カリウム（K2Cr2O7；TCI chemicals、ポートランド、オレゴン州、米国）を、次に蒸留水で4.8 mlに希釈し、激しく混合し、直ちに60 °Cのウォーターバスに入れた。10分後、0.5 mlの水酸化ナトリウム溶液（NaOH；0.75 M）を加えて反応を停止した。反応混合物の吸光度（A600）は、UV-160分光光度計（島津製作所、日本）を用いて600 nmで測定した。培養ろ液と植物サンプルの定量には、それぞれPDBと蒸留水をコントロールとして使用した。培養ろ液中のシュウ酸濃度は、PDB培地1ミリリットルあたりのシュウ酸マイクログラム（μg.mL−1）として、また葉抽出物中のシュウ酸濃度は、生重量1グラムあたりのシュウ酸マイクログラム（μg.g−1 FW）として、シュウ酸検量線（Thermo Fisher Scientific Chemicals、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）を用いて測定した。
本研究全体を通して、特に明記しない限り、すべての実験は完全無作為化デザイン（CRD）で設計され、処理ごとに6つの生物学的複製、生物学的複製ごとに5つの鉢（1つの鉢に2つの植物）が用いられた。生物学的複製は2回（2つの技術的複製）で分析された。技術的複製は、同じ実験の再現性を確認するために使用されたが、偽の複製を避けるために統計分析には使用されなかった。データは、分散分析（ANOVA）に続いてTukey-Kramerの正直有意差（HSD）検定（p ≤ 0.05）を用いて統計的に分析された。in vitro実験では、IC50およびIC99値はプロビットモデルを用いて計算され、95%信頼区間が計算された。
エジプトのエル・ガビヤ県にあるさまざまな大豆畑から合計4つの分離株が採取された。PDA培地では、すべての分離株がクリーム色の白い菌糸を形成し、それがすぐに綿状の白色に変わり（図1A）、その後、菌核段階でベージュまたは茶色になった。菌核は通常、密で黒色、球形または不規則な形で、長さ5.2～7.7 mm、直径3.4～5.3 mmである（図1B）。4つの分離株は、25 ± 2 °Cで10～12日間培養した後、培養培地の縁に菌核の縁状パターンを発達させたが（図1A）、プレートあたりの菌核の数は分離株間で有意に異なり（P < 0.001）、分離株3が最も多くの菌核を有していた（プレートあたり32.33 ± 1.53個の菌核、図1C）。同様に、分離株 #3 は他の分離株よりも PDB でより多くのシュウ酸を生成しました (3.33 ± 0.49 μg.mL−1、図 1D)。分離株 #3 は、植物病原性真菌 Sclerotinia sclerotiorum の典型的な形態学的および顕微鏡的特徴を示しました。たとえば、PDA 上では、分離株 #3 のコロニーは急速に成長し、クリーム色 (図 1A)、裏面はベージュまたは淡いサーモンイエローブラウンで、直径 9 cm のプレートの表面を完全に覆うのに 25 ± 2°C で 6〜7 日かかりました。上記の形態学的および顕微鏡的特徴に基づいて、分離株 #3 は Sclerotinia sclerotiorum と同定されました。
図 1. 一般的なマメ科作物から分離された S. sclerotiorum 分離株の特徴と病原性。(A) PDA 培地上の 4 つの S. sclerotiorum 分離株の菌糸成長、(B) 4 つの S. sclerotiorum 分離株の菌核、(C) 菌核の数 (プレートあたり)、(D) PDB 培地上のシュウ酸分泌 (μg.mL−1)、および (E) 温室条件下で感受性のある市販のマメ科作物 Giza 3 に対する 4 つの S. sclerotiorum 分離株の病害の重症度 (%)。値は、5 つの生物学的複製 (n = 5) の平均 ± SD を表します。異なる文字は、処理間の統計的に有意な差 (p < 0.05) を示します。(F–H) 分離株 #3 を接種してから 10 日後 (dpi) に、それぞれ地上茎と莢に典型的な白カビ症状が現れました。 （I）S. sclerotiorum分離株#3の内部転写スペーサー（ITS）領域の進化解析を最尤法を用いて行い、国立生物工学情報センター（NCBI）データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手した20の参照分離株/株と比較した。クラスタリングラインの上の数字は領域のカバー率（％）を示し、クラスタリングラインの下の数字は枝の長さを示す。
さらに、病原性を確認するために、得られた 4 つの S. sclerotiorum 分離株を、コッホの原則に合致する温室条件下で感受性のある市販のインゲンマメ品種 Giza 3 に接種した (図 1E)。得られたすべての真菌分離株は病原性があり、インゲンマメ (品種 Giza 3) に感染し、接種後 10 日 (dpi) に地上部全体 (図 1F)、特に茎 (図 1G) と莢 (図 1H) に典型的な白カビ症状を引き起こしたが、2 つの独立した実験で分離株 3 が最も攻撃的な分離株であった。分離株 3 は、インゲンマメ植物に対して最も高い病害重症度 (%) を示した (感染後 7 日、14 日、21 日でそれぞれ 24.0 ± 4.0、58.0 ± 2.0、76.7 ± 3.1、図 1F)。
