さまざまな植物防御理論は、植物の特殊代謝のパターンを説明する上で重要な理論的指針を提供するが、その主要な予測はまだ検証されていない。ここでは、バイアスのないタンデム質量分析（MS/MS）分析を使用して、タバコ弱毒株のメタボロームを個々の植物から集団、近縁種まで体系的に探索し、情報フレームワーク内の化合物スペクトルに基づく多数の質量分析特徴理論を処理して、最適防御（OD）理論と移動標的（MT）理論の主要な予測を検証した。植物メタボロミクスの情報コンポーネントはOD理論と一致するが、草食動物によって引き起こされるメタボロミクスのダイナミクスに関するMT理論の主な予測とは矛盾する。ミクロからマクロ進化スケールまで、ジャスモン酸シグナルはODの主な決定因子として特定され、エチレンシグナルはMS/MS分子ネットワークによって注釈付けされた草食動物特異的応答の微調整を提供した。
多様な構造を持つ特殊代謝産物は、植物の環境適応、特に敵からの防御において主要な役割を果たしている（1）。植物に見られる特殊代謝の驚くべき多様性は、その生態学的機能の多くの側面に関する数十年にわたる詳細な研究を刺激し、植物と昆虫の相互作用の進化と生態学的発展である植物防御理論の長いリストを形成してきた。実証研究は重要な指針を提供する（2）。しかし、これらの植物防御理論は、主要な予測が同じ分析レベルにあり（3）、次の理論的発展のサイクルを進めるために実験的に検証されるという仮説演繹的推論の規範的な道筋に従っていない（4）。技術的な制約により、データ収集は特定の代謝カテゴリーに限定され、特殊代謝産物の包括的な分析が除外されるため、理論的発展に不可欠なカテゴリー間の比較が妨げられている（5）。包括的なメタボロミクスデータと、異なる植物グループ間で代謝空間の処理ワークフローを比較するための共通の通貨が不足していることが、この分野の科学的成熟を阻害している。
タンデム質量分析法（MS/MS）メタボロミクスの分野における最新の進歩により、特定のシステムクレードの種内および種間の代謝変化を包括的に特徴付けることができ、これらの複雑な混合物間の構造的類似性を計算するために計算方法と組み合わせることができます。化学の事前知識（5）。分析と計算における高度な技術の組み合わせは、代謝的多様性の生態学的および進化的理論によって行われた多くの予測の長期的検証に必要なフレームワークを提供します。シャノン（6）は、1948年の彼の画期的な論文で初めて情報理論を導入し、情報の数学的分析の基礎を築きました。これは、元の応用以外の多くの分野で使用されています。ゲノミクスでは、情報理論は配列保存情報を定量化するためにうまく適用されています（7）。トランスクリプトミクス研究では、情報理論はトランスクリプトームの全体的な変化を分析します（8）。以前の研究では、情報理論の統計的フレームワークをメタボロミクスに適用して、植物の組織レベルの代謝的専門知識を記述しました（9）。本研究では、MS/MSベースのワークフローと、共通通貨における代謝多様性を特徴とする情報理論の統計的枠組みを組み合わせ、草食動物によって誘発されるメタボロームに関する植物防御理論の主要な予測を比較する。
植物の防御に関する理論的枠組みは通常相互に包含し、2 つのカテゴリーに分けられます。1 つは、最適防御 (OD) (10)、移動標的 (MT) (11)、出現 (12) 理論など、防御機能に基づいて植物特有の代謝産物の分布を説明しようとするものです。もう 1 つは、炭素:栄養バランス仮説 (13)、成長速度仮説 (14)、成長と分化の平衡仮説 (15) など、資源利用可能性の変化が植物の成長と特殊代謝産物の蓄積にどのように影響するかを機械的に説明しようとするものです。これら 2 つの理論群は分析レベルが異なります (4)。しかし、機能レベルで防御機能に関わる 2 つの理論が、植物の構成的防御と誘導防御に関する議論を支配しています。OD 理論は、植物は必要なときにのみ高価な化学防御に投資すると仮定しています。たとえば、草食動物が攻撃したときに植物が摂取された場合、将来の攻撃の可能性に応じて、防御機能を持つ化合物が割り当てられます (10)。 MT仮説は、方向性のある代謝物変化の軸はなく、代謝物がランダムに変化することで、攻撃する草食動物の代謝の「運動目標」を妨害する可能性が生じると提唱している。言い換えれば、これら2つの理論は、草食動物の攻撃後に起こる代謝リモデリングについて正反対の予測をしている。すなわち、防御機能を持つ代謝物の一方向性蓄積（OD）と方向性のない代謝変化（MT）の関係である（11）。
