この記事は「マメ科植物の病原体および害虫に対する耐性の向上」という研究テーマの一部です。全5件の記事を見る
真菌性植物壊死病菌Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Baryは、様々な宿主植物に感染するために多層的な戦略を用いています。本研究では、他の必須アミノ酸の合成を促進する非タンパク質アミノ酸であるジアミンL-オルニチンを、Pseudomonas sclerotiorumによって引き起こされる白かび病に対するPhaseolus vulgaris L.の分子的、生理学的、生化学的反応を強化するための代替管理戦略として用いることを提案しています。in vitro実験では、L-オルニチンがS. pyrenoidosaの菌糸の成長を用量依存的に著しく阻害することが示されました。さらに、温室条件下で白かび病の重症度を著しく軽減することができました。さらに、L-オルニチンは処理植物の成長を促進し、試験したL-オルニチン濃度は処理植物に対して植物毒性を示さなかったことを示しています。さらに、L-オルニチンは、非酵素抗酸化物質（総可溶性フェノール類およびフラボノイド）および酵素抗酸化物質（カタラーゼ（CAT）、ペルオキシダーゼ（POX）、ポリフェノールオキシダーゼ（PPO））の発現を増強し、3つの抗酸化関連遺伝子（PvCAT1、PvSOD、PvGR）の発現も増加させた。さらに、in silico解析により、S. sclerotiorumゲノム中に推定オキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（SsOAH）タンパク質が存在することが明らかになった。このタンパク質は、機能解析、保存ドメイン、およびトポロジーの点で、Aspergillus fijiensis（AfOAH）およびPenicillium sp.（PlOAH）のオキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（SsOAH）タンパク質と高い類似性を示した。興味深いことに、ポテトデキストロースブロス（PDB）培地にL-オルニチンを添加すると、S. sclerotiorum菌糸におけるSsOAH遺伝子の発現が有意に減少しました。同様に、L-オルニチンを外因的に投与すると、処理した植物から採取した真菌菌糸におけるSsOAH遺伝子の発現が有意に減少しました。さらに、L-オルニチンの投与は、PDB培地と感染葉の両方においてシュウ酸分泌を有意に減少させました。結論として、L-オルニチンは、感染植物の酸化還元状態の維持と防御反応の強化に重要な役割を果たしています。本研究の結果は、白かび病を防除し、豆類生産やその他の作物への影響を軽減するための革新的で環境に優しい方法の開発に役立つ可能性があります。
白かび病は、壊死性栄養菌であるSclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Baryによって引き起こされ、壊滅的な収量減少をもたらす病気で、世界中のインゲン豆（Phaseolus vulgaris L.）の生産に深刻な脅威を与えています（Bolton et al., 2006）。Sclerotinia sclerotiorumは、600種を超える植物種に広く宿主域を持ち、非特異的に宿主組織を急速に浸軟させる能力を持つことから、土壌伝染性真菌性植物病原体の中でも制御が最も難しい菌類の一つです（Liang and Rollins, 2018）。不利な条件下では、ライフサイクルの重要な段階に入り、土壌中では「菌核」と呼ばれる黒くて硬い種子のような構造物として、または感染した植物の菌糸体や茎髄中では白くてふわふわした成長物として、長期間休眠状態になります（Schwartz et al., 2005）。 S. sclerotiorum は菌核を形成する能力があり、感染した圃場で長期間生存し、病害発生中も持続します (Schwartz et al., 2005)。菌核は栄養分が豊富で、土壌中で長期間生存し、その後の感染の主な感染源となります (Schwartz et al., 2005)。好条件下では菌核が発芽し、空中胞子を産生します。この胞子は、花、茎、莢など、植物の地上部すべてに感染する可能性があります (Schwartz et al., 2005)。
Sclerotinia sclerotiorumは、菌核の発芽から症状発現までの一連の協調的なプロセスを含む多層的な戦略を用いて宿主植物に感染します。まず、S. sclerotiorumは、子嚢殻と呼ばれるキノコ状の構造物から浮遊胞子（子嚢胞子）を産生します。子嚢胞子は空気中に放出され、感染した植物の残骸上で運動性のない菌核へと成長します（Bolton et al., 2006）。その後、菌は毒性因子であるシュウ酸を分泌し、植物細胞壁のpHを制御し、酵素分解と組織侵入を促進し（Hegedus and Rimmer, 2005）、宿主植物の酸化バーストを抑制します。この酸性化プロセスは植物細胞壁を弱め、真菌細胞壁分解酵素（CWDE）の正常かつ効率的な作動に好ましい環境を作り出します。これにより、病原体は物理的障壁を乗り越えて宿主組織に侵入することが可能になります（Marciano et al., 1983）。侵入したS. sclerotiorumは、ポリガラクツロナーゼやセルラーゼなどの複数のCWDEを分泌し、感染組織への拡散を促進して組織壊死を引き起こします。病変と菌糸マットの進行は、白かび病の特徴的な症状につながります（Hegedus and Rimmer, 2005）。一方、宿主植物はパターン認識受容体（PRR）を介して病原体関連分子パターン（PAMP）を認識し、一連のシグナル伝達イベントを引き起こし、最終的に防御反応を活性化します。
数十年にわたる病害防除の取り組みにもかかわらず、病原体の耐性、生存性、適応性のために、他の商業作物と同様に、豆類においても適切な耐性遺伝資源が不足しています。したがって、病害管理は非常に困難であり、耕作慣行、生物的防除、化学殺菌剤を組み合わせた統合的かつ多面的な戦略が必要です（O'Sullivan et al., 2021）。白かび病の化学的防除は最も効果的です。なぜなら、殺菌剤は適切な時期に適切に使用すれば、病気の蔓延を効果的に抑制し、感染の重症度を軽減し、収量損失を最小限に抑えることができるからです。しかし、殺菌剤の過剰使用と過度の依存は、S. sclerotiorumの耐性株の出現につながり、非標的生物、土壌の健全性、および水質に悪影響を及ぼす可能性があります（Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024）。したがって、環境に優しい代替手段を見つけることが最優先事項となっています。