最も侵襲性の高い S. sclerotiorum 分離株 #3 の同定は、内部転写スペーサー (ITS) 配列に基づいてさらに確認されました (図 1I)。分離株 #3 と 20 の参照分離株/株との系統解析では、両者の間に高い類似性 (>99%) が示されました。注目すべきは、S. sclerotiorum 分離株 #3 (533 bp) が、乾燥エンドウ種子から分離されたアメリカの S. sclerotiorum 分離株 LPM36 (GenBank アクセッション番号 MK896659.1; 540 bp) およびスミレ (Matthiola incana) の茎腐病を引き起こす中国の S. sclerotiorum 分離株 YKY211 (GenBank アクセッション番号 OR206374.1; 548 bp) と高い類似性を示し、これらはすべてデンドログラムの上部に別々にグループ化されていることです (図 1I)。この新しい配列はNCBIデータベースに登録され、「Sclerotinia sclerotiorum – 分離株YN-25」（GenBankアクセッション番号PV202792）と命名されました。分離株3が最も侵襲性の高い分離株であることが分かりました。そのため、以降のすべての実験ではこの分離株を研究対象として選択しました。
ジアミンL-オルニチン（Sigma-Aldrich、ドイツ、ダルムシュタット）の異なる濃度（12.5、25、50、75、100、125 mg/L）でのS. sclerotiorum分離株3に対する抗菌活性をin vitroで調べた。注目すべきは、L-オルニチンが抗菌効果を発揮し、用量依存的にS. sclerotiorum菌糸の放射状成長を徐々に阻害したことである（図2A、B）。試験した最高濃度（125 mg/L）では、L-オルニチンは最高の菌糸成長阻害率（99.62 ± 0.27%、図2B）を示し、これは試験した最高濃度（10 mg/L）での市販殺菌剤Rizolex-T（阻害率99.45 ± 0.39%、図2C）と同等であり、同様の有効性を示した。
図2. L-オルニチンのSclerotinia sclerotiorumに対するin vitro抗菌活性。(A) 異なる濃度のL-オルニチンのS. sclerotiorumに対する抗菌活性と市販の殺菌剤Rizolex-T (10 mg/L) との比較。(B、C) 異なる濃度のL-オルニチン (12.5、25、50、75、100、125 mg/L) またはRizolex-T (2、4、6、8、10 mg/L) で処理した後のS. sclerotiorum菌糸成長の阻害率(%)。値は5つの生物学的複製(n = 5)の平均±標準偏差を表す。異なる文字は処理間の統計的差(p < 0.05)を示す。(D、E) L-オルニチンと市販の殺菌剤Rizolex-Tのプロビットモデル回帰分析。プロビットモデルの回帰直線は実線の青線で示され、信頼区間（95%）は破線の赤線で示されています。
さらに、プロビット回帰分析を実施し、対応するプロットを表 1 および図 2D、E に示しました。簡単に言うと、L-オルニチンの許容可能な傾き値 (y = 2.92x − 4.67) および関連する有意な統計値 (Cox & Snell R2 = 0.3709、Nagelkerke R2 = 0.4998、p < 0.0001、図 2D) は、市販の殺菌剤 Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99、Cox & Snell R2 = 0.1242、Nagelkerke R2 = 0.1708、p < 0.0001) と比較して、S. sclerotiorum に対する抗真菌活性が向上していることを示しました (表 1)。
表1. L-オルニチンおよび市販殺菌剤「Rizolex-T」のS. sclerotiorumに対する半数阻害濃度（IC50）およびIC99（mg/l）の値。
全体として、L-オルニチン（250 mg/L）は、未処理のS. sclerotiorum感染植物（対照）と比較して、処理したインゲンマメ植物の白かび病の発生と重症度を大幅に減少させた（図3A）。簡単に言うと、未処理の感染対照植物の病害の重症度は徐々に増加したが（52.67 ± 1.53、83.21 ± 2.61、および92.33 ± 3.06%）、L-オルニチンは、処理後7日、14日、および21日（dpt）で、実験全体を通して病害の重症度（%）を大幅に減少させた（8.97 ± 0.15、18.00 ± 1.00、および26.36 ± 3.07）（図3A）。同様に、S. sclerotiorum に感染したインゲンマメを 250 mg/L の L-オルニチンで処理すると、病害進行曲線下面積 (AUDPC) は、未処理の対照群の 1274.33 ± 33.13 から 281.03 ± 7.95 に減少し、陽性対照である 50 mg/L リゾレックス-T 殺菌剤 (183.61 ± 7.71、図 3B) よりわずかに低い値となった。2 番目の実験でも同じ傾向が観察された。