OD仮説とMT仮説は、メタボロームの誘導変化だけでなく、これらの代謝産物の蓄積による生態学的および進化的影響、例えば特定の生態環境におけるこれらの代謝変化の適応コストと利益なども含んでいます（16）。両仮説とも、コストがかかる場合もかからない場合もある特殊代謝産物の防御機能を認めていますが、OD仮説とMT仮説を区別する重要な予測は、誘導される代謝変化の方向性にあります。OD理論の予測は、これまで最も多くの実験的注目を集めてきました。これらのテストには、温室や自然条件下における特定の化合物のさまざまな組織の直接的または間接的な防御機能の研究、および植物の発達段階の変化が含まれます（17-19）。しかし、これまでのところ、あらゆる生物の代謝多様性の包括的なグローバル分析のためのワークフローと統計的フレームワークが不足しているため、2つの理論間の主な違いの予測（つまり、代謝変化の方向性）はまだ検証されていません。ここでは、そのような分析を提供します。
植物特有の代謝産物の最も重要な特徴の 1 つは、単一の植物、個体群、類似種に至るまで、あらゆるレベルで構造が極めて多様であることです (20)。特殊代謝産物の量的変化の多くは個体群レベルで観察できますが、質的差異は通常、種レベルで維持されます (20)。したがって、植物の代謝的多様性は機能的多様性の主要な側面であり、特に特殊な昆虫や一般的な草食動物による侵入の可能性が異なるニッチなど、さまざまなニッチへの適応性を反映しています (21)。Fraenkel (22) による植物特有の代謝産物の存在理由に関する画期的な論文以来、さまざまな昆虫との相互作用は重要な選択圧と見なされており、これらの相互作用が進化の過程で植物の代謝経路を形成してきたと考えられています (23)。特殊代謝産物の多様性の種間差は、草食動物に対する植物の構成的および誘導的防御戦略に関連する生理的バランスを反映している可能性もあります。なぜなら、2 つの種はしばしば互いに負の相関関係にあるからです (24)。常に良好な防御を維持することは有益かもしれませんが、防御に関連するタイムリーな代謝変化は、植物が貴重な資源を他の生理的投資に配分し（19、24）、共生の必要性を回避するという明確な利点をもたらします。副次的被害（25）。さらに、昆虫草食動物によって引き起こされる特殊代謝産物のこれらの再編成は、集団内で破壊的な分布につながる可能性があり（26）、集団内で維持される可能性のあるジャスモン酸（JA）シグナルの実質的な自然変化の直接的な読み取りを反映している可能性があります。高および低JAシグナルは、草食動物に対する防御と特定の種との競争の間のトレードオフです（27）。さらに、特殊代謝産物生合成経路は進化の過程で急速に失われ、変化し、近縁種間でパッチ状の代謝分布をもたらします（28）。これらの多型は、変化する草食動物パターンに応じて急速に確立される可能性があり（29）、これは草食動物群集の変動が代謝の不均一性を促進する重要な要因であることを意味します。
ここでは、具体的に以下の問題を解決しました。(I) 草食昆虫は植物のメタボロームをどのように再構成するのか？(II) 長期防御理論の予測を検証するために定量化できる代謝可塑性の主要な情報要素は何か？(III) 攻撃者に特有の方法で植物のメタボロームを再プログラムするかどうか、もしそうであれば、特定の代謝応答を調整する上で植物ホルモンはどのような役割を果たし、どの代謝物が防御の種特異性に寄与するのか？(IV) 多くの防御理論による予測は生物組織のあらゆるレベルに拡張できるため、内部比較から種間比較まで、引き起こされる代謝応答の一貫性はどの程度か？この目的のために、特殊代謝が豊富な生態モデル植物であり、在来の草食昆虫であるチョウセンアサガオ（Ms）（非常に攻撃的で、主にナス科植物を食べる）とヨトウガ（Sl）の幼虫に対して効果的なタバコの葉のメタボロームを体系的に研究しました。ワタの葉の幼虫は、ナス科植物を宿主とし、他の属や科の植物を宿主とする一種の「属」です。MS/MSメタボロミクススペクトルを解析し、情報理論統計記述子を抽出してOD理論とMT理論を比較しました。特異性マップを作成して、主要な代謝物の正体を明らかにしました。分析は、在来のN. nasi集団と近縁のタバコ種に拡張され、植物ホルモンシグナル伝達とOD誘導の共変動をさらに分析しました。