プトレッシン、スペルミジン、スペルミン、カダベリンなどのポリアミン（PA）は、土壌伝染性植物病原体に対する有望な代替薬として機能し、有害な化学殺菌剤の使用を完全にまたは部分的に削減することができます（Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024）。高等植物において、PAは細胞分裂、分化、非生物的および生物的ストレスへの応答など、多くの生理学的プロセスに関与しています（Killiny and Nehela, 2020）。それらは抗酸化物質として作用し、活性酸素種（ROS）の除去を助け、酸化還元恒常性を維持し（Nehela and Killiny, 2023）、防御関連遺伝子を誘導し（Romero et al., 2018）、様々な代謝経路を制御し（Nehela and Killiny, 2023）、内因性植物ホルモンを調節し（Nehela and Killiny, 2019）、全身獲得抵抗性（SAR）を確立し、植物と病原体の相互作用を制御します（Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022）。注目すべきは、植物防御におけるPAの具体的なメカニズムと役割は、植物種、病原体、および環境条件によって異なるということです。植物に最も多く含まれるPAは、必須ポリアミンであるL-オルニチンから生合成されます（Killiny and Nehela, 2020）。
L-オルニチンは植物の成長と発達において多様な役割を果たします。例えば、これまでの研究では、イネ（Oryza sativa）において、オルニチンは窒素循環（Liu et al., 2018）、イネの収量、品質、香り（Lu et al., 2020）、そして水ストレスへの反応（Yang et al., 2000）と関連していることが示されています。さらに、L-オルニチンの外因性施用は、テンサイ（Beta vulgaris）の干ばつ耐性を著しく向上させ（Hussein et al., 2019）、タマネギ（Allium Cepa）（Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021）およびカシューナッツ（Anacardium occidentale）の塩ストレスを軽減しました（da Rocha et al., 2012）。L-オルニチンが非生物的ストレス防御において潜在的な役割を果たす可能性は、処理された植物におけるプロリン蓄積への関与に起因する可能性があります。例えば、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ（delta-OAT）遺伝子やプロリン脱水素酵素（ProDH1およびProDH2）遺伝子といったプロリン代謝関連遺伝子は、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の非宿主Pseudomonas syringae株に対する防御に関与することが報告されている（Senthil-Kumar and Mysore, 2012）。一方、真菌のオルニチン脱炭酸酵素（ODC）は病原菌の増殖に必須である（Singh et al., 2020）。宿主誘導性遺伝子サイレンシング（HIGS）を介してFusarium oxysporum f. sp. lycopersiciのODCを標的とすることで、トマト植物のフザリウム萎凋病に対する抵抗性が大幅に向上した（Singh et al., 2020）。しかし、植物病原体などの生物的ストレスに対する外因性オルニチンの潜在的な役割については、十分な研究が進んでいません。さらに重要なのは、オルニチンが病害抵抗性やそれに関連する生化学的・生理学的現象に及ぼす影響について、ほとんど解明されていないことです。
マメ科植物におけるS. sclerotiorum感染の複雑性を理解することは、効果的な防除戦略の開発に重要です。本研究では、ジアミンであるL-オルニチンが、マメ科植物のSclerotinia sclerotiorum感染に対する防御機構と抵抗性を高める重要な因子として、その潜在的な役割を明らかにすることを目的としました。L-オルニチンは、感染植物の防御反応を強化するだけでなく、酸化還元状態の維持にも重要な役割を果たしているという仮説を提唱しています。L-オルニチンの潜在的な効果は、酵素的および非酵素的抗酸化防御機構の調節、ならびに真菌の病原性／毒性因子および関連タンパク質への阻害に関連していると考えられます。L-オルニチンのこの二重の機能により、白かび病の影響を軽減し、一般的なマメ科作物のこの強力な真菌病原体に対する抵抗性を高める持続可能な戦略の有望な候補となります。本研究の結果は、白かび病を防除し、マメ科植物生産への影響を軽減するための革新的で環境に優しい方法の開発に役立つ可能性があります。
本研究では、インゲン豆の感受性市販品種であるギザ3（Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3）を実験材料として使用しました。健全な種子は、エジプト農業研究センター（ARC）畑作物研究所（FCRI）のマメ科植物研究部門より提供されました。S. sclerotiorumに感染した土壌を満たしたプラスチックポット（内径35 cm、深さ50 cm）に、温室条件下（25 ± 2 °C、相対湿度75 ± 1%、8時間明期/16時間暗期）で5つの種子を播種しました。播種後7～10日（DPS）、均一に生育し完全に展開した葉が3枚ある苗を各ポットに2つだけ残すように苗を間引きました。すべての鉢植え植物には2週間に1回潅水し、当該品種の推奨量で毎月施肥しました。
L-オルニチンジアミン（(+)-(S)-2,5-ジアミノペンタン酸とも呼ばれる；Sigma-Aldrich社、ドイツ、ダルムシュタット）の濃度500 mg/Lを調製するために、まず50 mgを100 mLの滅菌蒸留水に溶解した。その後、この原液を希釈し、その後の実験に使用した。簡単に説明すると、L-オルニチン濃度の6系列（12.5、25、50、75、100、および125 mg/L）をin vitroで試験した。さらに、滅菌蒸留水を陰性対照（モック）として、市販の殺菌剤「Rizolex-T」50%水和剤（トクロホスメチル20% + チラム30%；KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company、Kafr El Zayat、Gharbia Province、エジプト）を陽性対照として用いた。市販の殺菌剤「Rizolex-T」は、5つの濃度（2、4、6、8、10 mg/L）でin vitro試験を行った。
白かび病の典型的な症状（感染率：10～30％）を示すインゲン豆の茎と鞘のサンプルを商業農場から収集した。感染した植物材料のほとんどは種/品種（感受性のある商業品種Giza 3）によって識別されたが、その他、特に地元の市場から入手したものは種が不明であった。収集された感染材料は、最初に0.5％次亜塩素酸ナトリウム溶液で3分間表面消毒し、次に滅菌蒸留水で数回すすぎ、余分な水分を除去するために滅菌ろ紙で拭いて乾かした。次に、感染した器官を中間組織（健全な組織と感染した組織の間）から小片に切り、ポテトデキストロース寒天培地（PDA）で培養し、菌核形成を促すため、25±2°C、12時間明期/12時間暗期で5日間インキュベートした。精製された菌株は、まず培養形態学的特徴に基づいて同定され、その後、顕微鏡的特徴に基づいてS. sclerotiorumであることが確認されました。最後に、精製された全ての分離株について、感受性インゲンマメ品種Giza 3に対する病原性試験を実施し、コッホの原則を満たしていることを確認しました。