図3. 温室条件下における、L-オルニチン外因性施用がインゲンマメの白腐病（菌核病菌Sclerotinia sclerotiorumによる）の発病に及ぼす影響。（A）250 mg/LのL-オルニチン処理後のインゲンマメ白腐病の病害進行曲線。（B）L-オルニチン処理後のインゲンマメ白腐病の病害進行曲線下面積（AUDPC）。値は5回の生物学的反復（n = 5）の平均±標準偏差を表す。異なる文字は、処理間の統計的に有意な差（p < 0.05）を示す。
250 mg/LのL-オルニチンを外から施用すると、42日後に植物の高さ（図4A）、植物あたりの枝数（図4B）、植物あたりの葉数（図4C）が徐々に増加した。市販の殺菌剤リゾレックス-T（50 mg/L）は調査したすべての栄養パラメータに最も大きな影響を与えたが、250 mg/LのL-オルニチンを外から施用すると、未処理の対照と比較して2番目に大きな影響があった（図4A～C）。一方、L-オルニチン処理は、光合成色素であるクロロフィルa（図4D）およびクロロフィルb（図4E）の含有量に有意な影響を与えなかったが、総カロテノイド含有量（0.56 ± 0.03 mg/g fr wt）は、陰性対照（0.44 ± 0.02 mg/g fr wt）および陽性対照（0.46 ± 0.02 mg/g fr wt）と比較してわずかに増加した（図4F）。これらの結果から、L-オルニチンは処理したマメ科植物に対して植物毒性を示さず、むしろ成長を促進する可能性があることが示唆される。
図4. 温室条件下でSclerotinia sclerotiorumに感染したインゲンマメの葉の成長特性と光合成色素に対する外因性L-オルニチン施用の影響。(A) 植物の高さ(cm)、(B) 1株当たりの枝数、(C) 1株当たりの葉数、(D) クロロフィルa含有量(mg g-1 fr wt)、(E) クロロフィルb含有量(mg g-1 fr wt)、(F) 総カロテノイド含有量(mg g-1 fr wt)。値は5回の生物学的反復(n = 5)の平均±標準偏差です。異なる文字は、処理間の統計的に有意な差(p < 0.05)を示します。
活性酸素種（ROS；過酸化水素[H2O2]として表される）およびフリーラジカル（スーパーオキシドアニオン[O2•−]として表される）のin situ組織化学的局在により、L-オルニチン（250 mg/L）の外因性適用により、未処理の感染植物（それぞれ173.31 ± 12.06および149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW）および市販の殺菌剤Rizolex-T 50 mg/Lで処理した植物（それぞれ170.12 ± 9.50および157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt）の蓄積と比較して、H2O2（96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW；図5A）およびO2•−（32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW；図5B）の蓄積が有意に減少したことが明らかになった。 72 時間後には、それぞれ）H2O2 と O2•− が高濃度で蓄積した（図 5A、B）。同様に、TCA ベースのマロンジアルデヒド（MDA）アッセイでは、S. sclerotiorum に感染したインゲンマメ植物の葉に、より高いレベルの MDA（113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt）が蓄積していることが示された（図 5C）。しかし、L-オルニチンを外因的に適用すると、処理した植物の MDA 含有量の減少（33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt）によって示されるように、脂質過酸化が有意に減少した。
図5. 温室条件下でS. sclerotiorumに感染したインゲンマメの葉における、感染後72時間における外因性L-オルニチン投与が酸化ストレスの主要マーカーおよび非酵素的抗酸化防御機構に及ぼす影響。 (A) 72 hpt における過酸化水素 (H2O2; nmol g−1 FW)、(B) 72 hpt におけるスーパーオキシドアニオン (O2•−; nmol g−1 FW)、(C) 72 hpt におけるマロンジアルデヒド (MDA; nmol g−1 FW)、(D) 72 hpt における総可溶性フェノール (mg GAE g−1 FW)、(E) 72 hpt における総可溶性フラボノイド (mg RE g−1 FW)、(F) 72 hpt における総遊離アミノ酸 (mg g−1 FW)、および (G) 72 hpt におけるプロリン含有量 (mg g−1 FW)。値は、5 つの生物学的複製 (n = 5) の平均 ± 標準偏差 (平均 ± SD) を表します。異なる文字は、処理間の統計的に有意な差 (p < 0.05) を示します。