草食タバコの葉のメタボロームの可塑性と構造に関する全体像を把握するために、以前に開発された分析および計算ワークフローを使用して、植物抽出物から高解像度のデータ非依存型MS/MSスペクトルを包括的に収集およびデコンボリューションしました（9）。この非分化法（MS/MSと呼ばれる）は、冗長でない化合物スペクトルを構築することができ、これはここで説明するすべての化合物レベルの分析に使用できます。これらのデコンボリューションされた植物代謝物はさまざまなタイプがあり、数百から数千の代謝物で構成されています（ここでは約500～1000-s/MS/MS）。ここでは、情報理論の枠組みで代謝の可塑性を考慮し、代謝頻度分布のシャノンエントロピーに基づいてメタボロームの多様性と専門性を定量化します。以前に実装した式（8）を使用して、メタボロームの多様性（Hj指標）、代謝プロファイルの特殊化（δj指標）、および単一代謝物の代謝特異性（Si指標）を定量化するために使用できる一連の指標を計算しました。さらに、相対距離可塑性指数（RDPI）を適用して、草食動物のメタボローム誘導性を定量化しました（図1A）（30）。この統計的枠組みでは、MS/MSスペクトルを基本情報単位として扱い、MS/MSの相対存在量を頻度分布マップに処理し、次にシャノンエントロピーを使用してそこからメタボロームの多様性を推定します。メタボロームの特殊化は、単一のMS/MSスペクトルの平均特異性によって測定されます。したがって、草食動物誘導後のいくつかのMS/MSクラスの存在量の増加は、スペクトル誘導性、RDPI、および特殊化、つまりδj指標の増加に変換されます。これは、より特殊化された代謝物が生成され、高いSi指標が生成されるためです。 Hj多様性指数の低下は、生成されるMS/MSの数が減少しているか、プロファイル頻度分布がより不均一な方向に変化し、全体的な不確実性が低下していることを反映しています。Si指数の計算により、特定の草食動物によって誘導されるMS/MSと、誘導に反応しないMS/MSを明確にすることができ、これはMTとODの予測を区別するための重要な指標となります。
(A) 草食動物 (H1 ～ Hx) の MS/MS データに使用される統計的記述子 - 誘導性 (RDPI)、多様性 (Hj 指数)、特異性 (δj 指数)、および代謝物特異性 (Si 指数)。特異性 (δj) の増加は、平均してより多くの草食動物特異的代謝物が生成されることを示し、多様性 (Hj) の減少は、代謝物の生成の減少または分布マップにおける代謝物の不均一な分布を示します。Si 値は、代謝物が特定の条件 (ここでは草食動物) に特異的であるか、または逆に同じレベルで維持されているかを評価します。(B) 情報理論軸を使用した防御理論予測の概念図。OD 理論は、草食動物の攻撃が防御代謝物を増加させ、それによって δj を増加させると予測します。同時に、プロファイルが代謝情報の不確実性の減少に向かって再編成されるため、Hj は減少します。 MT理論は、草食動物の攻撃がメタボロームに非方向性の変化を引き起こし、それによって代謝情報の不確実性の増加を示す指標であるHjが増加し、Siのランダムな分布を引き起こすと予測しています。また、防御値の高い代謝物の一部が特に増加する（Si値が高い）一方で、他の代謝物はランダムな反応を示す（Si値が低い）という混合モデル、つまり最適なMTも提案しました。
情報理論の記述子を用いて、OD理論を解釈すると、非誘導構成状態における草食動物誘導の特殊代謝物の変化は、(i) 代謝特異性 (Si 指数) の増加、メタボローム特異性 (δj 指数) の増加、防御値の高い特定の特殊代謝物グループの増加、および (ii) 代謝頻度分布がレプチン体分布に変化することによるメタボローム多様性 (Hj 指数) の減少につながると予測されます。単一の代謝物レベルでは、順序付けられた Si 分布が期待され、代謝物はその防御値に応じて Si 値を増加させます (図 1B)。この流れに沿って、MT 理論を説明すると、興奮は (i) δj 指数の減少につながる代謝物の非方向性の変化、および (ii) 代謝の不確実性の増加による Hj 指数の増加につながると予測されます。またはランダム性は、一般化された多様性の形でシャノン エントロピーによって定量化できます。代謝組成に関しては、MT理論はSiのランダムな分布を予測します。特定の代謝物が特定の条件下で特定の条件下にあり、他の代謝物が特定の条件下でなく、その防御値が環境に依存することを考慮して、δjとHjがSi増加の2方向に分布する混合防御モデルも提案しました。防御値が高い特定の代謝物グループのみがSiを特に増加させ、他の代謝物はランダムに分布します（図1B）。