さらに、最も侵襲性の高いS. sclerotiorum分離株（分離株#3）は、White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017によって報告された内部転写スペーサー（ITS）シークエンシングに基づいてさらに確認されました。簡単に説明すると、分離株はポテトデキストロースブロス（PDB）で培養し、25 ± 2 °Cで5～7日間インキュベートしました。その後、菌糸を採取し、チーズクロスで濾過し、滅菌水で2回洗浄した後、滅菌ろ紙で乾燥させました。ゲノムDNAは、Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit（Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024）を用いて単離しました。次に、ITS rDNA領域を特異的プライマーペアITS1/ITS4（TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC；予想サイズ：540 bp）（Baturo-Ciesniewska et al., 2017）を用いて増幅した。精製されたPCR産物は、北京奥克丁生技有限公司（Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.）にシークエンシングを依頼した。ITS rDNA配列は、サンガーシークエンシング法を用いて双方向シークエンシングされた。アセンブルされたクエリ配列は、BLASTnソフトウェアを用いて、GenBankおよび国立生物工学情報センター（NCBI、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）の最新データと比較された。クエリ配列は、分子進化遺伝学解析パッケージ (MEGA-11; バージョン 11) (Kumar et al., 2024) の ClustalW を使用して、NCBI GenBank の最新データ (補足表 S1) から取得した他の 20 の S. sclerotiorum 株/分離株と比較されました。進化解析は、最大尤度法と一般的な時間可逆性ヌクレオチド置換モデル (Nei and Kumar, 2000) を使用して実行されました。最も高い対数尤度を持つツリーが表示されています。ヒューリスティック検索の初期ツリーは、近隣結合 (NJ) ツリー (Kumar et al., 2024) と最大節約 (MP) ツリーの間でより高い対数尤度を持つツリーを選択することで選択されます。NJ ツリーは、一般的な時間可逆モデル (Nei and Kumar, 2000) を使用して計算されたペアワイズ距離マトリックスを使用して構築されました。
L-オルニチンと殺菌剤「リゾレックス-T」の抗菌活性を寒天拡散法を用いてin vitroで測定した。方法：L-オルニチン原液（500 mg/L）を適量取り、PDA栄養培地10 mlとよく混合し、最終濃度がそれぞれ12.5、25、50、75、100、125 mg/Lとなるように調製した。対照として、殺菌剤「リゾレックス-T」の5濃度（2、4、6、8、10 mg/L）と滅菌蒸留水を用いた。培地が固まった後、直径4mmのSclerotinia sclerotiorum培養菌糸体をペトリ皿の中央に移し、25±2℃で菌糸体が対照ペトリ皿全体を覆うまで培養し、その後、菌の生育を記録した。式1を用いてS. sclerotiorumの放射状成長に対する阻害率を計算する。
実験は2回繰り返し、対照群／実験群それぞれに生物学的反復を6回、生物学的反復ごとに5つのポット（1ポットあたり植物2株）を用意した。実験結果の正確性、信頼性、および再現性を確保するため、各生物学的反復は2回（技術的反復を2回）分析した。さらに、プロビット回帰分析を用いて、最大阻害濃度の半減期（IC50）およびIC99（Prentice, 1976）を算出した。
温室条件下での L-オルニチンの潜在能力を評価するために、2 つの連続したポット実験を実施した。簡単に説明すると、ポットに滅菌した粘土砂土 (3:1) を入れ、調製したばかりの S. sclerotiorum の培養液を接種した。まず、最も侵略性の高い S. sclerotiorum 分離株 (分離株 #3) の菌核 1 つを半分に切り、PDA 上に表を下にして置き、菌糸の成長を促すため 25°C の暗黒条件下で 4 日間 (24 時間) インキュベートした。次に、先端から直径 5 mm の寒天プラグを 4 つ取り、小麦と米ぬかの滅菌混合物 (1:1、v/v) 100 g を接種し、すべてのフラスコを 25 ± 2 °C、12 時間明/12 時間暗のサイクルで 5 日間インキュベートして菌核形成を促した。土壌を加える前に、すべてのフラスコの内容物を十分に混合し、均一性を確保した。その後、病原菌の濃度を一定に保つため、コロニー形成に使用したふすま混合物を各ポットに100gずつ加えた。接種したポットには、菌の生育を活性化させるために水をやり、温室内に7日間置いた。
次に、各ポットにGiza 3種の種子を5粒ずつ播種した。L-オルニチンと殺菌剤リゾレックス-Tを処理したポットについては、まず殺菌した種子を、最終IC99濃度がそれぞれ約250 mg/Lと50 mg/Lの2つの化合物の水溶液に2時間浸漬し、播種前に1時間風乾した。一方、ネガティブコントロールとして、種子は滅菌蒸留水に浸漬した。10日後、最初の灌水前に苗を間引き、各ポットに2つのきれいな苗だけを残した。さらに、S. sclerotiorumへの感染を確実にするため、同じ発育段階（10日目）のインゲン豆の茎を滅菌メスで2か所切り取り、約0.5 gのコロニー形成ふすま混合物を各傷口に入れ、その後、高湿度下に置き、接種したすべての植物で感染と病気の発症を促した。対照植物も同様に傷をつけ、等量（0.5 g）の滅菌非コロニー化ふすま混合物を傷口に置き、高湿度下に維持することで病気の発症環境をシミュレートし、処理グループ間の一貫性を確保しました。
処理方法：豆の苗に、L-オルニチン（250 mg/l）水溶液500 ml、または殺菌剤リゾレックスT（50 mg/l）を土壌に散布し、この処理を10日間隔で3回繰り返した。プラセボを投与した対照群には、滅菌蒸留水500 mlを散布した。すべての処理は、温室環境下（25 ± 2°C、相対湿度75 ± 1%、光周期：8時間明期/16時間暗期）で実施した。すべてのポットには2週間ごとに散水し、毎月、バランスのとれたNPK肥料（20-20-20、硫黄3.6%およびTE微量元素含有、Zain Seeds、エジプト）を、品種ごとの推奨事項および製造元の指示に従って、濃度3～4 g/lで葉面散布した。特に記載がない限り、完全に展開した成熟葉（上から2番目と3番目の葉）は、処理後72時間（hpt）で各生物学的反復から収集され、均質化され、プールされ、酸化ストレス指標、脂質過酸化、酵素および非酵素抗酸化物質、遺伝子発現のin situ組織化学的局在を含むがこれらに限定されないさらなる分析のために-80°Cで保存されました。
白かびの感染強度は、接種後21日目（dpi）から毎週、Teran et al.（2006）が改訂したPetzoldt and Dicksonスケール（1996）に基づく1～9のスケール（補足表S2）を使用して評価した。簡単に説明すると、豆類の茎と枝を接種点から調べ、節間および節に沿った病変の進行を追跡した。次に、接種点から茎または枝に沿った最も遠い点までの病変の距離を測定し、病変の位置に基づいて1～9のスコアを割り当てた。ここで、（1）は接種点付近に目に見える感染がないことを示し、（2～9）は病変のサイズが徐々に大きくなり、節/節間に沿って進行していることを示す（補足表S2）。次に、白かびの感染強度を式2を使用してパーセンテージに変換した。
さらに、病気の進行曲線下面積（AUDPC）は、式（Shaner and Finney、1977）を使用して計算されました。この式は、最近、インゲン豆の白腐病（Chauhan et al.、2020）に適用され、式3が使用されました。
ここで、Yi = ti時点における病害の重症度、Yi+1 = ti+1時点における病害の重症度、ti = 最初の測定時刻（日数）、ti+1 = 次の測定時刻（日数）、n = 時点または観察点の総数。すべての生物学的反復実験において、植物の高さ（cm）、植物体あたりの枝数、植物体あたりの葉数などの豆類の成長パラメータが21日間にわたり毎週記録されました。
各生物学的反復実験では、葉サンプル（上から2番目と3番目に完全に発達した葉）を処理後45日目（最後の処理から15日後）に収集した。各生物学的反復実験は5つのポット（ポットあたり2つの植物）で構成されていた。粉砕した組織約500 mgを使用し、暗所で4℃の80%アセトンを用いて光合成色素（クロロフィル a、クロロフィル b、カロテノイド）を抽出した。24時間後、サンプルを遠心分離し、上清を収集し、UV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて、（Lichtenthaler、1987）の方法に従い、3つの異なる波長（A470、A646、およびA663 nm）で吸光度を測定することにより、クロロフィル a、クロロフィル b、およびカロテノイド含有量を比色定量した。最後に、光合成色素の含有量は、Lichtenthaler（1987）によって記載された次の式4〜6を使用して計算されました。
処理後72時間（hpt）に、各生物学的反復から葉（上から2番目と3番目に完全に発達した葉）を採取し、過酸化水素（H2O2）およびスーパーオキシドアニオン（O2•−）のin situ組織化学的局在を調べた。各生物学的反復は5つのポット（1ポットあたり2つの植物）で構成されていた。各生物学的反復は、方法の正確性、信頼性、および再現性を保証するために、2回（2つの技術的反復）分析した。H2O2およびO2•−は、Romero-Puertasら（2004）およびAdamら（1989）に記載の方法に若干の改変を加えて、それぞれ0.1％ 3,3'-ジアミノベンジジン（DAB、Sigma-Aldrich、ダルムシュタット、ドイツ）またはニトロブルーテトラゾリウム（NBT、Sigma-Aldrich、ダルムシュタット、ドイツ）を使用して測定した。 H2O2のin situでの組織化学的局在を調べるため、弁尖を10 mMトリス緩衝液（pH 7.8）中の0.1% DABで真空浸潤し、室温で60分間光照射した。弁尖を4:1（v/v）エタノール：クロロホルム（Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies、カイロ、エジプト）中の0.15%（v/v）TCAで漂白し、暗色化するまで光照射した。同様に、弁を0.1 w/v % HBTを含む10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.8）で真空浸潤し、O2•−のin situでの組織化学的局在を調べた。弁尖を室温で20分間光照射した後、上記と同様に漂白し、濃い青/紫色の斑点が現れるまで光を照射した。得られた茶色（H2O2指示薬として）または青紫色（O2•−指示薬として）の強度は、画像処理パッケージImageJのFijiバージョン（http://fiji.sc; 2024年3月7日アクセス）を使用して評価されました。
マロンジアルデヒド（MDA、脂質過酸化のマーカーとして）は、DuおよびBramlage（1992）の方法に若干の改変を加えて測定した。各生物学的反復（上から2番目と3番目に完全に発達した葉）の葉は、処理後72時間（hpt）に採取した。各生物学的反復には5つのポット（1つのポットあたり2つの植物）が含まれていた。各生物学的反復は、方法の正確性、信頼性、および再現性を保証するために、2回（2つの技術的反復）分析された。簡単に説明すると、粉砕した葉組織0.5 gを用いて、0.01%ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）を含む20%トリクロロ酢酸（TCA、MilliporeSigma、米国マサチューセッツ州バーリントン）でMDAを抽出した。次に、上清中のMDA含有量を、UV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を使用して532および600 nmでの吸光度を測定することにより比色定量し、nmol g−1 FWとして表した。
非酵素性および酵素性抗酸化物質の評価のため、処理後72時間（hpt）に各生物学的反復から葉（上から2番目と3番目に完全に成長した葉）を採取した。各生物学的反復は5つのポット（1ポットあたり2株）で構成されていた。各生物学的サンプルは2つずつ分析した（テクニカルサンプル2つ）。2枚の葉を液体窒素で粉砕し、酵素性および非酵素性抗酸化物質、総アミノ酸、プロリン含量、遺伝子発現、およびシュウ酸定量の測定に直接使用した。
総可溶性フェノールは、Kahkonen et al. (1999) の方法に若干の改変を加えた Folin-Ciocalteu 試薬 (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) を用いて測定した。簡単に説明すると、約 0.1 g のホモジェナイズした葉組織を 20 ml の 80% メタノールで暗所で 24 時間抽出し、遠心分離後に上清を収集した。サンプル抽出物 0.1 ml を 0.5 ml の Folin-Ciocalteu 試薬 (10%) と混合し、30 秒間振盪した後、暗所で 5 分間放置した。次に、0.5 ml の 20% 炭酸ナトリウム溶液 (Na2CO3、Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company、エジプト、カイロ) を各チューブに加え、十分に混合して暗所で室温で 1 時間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物の吸光度をUV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて765 nmで測定した。サンプル抽出物中の総可溶性フェノール濃度は、没食子酸検量線（Fisher Scientific、米国ニューハンプシャー州ハンプトン）を用いて決定し、生重量1グラムあたりの没食子酸当量（mg GAE g-1生重量）として表した。