情報理論記述子の軸上で再定義された防御理論の予測を検証するために、ネペンテス・パレンスの葉上で熟練者（Ms）または一般者（Sl）の草食幼虫を飼育した（図2A）。MS/MS分析を用いて、幼虫の摂食後に採取した葉組織のメタノール抽出物から599個の非冗長MS/MSスペクトル（データファイルS1）を取得した。RDPI、Hj、およびδjインデックスを使用してMS/MS構成ファイルの情報内容の再構成を可視化すると、興味深いパターンが明らかになった（図2B）。全体的な傾向としては、情報記述子で説明されているように、幼虫が葉を食べ続けるにつれて、すべての代謝再編成の度合いが時間とともに増加する。草食動物が摂食してから72時間後には、RDPIが有意に増加する。損傷を受けていない対照と比較して、Hjは有意に減少したが、これはδjインデックスで定量化された代謝プロファイルの特化度の増加によるものである。この明らかな傾向はOD理論の予測と一致していますが、代謝物レベルのランダムな（方向性のない）変化が防御カモフラージュとして使用されると考えるMT理論の主な予測とは一致しません（図1B）。これら2種の草食動物の口腔分泌物（OS）エリシター含有量と摂食行動は異なりますが、直接摂食した結果、24時間と72時間の収穫期間中にHjとδjの方向が同様に変化しました。唯一の違いはRDPIの72時間で発生しました。Ms摂食によって引き起こされたものと比較して、Sl摂食によって誘発された全体的な代謝は高くなりました。
(A) 実験デザイン: 一般的なブタ (S1) または熟練した草食動物 (Ms) に脱塩したウツボカズラの葉を与え、模擬草食では、Ms の OS (W + OSMs) を使用して、標準化された葉の位置の穿孔を処理します。S1 (W + OSSl) の幼虫または水 (W + W) を与えます。コントロール (C) は損傷のない葉です。(B) 特殊代謝物マップ (599 MS/MS; データファイル S1) について計算された誘導性 (コントロールチャートと比較した RDPI)、多様性 (Hj 指数)、および特異性 (δj 指数) の指数。アスタリスクは、直接草食動物給餌とコントロールグループ間の有意差を示します (対応のある t 検定を使用したスチューデントの t 検定、*P<0.05 および ***P<0.001)。ns は重要ではありません。 (C) 模擬草食処理後の主要代謝物スペクトル (青枠、アミノ酸、有機酸、糖類、データファイル S2) および特殊代謝物スペクトル (赤枠 443 MS/MS、データファイル S1) の時間分解能指数。カラーバンドは 95% 信頼区間を示します。アスタリスクは、処理とコントロール間の有意差を示します [二次分散分析 (ANOVA)、続いて事後多重比較のための Tukey の正直有意差 (HSD)、*P<0.05、**P<0.01、*** P<0.001]。 (D) 散布図と特殊代謝物プロファイルの特殊化 (異なる処理による繰り返しサンプル)。
草食動物によるメタボロームレベルでのリモデリングが個々の代謝物のレベルの変化に反映されるかどうかを調べるために、まず、草食動物抵抗性が証明されているウツボカズラの葉で以前に研究された代謝物に注目しました。フェノールアミドは、昆虫の草食過程中に蓄積するヒドロキシシンナミド-ポリアミン複合体であり、昆虫のパフォーマンスを低下させることが知られています（32）。対応するMS/MSの前駆体を検索し、それらの累積速度曲線をプロットしました（図S1）。当然のことながら、クロロゲン酸（CGA）やルチンなど、草食動物に対する防御に直接関与しないフェノール誘導体は、草食後にダウンレギュレーションされます。対照的に、草食動物はフェノールアミドを非常に強力にすることができます。2種類の草食動物の継続的な摂食により、フェノールアミドの励起スペクトルはほぼ同じになり、このパターンはフェノールアミドのde novo合成で特に顕著でした。 17-ヒドロキシゲラニルノナンジオールジテルペングリコシド（17-HGL-DTGs）経路を調べた際にも同様の現象が観察される。この経路は、効果的な抗草食動物機能を持つ多数の非環状ジテルペンを生成する（33）。そのうち、Ms Feeding with Slは同様の発現プロファイルを誘発した（図S1）。
草食動物による直接摂食実験の潜在的な欠点は、草食動物の葉の消費速度と摂食時間の違いであり、傷や草食動物によって引き起こされる草食動物特有の効果を排除することが困難である。誘導された葉の代謝反応の草食動物種特異性をより良く解決するために、新鮮なOS（OSMとOSS1）を一定の葉の位置の標準的な穿刺Wに直ちに適用することにより、MsとSlの幼虫の摂食をシミュレートした。この手順はW + OS処理と呼ばれ、草食動物によって引き起こされる反応の開始を正確にタイミングを合わせることで誘導を標準化し、組織の損失の速度や量の違いによる交絡効果を引き起こしない（図2A）（34）。MS/MS分析および計算パイプラインを使用して、直接摂食実験から以前に組み立てられたスペクトルと重複する443のMS/MSスペクトル（データファイルS1）を取得した。この MS/MS データセットの情報理論解析では、草食動物をシミュレートすることによる葉特化型メタボロームの再プログラミングが OS 特異的な誘導を示したことが示されました (図 2C)。特に、OSS1 処理と比較して、OSM は 4 時間でメタボローム特化の強化を引き起こしました。注目すべきは、直接草食動物を摂食させた実験データセットと比較して、Hj と δj を座標として 2 次元空間で可視化された代謝動態と、シミュレートされた草食動物処理に対するメタボローム特化の方向性が時間とともに一貫して増加していることです (図 2D)。同時に、このメタボローム特化の標的増加が、シミュレートされた草食動物に対する中心炭素代謝の再構成によるものかどうかを調査するために、アミノ酸、有機酸、糖の含有量を定量しました (データ ファイル S2) (図 S2)。このパターンをよりよく説明するために、我々はさらに、先に述べたフェノールアミドおよび17-HGL-DTG経路の代謝蓄積動態をモニタリングした。草食動物のOS特異的誘導は、フェノールアミド代謝内の異なる再編成パターンに変換される（図S3）。クマリンおよびカフェオイル部分を含むフェノールアミドはOSS1によって優先的に誘導されるが、OSMはフェルリル抱合体の特異的誘導を引き起こす。17-HGL-DTG経路については、下流のマロニル化およびジマロニル化生成物による異なるOS誘導が検出された（図S3）。
次に、草食動物のロゼット植物の葉をOSMで処理することをシミュレートした時間経過マイクロアレイデータセットを使用して、OS誘導トランスクリプトーム可塑性を研究しました。サンプリング速度は基本的にこのメタボロミクス研究で使用された速度と重複しています（35）。代謝可塑性が時間とともに特に増加するメタボローム再構成と比較すると、トランスクリプトーム誘導性（RDPI）と特殊化（δj）が1時間で1倍になり、この時点で多様性（Hj）が有意に増加し、BMP1の発現が有意に減少し、続いてトランスクリプトーム特殊化が緩和されたMs誘導葉で一時的な転写バーストが観察されました（図S4）。前述の初期の高特殊化モデルに従って、代謝遺伝子ファミリー（P450、グリコシルトランスフェラーゼ、BAHDアシルトランスフェラーゼなど）が一次代謝由来の構造単位から特殊代謝物を組み立てるプロセスに参加します。事例研究として、フェニルアラニン経路を解析した。解析の結果、フェノールアミド代謝の中核遺伝子は、誘引されない植物と比較して草食動物においてOS誘導が強く、発現パターンが密接に一致していることが確認された。この経路の上流にある転写因子MYB8および構造遺伝子PAL1、PAL2、C4H、4CLは、転写が早期に開始された。フェノールアミドの最終合成に関与するアシル転移酵素AT1、DH29、CV86などは、長期にわたるアップレギュレーションパターンを示した（図S4）。これらの観察結果は、トランスクリプトームの特殊化の早期開始とメタボロミクスの特殊化のその後の強化が連動したモードであり、強力な防御応答を開始する同期的な制御システムによるものである可能性を示唆している。