総可溶性フラボノイド含量は、Djeridaneら（2006）の方法に若干の改変を加えて測定した。概略は、上記メタノール抽出物0.3 mlを5%塩化アルミニウム溶液（AlCl3；Fisher Scientific、米国ニューハンプシャー州ハンプトン）0.3 mlと混合し、激しく撹拌した後、室温で5分間インキュベートした。続いて、10%酢酸カリウム溶液（Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies、エジプト、カイロ）0.3 mlを加え、よく混合した後、室温で30分間暗所でインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物の吸光度をUV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を用いて430 nmで測定した。サンプル抽出物中の総可溶性フラボノイドの濃度は、ルチン検量線（TCI America、米国オレゴン州ポートランド）を使用して測定し、新鮮重量 1 グラムあたりのルチン当量のミリグラム（mg RE g-1 新鮮重量）として表しました。
インゲン豆の葉中の遊離アミノ酸含量は、Yokoyama and Hiramatsu (2003) により提案され、Sun et al. (2006) により改良された方法に基づき、改良ニンヒドリン試薬 (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) を用いて測定した。概略は、0.1 g の粉砕組織を pH 5.4 緩衝液で抽出し、上清 200 μL を 200 μL のニンヒドリン (2%) および 200 μL のピリジン (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) と反応させ、沸騰湯浴中で 30 分間インキュベートした後、冷却し、UV-160A 分光光度計 (Shimadzu Corporation, Japan) を用いて 580 nm で測定した。一方、プロリンは Bates 法 (Bates et al., 1973) により測定した。プロリンは3%スルホサリチル酸（Thermo Scientific Chemicals、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で抽出し、遠心分離後、上清0.5 mLを氷酢酸（Fisher Scientific、米国ニューハンプシャー州ハンプトン）およびニンヒドリン試薬1 mLと混合し、90℃で45分間インキュベートした後、冷却し、上記と同じ分光光度計を用いて520 nmで測定した。葉抽出物中の遊離アミノ酸およびプロリンは、それぞれグリシンおよびプロリン検量線（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて定量し、mg/g生重量として表した。
抗酸化酵素の酵素活性を調べるために、ホモジェナイズした組織約500 mgを、1 mM EDTA-Na2（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）および7.5%ポリビニルピロリドン（PVP、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）を含む50 mMトリス緩衝液（pH 7.8）3 mlで抽出し、冷蔵（4 °C）下で10,000 × gで20分間遠心分離し、上清（粗酵素抽出物）を回収した（El-Nagar et al.、2023; Osman et al.、2023）。カタラーゼ（CAT）を2 mlの0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5；Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）および100 μlの269 mM H2O2溶液と反応させ、Aebi（1984）の方法に若干の改変を加えて酵素活性を測定した（El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023）。グアイアコール依存性ペルオキシダーゼ（POX）の酵素活性は、Harrach et al.（2009）の方法を用いて測定した。 (2008) に若干の改変を加えた方法 (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) に従い、2.2 ml の 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.0)、100 μl のグアイアコール (TCI chemicals、Portland、OR、USA)、および 100 μl の 12 mM H2O2 との反応後にポリフェノールオキシダーゼ (PPO) の酵素活性を測定した。この方法は (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) から若干改変したものである。このアッセイは、0.1 M リン酸緩衝液 (pH 6.0) で新たに調製した 3 ml のカテコール溶液 (Thermo Scientific Chemicals、Waltham、MA、USA) (0.01 M) との反応後に実施した。 CAT活性は240 nm（A240）でのH2O2の分解をモニタリングすることで測定し、POX活性は436 nm（A436）での吸光度の増加をモニタリングすることで測定し、PPO活性はUV-160A分光光度計（島津製作所、日本）を使用して3分間、30秒ごとに495 nm（A495）での吸光度の変動を記録することで測定した。
リアルタイムRT-PCRを用いて、最終処理から72時間後の豆の葉（上から2番目と3番目の完全に発達した葉）における、ペルオキシソームカタラーゼ（PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1）、スーパーオキシドジスムターゼ（PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1）、およびグルタチオン還元酵素（PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1）を含む3つの抗酸化関連遺伝子の転写産物レベルを検出した。簡単に説明すると、Simply P Total RNA Extraction Kit（Cat. No. BSC52S1; BioFlux、Biori Technology、中国）を用いて製造元のプロトコルに従いRNAを単離した。次に、TOP script™ cDNA Synthesis Kitを用いて製造元の指示に従いcDNAを合成した。上記3つの遺伝子のプライマー配列は補足表S3に記載されている。 PvActin-3（GenBankアクセッション番号：XM_068616709.1）をハウスキーピング遺伝子として用い、2-ΔΔCT法を用いて相対遺伝子発現量を算出した（Livak and Schmittgen, 2001）。生物的ストレス（一般的なマメ科植物と炭疽病菌Colletotrichum lindemuthianumとの不和合性相互作用）および非生物的ストレス（干ばつ、塩分、低温）下におけるアクチンの安定性が実証された（Borges et al., 2012）。