植物ホルモンシグナル伝達の再構成は、草食動物の情報を統合して植物の生理機能を再プログラムする調節層として機能します。草食動物のシミュレーションの後、主要な植物ホルモンカテゴリーの累積的な動態を測定し、それらの間の時間的共発現を可視化しました[ピアソン相関係数(PCC)> 0.4](図3A)。予想どおり、生合成に関連する植物ホルモンは、植物ホルモン共発現ネットワーク内でリンクされています。さらに、代謝特異性(Si指数)がこのネットワークにマッピングされ、さまざまな処理によって誘導される植物ホルモンが強調されます。草食動物特異的応答の2つの主要な領域が描かれています。1つはJAクラスターで、JA(その生物学的に活性な形態JA-Ile)と他のJA誘導体が最も高いSiスコアを示しています。もう1つはエチレン(ET)です。ジベレリンは草食動物特異性の増加が中程度であったのに対し、サイトカイニン、オーキシン、アブシジン酸などの他の植物ホルモンは草食動物に対する誘導特異性が低かった。W + W 単独使用と比較して、OS 適用による JA 誘導体のピーク値の増幅 (W + OS) は基本的に JA の強力な特異的指標に変換できる。予想外にも、エリシター含有量の異なる OSM と OSS1 は、JA と JA-Ile の同様の蓄積を引き起こすことが知られている。OSS1 とは対照的に、OSM は OSM によって特異的かつ強力に誘導されるが、OSS1 は基底傷の反応を増幅しない (図 3B)。
(A) 草食動物誘発植物ホルモン蓄積動態シミュレーションの PCC 計算に基づく共発現ネットワーク解析。ノードは単一の植物ホルモンを表し、ノードのサイズは処理間の植物ホルモンに特有の Si 指数を表します。(B) 異なる処理によって引き起こされる葉の JA、JA-Ile、および ET の蓄積を異なる色で示します: アプリコット、W + OSM; 青、W + OSSl; 黒、W + W; 灰色、C (コントロール)。アスタリスクは、処理とコントロール間の有意差を示します (2 元 ANOVA に続いて Tukey HSD 事後多重比較、*** P <0.001)。(C) JA 生合成および知覚スペクトル障害 (irAOC および irCOI1) の 697 MS/MS (データ ファイル S1) および ET シグナル障害のある ETR1 の (D) 585 MS/MS (データ ファイル S1) の情報理論解析。2 つの草食動物シミュレーション処理により、植物系統と空のビヒクル (EV) コントロール植物が誘発されました。アスタリスクは、W+OS処理と無傷の対照群との間に有意差があることを示す（二元配置分散分析後、Tukey HSD事後多重比較検定、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。(E) 特殊化に対する散在的反対の散布図。色は異なる遺伝子改変株を表し、記号は異なる処理方法を表す：三角形、W + OSS1；長方形、W + OSM；円C
次に、JAとETの生合成（irAOCとirACO）と認識（irCOI1とsETR1）の重要なステップで遺伝子操作された弱毒化ネペンテス（irCOI1とsETR1）株を使用して、草食動物に対するこれら2つの植物ホルモンの代謝を分析します。再プログラミングの相対的な寄与。以前の実験と一致して、空のキャリア（EV）植物での草食動物OSの誘導（図3、C～D）とOSMによって引き起こされるHjインデックスの全体的な減少を確認しましたが、δjインデックスは増加しました。この応答はOSS1によって引き起こされる応答よりも顕著です。Hjとδjを座標として使用する2本の線グラフは、特定の脱制御を示しています（図3E）。最も明白な傾向は、JAシグナルを欠く株では、草食動物によって引き起こされるメタボロームの多様性と特殊化の変化がほぼ完全に排除されていることです（図3C）。対照的に、sETR1植物におけるサイレントET認識は、草食動物の代謝変化に対する全体的な影響はJAシグナル伝達の影響よりもはるかに低いものの、OSMとOSS1の刺激間のHjおよびδj指数の差を弱める（図3Dおよび図S5）。これは、JAシグナル伝達の中核機能に加えて、ETシグナル伝達が草食動物の種特異的な代謝応答の微調整としても機能することを示している。この微調整機能と一致して、sETR1植物では全体的なメタボローム誘導性に変化はなかった。一方、irACO植物は、sETR1植物と比較して、草食動物によって引き起こされる代謝変化の全体的な振幅は類似していたが、OSMとOSS1の刺激間でHjおよびδjスコアに有意な差が見られた（図S5）。