我々はまず、タンパク質-タンパク質BLASTツール（BLASTp 2.15.0+）（Altschul et al., 1997, 2005）を用いて、S. sclerotiorumのオキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（OAH）タンパク質のゲノムワイドなin silico解析を行った。簡単に説明すると、Aspergillus fijiensis CBS 313.89由来のOAH（AfOAH; タキサイド番号：1191702; GenBankアクセッション番号 XP_040799428.1; アミノ酸342個）およびPenicillium lagena由来のOAH（PlOAH; タキサイド番号：94218; GenBankアクセッション番号 XP_056833920.1; アミノ酸316個）をクエリ配列として用い、S. sclerotiorum（タキサイド番号：5180）の相同タンパク質をマッピングした。 BLASTp は、国立生物工学情報センター (NCBI) の Web サイト (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) の GenBank で最近入手可能な S. sclerotiorum ゲノム データに対して実行されました。
さらに、S. sclerotiorum由来の予測OAH遺伝子（SsOAH）と、A. fijiensis CBS 313.89由来のAfOAHおよびP. lagena由来のPlOAHの進化解析および系統樹が、MEGA11（Tamura et al., 2021）の最大尤度法とJTTマトリックスベースモデル（Jones et al., 1992）を用いて推定された。系統樹は、S. sclerotiorum由来のすべての予測OAH遺伝子（SsOAH）とクエリ配列のタンパク質配列の多重アライメント解析と、制約ベースアライメントツール（COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi）（Papadopoulos and Agarwala, 2007）を用いて統合された。さらに、S. sclerotiorum 由来の SsOAH の最も一致するアミノ酸配列を、ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) を使用してクエリ配列 (AfOAH および PlOAH) (Larkin et al., 2007) とアラインメントし、アラインメント内の保存領域を ESPript ツール (バージョン 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) を使用して視覚化しました。
さらに、S. sclerotiorum SsOAHの予測された機能的代表ドメインと保存部位は、InterProツール (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) を用いてインタラクティブに異なるファミリーに分類されました。最後に、予測されたS. sclerotiorum SsOAHの3次元 (3D) 構造モデリングは、Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) を用いて行われ、SWISS-MODELサーバー (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) を用いて検証されました。予測された3次元構造（PDB形式）は、UCSF-Chimeraパッケージ（バージョン1.15、https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）（Pettersenら、2004）を使用してインタラクティブに視覚化されました。
定量的リアルタイム蛍光PCRを用いて、Sclerotinia sclerotiorum（スクレロチニア・スクレロティオルム）菌糸中のオキサロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（SsOAH、GenBankアクセッション番号：XM_001590428.1）の転写レベルを測定した。PDBを含むフラスコにS. sclerotiorumを接種し、振盪培養器（モデル：I2400、New Brunswick Scientific Co.、米国ニュージャージー州エジソン）に25±2℃、150rpmで24時間、暗黒下で培養することで菌糸の成長を促進した。その後、細胞を最終IC50濃度（それぞれ約40 mg/Lおよび3.2 mg/L）のL-オルニチンおよび殺菌剤Rizolex-Tで処理し、さらに同条件下で24時間培養した。培養後、培養液を2500 rpmで5分間遠心分離し、上清（菌糸体）を採取して遺伝子発現解析を行った。同様に、感染組織の表面に白カビと綿状菌糸体を形成した感染植物から、感染後0、24、48、72、96、120時間後に菌糸体を採取した。菌糸体からRNAを抽出し、上記のようにcDNAを合成した。SsOAHのプライマー配列は補足表S3に示す。ハウスキーピング遺伝子としてSsActin（GenBankアクセッション番号：XM_001589919.1）を使用し、相対遺伝子発現は2-ΔΔCT法（Livak and Schmittgen, 2001）を用いて算出した。
シュウ酸は、XuおよびZhang（2000）の方法に若干の改変を加えて、ジャガイモデキストロースブロス（PDB）および真菌病原体Sclerotinia sclerotiorumを含む植物サンプルで測定した。簡単に説明すると、S. sclerotiorum分離株をPDBを含むフラスコに接種し、振盪培養器（モデルI2400、New Brunswick Scientific Co.、米国ニュージャージー州エジソン）で、150 rpm、25 ± 2 °Cで3～5日間、暗黒下で24時間培養して菌糸の成長を促した。培養後、真菌培養物をまずWhatman #1ろ紙でろ過し、次に2500 rpmで5分間遠心分離して残留菌糸を除去した。上清を回収し、シュウ酸のさらなる定量測定のために4°Cで保存した。植物サンプルの調製には、約0.1gの植物組織片を蒸留水（各回2ml）で3回抽出した。サンプルは2500rpmで5分間遠心分離し、上清をWhatman No.1ろ紙で乾式ろ過し、さらなる分析のために回収した。
シュウ酸の定量分析のために、反応混合物を次の順序でガラス栓付きチューブに調製しました：0.2 mlのサンプル（またはPDB培養濾液もしくはシュウ酸標準溶液）、0.11 mlのブロモフェノールブルー（BPB、1 mM; Fisher Chemical、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国）、0.198 mlの1 M硫酸（H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies、カイロ、エジプト）、および0.176 mlの100 mM二クロム酸カリウム（K2Cr2O7; TCI chemicals、ポートランド、オレゴン州、米国）を、次に蒸留水で溶液を4.8 mlに希釈し、激しく混合して、すぐに60 °Cのウォーターバスに入れました。10分後、0.5 mlの水酸化ナトリウム溶液（NaOH; 0.75 M）を加えて反応を停止しました。反応混合物の吸光度（A600）は、UV-160分光光度計（島津製作所、日本）を用いて600 nmで測定した。培養濾液および植物サンプルの定量には、それぞれPDBおよび蒸留水を対照として用いた。培養濾液中のシュウ酸濃度はPDB培地1mlあたりのシュウ酸マイクログラム（μg.mL−1）として、また葉抽出物中のシュウ酸濃度は生体重1gあたりのシュウ酸マイクログラム（μg.g−1 FW）として、シュウ酸検量線（Thermo Fisher Scientific Chemicals、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて測定した。