草食動物の種特異的な応答に重要な貢献をする特殊代謝物を同定し、ETシグナルを介してその生成を微調整するために、以前に開発された構造MS/MS法を使用しました。この方法は、バイクラスタリング法に基づいて、MS/MSフラグメント[正規化ドット積(NDP)]と中性損失(NL)に基づく類似度スコアから代謝ファミリーを再推定します。ETトランスジェニック系統の分析によって構築されたMS/MSデータセットは585個のMS/MS(データファイルS1)を生成し、これらを7つの主要なMS/MSモジュール(M)にクラスタリングすることで解決しました(図4A)。これらのモジュールのいくつかは、以前に特徴付けられた特殊代謝物が密集しています。たとえば、M1、M2、M3、M4、M7は、さまざまなフェノール誘導体(M1)、フラボノイド配糖体(M2)、アシル糖(M3およびM4)、および17-HGL-DTG(M7)が豊富です。さらに、各モジュール内の単一代謝物の代謝特異的情報（Si指数）を計算し、そのSi分布を直感的に確認できる。要するに、草食性および遺伝子型特異性が高いMS/MSスペクトルはSi値が高く、尖度統計は右尾隅の毛の分布を示している。そのような痩せたコロイド分布の1つがM1で検出され、フェノールアミドが最も高いSi分画を示した（図4B）。前述のM7の草食誘導性17-HGL-DTGは中程度のSiスコアを示し、2つのOSタイプ間の差異調節の程度が中程度であることを示している。対照的に、ルチン、CGA、アシル糖などのほとんどの構成的に産生される特殊代謝物は、最も低いSiスコアの中に含まれていた。特殊代謝物間の構造的複雑性とSi分布をよりよく探るために、各モジュールの分子ネットワークが構築された（図4B）。 OD理論の重要な予測（図1Bに要約）は、草食後の特殊代謝物の再編成により、特に特異性を高めることによって（ランダム分布とは対照的に）防御価値の高い代謝物に一方向の変化が生じるはずである。モード）MT理論によって予測される防御代謝物。M1に蓄積されたフェノール誘導体のほとんどは、昆虫のパフォーマンスの低下と機能的に関連している（32）。24時間後のEVコントロール植物の誘導葉と構成葉のM1代謝物のSi値を比較すると、草食昆虫後の多くの代謝物の代謝特異性に有意な増加傾向が見られることが観察された（図4C）。Si値の特異的な増加は防御フェノールアミドでのみ検出されたが、このモジュールに共存する他のフェノール類や未知の代謝物ではSi値の増加は検出されなかった。これはOD理論に関連する特殊なモデルである。草食動物によって引き起こされる代謝変化の主な予測は一貫している。フェノールアミドスペクトルのこの特異性がOS特異的ETによって誘導されたかどうかをテストするために、代謝物Siインデックスをプロットし、EVおよびsETR1遺伝子型におけるOSMとOSS1の差次的発現値を生成した（図4D）。sETR1では、フェナミドによって誘導されるOSMとOSS1の差は大幅に減少した。JAが不十分な株で収集されたMS/MSデータにもバイクラスタリング法を適用し、JA制御代謝特化に関連する主なMS/MSモジュールを推測した（図S6）。
(A) 585 MS/MS のクラスタリング結果（共有フラグメント (NDP 類似性) および共有中性損失 (NL 類似性) に基づく）は、モジュール (M) が既知の化合物ファミリーと一致するか、または未知もしくは代謝不良の代謝物組成によるものであることを示しています。各モジュールの横に、代謝物 (MS/MS) 特異的 (Si) 分布が示されています。(B) モジュール分子ネットワーク: ノードは MS/MS を表し、エッジは NDP (赤) および NL (青) MS/MS スコア (カットオフ > 0.6) です。モジュール (左) に基づいて色分けされた段階的代謝物特異性指数 (Si) が分子ネットワーク (右) にマッピングされています。(C) 24 時間後の EV 植物の構成的 (コントロール) 状態および誘導状態 (シミュレートされた草食動物) のモジュール M1: 分子ネットワーク図 (Si 値はノードサイズ、防御フェノールアミドは青で強調表示)。 (D) EVおよびET知覚障害を伴うスペクトル線sETR1のM1分子ネットワーク図：緑色の円ノードで表されるフェノール化合物、およびノー​​ドサイズとしてW + OSMとW + OSS1処理間の有意差（P値）。CP、N-カフェオイルチロシン；CS、N-カフェオイルスペルミジン；FP、N-フェルラ酸エステル尿酸；FS、N-フェルリルスペルミジン；CoP、N'、N “-クマロリルチロシン；DCS、N'、N”-ジカフェオイルスペルミジン；CFS、N'、N”-カフェオイル、フェルロイルスペルミジン；クコの実Sonに含まれるLycium barbarum；Nick。O-AS、O-アシル糖。