研究全体を通して、特に記載がない限り、すべての実験は完全ランダム化設計（CRD）で設計され、処理ごとに6つの生物学的反復、生物学的反復ごとに5つのポット（1ポットあたり2つの植物）が使用されました。生物学的反復は2回（技術的反復2回）分析されました。技術的反復は、同一実験の再現性を確認するために使用されましたが、誤った反復を避けるため、統計解析には使用されませんでした。データは、分散分析（ANOVA）とTukey-KramerのHSD（Hybrid Significant Difference）検定（p ≤ 0.05）を用いて統計的に分析されました。in vitro実験では、IC50値とIC99値はプロビットモデルを用いて算出され、95%信頼区間が算出されました。
エジプトのエルガビヤ県の異なるダイズ畑から合計4つの分離株が収集されました。PDA培地上では、すべての分離株がクリーミーな白い菌糸を生成し、それはすぐに綿毛のような白色に変化し（図1A）、その後、菌核の段階でベージュまたは茶色になりました。菌核は通常、密で黒色で、球形または不規則な形をしており、長さは5.2～7.7 mm、直径は3.4～5.3 mmでした（図1B）。4つの分離株は、25 ± 2 °Cで10～12日間培養後、培地の端に菌核の境界パターンを形成しましたが（図1A）、プレートあたりの菌核の数は分離株間で有意に異なり（P < 0.001）、分離株3の菌核の数が最も多くなりました（プレートあたり32.33 ± 1.53個の菌核、図1C）。同様に、分離株#3はPDBにおいて他の分離株よりも多くのシュウ酸を産生した（3.33 ± 0.49 μg/mL；図1D）。分離株#3は、植物病原菌であるSclerotinia sclerotiorumの典型的な形態学的および顕微鏡的特徴を示した。例えば、PDA上では、分離株#3のコロニーは急速に成長し、乳白色（図1A）、逆ベージュ色、または淡いサーモン黄褐色を呈し、直径9cmのプレートの表面を完全に覆うのに25 ± 2°Cで6～7日を要した。上記の形態学的および顕微鏡的特徴に基づき、分離株#3はSclerotinia sclerotiorumと同定された。
図1. 一般的なマメ科作物からのS. sclerotiorum分離株の特性と病原性。(A) PDA培地における4つのS. sclerotiorum分離株の菌糸の成長、(B) 4つのS. sclerotiorum分離株の菌核、(C) 菌核の数（プレートあたり）、(D) PDB培地におけるシュウ酸分泌（μg.mL−1）、および(E) 温室条件下における感受性のある市販のマメ科栽培品種Giza 3における4つのS. sclerotiorum分離株の病害の重症度（％）。値は5回の生物学的反復（n = 5）の平均±SDを表す。異なる文字は処理間の統計的に有意な差を示す（p < 0.05）。（F–H）分離株#3の接種10日後（dpi）、地上部の茎と長角果にそれぞれ典型的な白かび症状が現れた。 (I) S. sclerotiorum分離株#3の内部転写スペーサー（ITS）領域の進化解析を最尤法を用いて行い、国立生物工学情報センター（NCBI）データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から得られた20の参照分離株／株と比較した。クラスタリングラインの上の数字は領域被覆率（%）を示し、クラスタリングラインの下の数字は枝の長さを示す。
さらに、病原性を確認するため、得られた4つのS. sclerotiorum分離株を、感受性のある市販のインゲン豆品種Giza 3に温室条件下で接種した。これはコッホの定理と一致している（図1E）。得られた菌株はすべて病原性を示し、インゲン豆（品種Giza 3）に感染し、接種後10日目（dpi）には地上部全体に典型的な白かび病の症状（図1F）、特に茎（図1G）と莢（図1H）に顕著であったが、2つの独立した実験において、分離株3が最も強い病原性を示した。分離株3は豆類植物に対する病気の重症度（％）が最も高かった（感染後7、14、21日目でそれぞれ24.0 ± 4.0、58.0 ± 2.0、76.7 ± 3.1、図1F）。
最も侵襲性の高いS. sclerotiorum分離株#3の同定は、内部転写スペーサー（ITS）配列に基づいてさらに確認されました（図1I）。分離株#3と20の参照分離株／株との間の系統解析では、両者の間に高い類似性（>99%）が示されました。注目すべきは、S. sclerotiorum分離株#3（533 bp）が、乾燥エンドウ種子から分離されたアメリカのS. sclerotiorum分離株LPM36（GenBankアクセッション番号MK896659.1; 540 bp）およびスミレ（Matthiola incana）茎腐病を引き起こす中国のS. sclerotiorum分離株YKY211（GenBankアクセッション番号OR206374.1; 548 bp）と高い類似性を示し、これらはすべて樹状図の上部に別々にグループ化されていることです（図1I）。この新規配列はNCBIデータベースに登録され、「Sclerotinia sclerotiorum – 分離株YN-25」（GenBankアクセッション番号PV202792）と命名されました。分離株3が最も侵略的な分離株であることがわかります。したがって、この分離株はその後のすべての実験の研究対象として選択されました。
ジアミン L-オルニチン (Sigma-Aldrich、ドイツ、ダルムシュタット) の異なる濃度 (12.5、25、50、75、100、125 mg/L) での S. sclerotiorum 分離株 3 に対する抗菌活性を in vitro で調査しました。L-オルニチンが抗菌効果を発揮し、用量依存的に S. sclerotiorum 菌糸の放射状成長を徐々に阻害したことは注目に値します (図 2A、B)。試験した最高濃度 (125 mg/L) では、L-オルニチンが最も高い菌糸成長阻害率 (99.62 ± 0.27%、図 2B) を示しました。これは、試験した最高濃度 (10 mg/L) での市販の殺菌剤 Rizolex-T (阻害率 99.45 ± 0.39%、図 2C) と同等であり、同様の有効性を示しています。
図2。Sclerotinia sclerotiorumに対するL-オルニチンのin vitro抗菌活性。（A）S. sclerotiorumに対する異なる濃度のL-オルニチンの抗菌活性と市販の殺菌剤Rizolex-T（10 mg/L）の比較。（B、C）それぞれ異なる濃度のL-オルニチン（12.5、25、50、75、100、125 mg/L）またはRizolex-T（2、4、6、8、10 mg/L）で処理した後のS. sclerotiorum菌糸の成長の阻害率（％）。値は5つの生物学的反復（n = 5）の平均±SDを表す。異なる文字は処理間の統計的差異を示す（p < 0.05）。（D、E）それぞれL-オルニチンと市販の殺菌剤Rizolex-Tのプロビットモデル回帰分析。プロビット モデルの回帰線は青い実線で表示され、信頼区間 (95%) は赤い破線で表示されます。
さらに、プロビット回帰分析を実施し、対応するプロットを表1および図2D、Eに示した。簡単に説明すると、許容可能な傾き値（y = 2.92x − 4.67）および関連する有意な統計値（Cox & Snell R2 = 0.3709、Nagelkerke R2 = 0.4998、p < 0.0001、図2D）は、L-オルニチンが市販の殺菌剤Rizolex-T（y = 1.96x − 0.99、Cox & Snell R2 = 0.1242、Nagelkerke R2 = 0.1708、p < 0.0001）と比較してS. sclerotiorumに対する抗真菌活性が優れていることを示している（表1）。
表1. L-オルニチンと市販の殺菌剤「Rizolex-T」のS. sclerotiorumに対する半数阻害濃度（IC50）とIC99（mg / l）の値。
全体として、L-オルニチン（250 mg/L）は、未処理のS. sclerotiorum感染植物（対照）と比較して、処理したインゲンマメ植物における白かび病の発生および重症度を有意に減少させた（図3A）。簡潔に言えば、未処理の感染対照植物の病害重症度は徐々に増加した（52.67 ± 1.53、83.21 ± 2.61、92.33 ± 3.06%）が、L-オルニチンは実験期間全体を通して、処理後7日目、14日目、21日目（dpt）において、病害重症度（%）をそれぞれ8.97 ± 0.15、18.00 ± 1.00、26.36 ± 3.07%減少させた（図3A）。同様に、S. sclerotiorumに感染した豆類にL-オルニチン250 mg/Lを処理したところ、病害進行曲線下面積（AUDPC）は、未処理対照群の1274.33 ± 33.13から281.03 ± 7.95に減少し、陽性対照群である50 mg/L Rizolex-T殺菌剤（183.61 ± 7.71、図3B）よりもわずかに低下した。2回目の実験でも同様の傾向が観察された。
図3. 温室条件下でSclerotinia sclerotiorumによって引き起こされるインゲンマメ白腐病の進行に対するL-オルニチンの外因性施用の影響。(A) 250 mg/L L-オルニチン処理後のインゲンマメ白腐病の発病進行曲線。(B) L-オルニチン処理後のインゲンマメ白腐病の発病進行曲線下面積（AUDPC）。値は5回の生物学的反復（n = 5）の平均±SDを表す。異なる文字は、処理間の統計的に有意な差を示す（p < 0.05）。
250 mg/L L-オルニチンの外因性施用により、42日後、植物体の高さ（図4A）、株当たりの枝数（図4B）、および株当たりの葉数（図4C）が徐々に増加しました。市販の殺菌剤リゾレックスT（50 mg/L）は、調査したすべての栄養パラメータにおいて最も大きな効果を示しましたが、250 mg/L L-オルニチンの外因性施用は、無処理対照と比較して2番目に大きな効果を示しました（図4A～C）。一方、L-オルニチン処理は光合成色素であるクロロフィルa（図4D）およびクロロフィルb（図4E）の含有量に有意な影響を与えなかったが、総カロテノイド含有量（0.56 ± 0.03 mg/g fr wt）は、陰性対照（0.44 ± 0.02 mg/g fr wt）および陽性対照（0.46 ± 0.02 mg/g fr wt、図4F）と比較してわずかに増加した。全体として、これらの結果は、L-オルニチンが処理したマメ科植物に対して植物毒性を示さず、むしろ成長を促進する可能性があることを示唆している。
図4. 温室条件下でSclerotinia sclerotiorumに感染した豆の葉の成長特性および光合成色素に対する外因性L-オルニチン施用の影響。(A) 植物の高さ（cm）、(B) 植物あたりの分枝数、(C) 植物あたりの葉数、(D) クロロフィルa含有量（mg g-1 fr wt）、(E) クロロフィルb含有量（mg g-1 fr wt）、(F) 総カロテノイド含有量（mg g-1 fr wt）。値は5回の生物学的反復（n = 5）の平均±SDである。異なる文字は、処理間の統計的に有意な差を示す（p < 0.05）。
活性酸素種（ROS; 過酸化水素 [H2O2] として表される）およびフリーラジカル（スーパーオキシドアニオン [O2•−] として表される）のin situ組織化学的局在により、L-オルニチン（250 mg/L）の外因性施用により、未処理の感染植物（それぞれ173.31 ± 12.06および149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW）および市販の殺菌剤リゾレックスT 50 mg/Lで処理した植物（それぞれ170.12 ± 9.50および157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr）と比較して、H2O2（96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; 図5A）およびO2•−（32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; 図5B）の蓄積が有意に減少したことが明らかになりました。 72時間後、それぞれ0.50 nmol/g（それぞれ0.50 nmol/g、重量比）の脂質過酸化が認められた。hpt処理下では高濃度のH2O2およびO2•−が蓄積した（図5A、B）。同様に、TCAベースのマロンジアルデヒド（MDA）アッセイでは、S. sclerotiorumに感染したマメ科植物の葉に高濃度のMDA（113.48 ± 10.02 nmol/g fr wt）が蓄積したことが示された（図5C）。しかし、L-オルニチンの外因性施用は、処理植物のMDA含量の減少（33.08 ± 4.00 nmol/g fr wt）から明らかなように、脂質過酸化を有意に減少させた。
図5. 温室条件下で感染後72時間でS. sclerotiorumに感染した豆の葉における酸化ストレスの主要マーカーと非酵素的抗酸化防御機構に対する外因性L-オルニチン施用の影響。 (A) 72 hptにおける過酸化水素（H2O2; nmol g−1 FW）、(B) 72 hptにおけるスーパーオキシドアニオン（O2•−; nmol g−1 FW）、(C) 72 hptにおけるマロンジアルデヒド（MDA; nmol g−1 FW）、(D) 72 hptにおける総可溶性フェノール（mg GAE g−1 FW）、(E) 72 hptにおける総可溶性フラボノイド（mg RE g−1 FW）、(F) 72 hptにおける総遊離アミノ酸（mg g−1 FW）、および(G) 72 hptにおけるプロリン含量（mg g−1 FW）。値は5回の生物学的反復（n = 5）の平均±標準偏差（平均±SD）を表す。異なる文字は、処理間の統計的に有意な差を示す（p < 0.05）。