さらに、単一の弱毒化したネペンテス遺伝子型から自然集団へと解析を拡張しました。自然集団では、草食動物のJAレベルと特定の代謝産物レベルの強い種内変化が以前に報告されています（26）。このデータセットを使用して43の遺伝資源をカバーします。これらの遺伝資源は、N. pallensの123種の植物で構成されています。これらの植物は、ユタ州、ネバダ州、アリゾナ州、カリフォルニア州の異なる自生生息地で収集された種子から採取されました（図S7）。メタボロームの多様性（ここでは集団レベルβ多様性と呼ばれます）とOSMによって引き起こされる特殊化を計算しました。以前の研究と一致して、Hj軸とδj軸に沿って幅広い代謝変化が観察され、遺伝資源が草食動物に対する代謝応答の可塑性に大きな違いがあることを示しています（図S7）。この組織は、草食動物によって引き起こされるJAs変化のダイナミックレンジに関する以前の観察を彷彿とさせ、単一の集団で非常に高い値を維持しています（26、36）。JAとJA-Ileを使用してHjとδjの間の全体的なレベルの相関をテストすることにより、JAとメタボロームβ多様性および特化指数の間に有意な正の相関があることがわかりました（図S7）。これは、集団レベルで検出された草食動物誘発性のJAs誘導の不均一性が、昆虫草食動物からの選択によって引き起こされる主要な代謝多型によるものである可能性を示唆しています。
これまでの研究では、タバコの種類によって誘導型および構成型代謝防御への依存度や程度が大きく異なることが示されています。これらの抗草食動物シグナル伝達と防御能力の変化は、昆虫の個体群圧、植物のライフサイクル、および特定の種が生育するニッチにおける防御生産コストによって制御されていると考えられています。私たちは、北米と南米原産の6種のNicotiana属植物の草食動物によって誘発される葉のメタボローム再構築の一貫性を研究しました。これらの種は、北米のNepenthes属植物、すなわちNicolas Bociflo. La、N. nicotinis、Nicotiana n. attenuated grass、Nicotiana tabacum、linear tobacco、タバコ（Nicotiana spegazzinii）、およびタバコ葉タバコ（Nicotiana obtusifolia）に近縁です（図5A）（37）。これらの種のうち、よく特徴づけられているN. pleaseを含む6種はペチュニアクレードの1年生植物であり、obtusifolia N.は姉妹クレードであるTrigonophyllaeの多年生植物である（38）。その後、昆虫の摂食の種レベルの代謝再編成を研究するために、これら7種に対してW + W、W + OSM、およびW + OSS1誘導が行われた。
(A) 核グルタミン合成(38)の最大尤度に基づくブートストラップ系統樹と、近縁のNicotiana属7種の地理的分布(異なる色)(37)。(B) Nicotiana属7種の代謝プロファイルの特殊化多様性の散布図(939 MS/MS; データファイルS1)。種レベルでは、メタボローム多様性は特殊化の程度と負の相関関係にある。代謝多様性と特殊化およびJA蓄積の種レベルの相関関係の分析を図2に示す。S9。色は異なるタイプ、三角形はW + OSS1、四角形はW + OSM、(C) Nicotiana属のJAおよびJA-Ileの動態はOS励起振幅に応じてランク付けされている(二元配置分散分析およびTukey HSD多重比較検定、* P <0.05、** P <0.01、* ** W + OSとW + Wの比較ではP <0.001)。草食性およびメチルジャスモン酸（MeJA）をシミュレートした後の各種の（D）多様性および（E）特殊化の箱ひげ図。アスタリスクは、W + OSとW + WまたはラノリンプラスW（Lan + W）またはLanプラスMeJA（Lan + MeJa）とLanコントロールとの間の有意差を示します（二元配置分散分析、続いてTukeyのHSD事後多重比較、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。
デュアルクラスター法を用いて、939個のMS/MSの9つのモジュールを特定しました（データファイルS1）。異なる処理によって再構成されたMS/MSの構成は、種間で異なるモジュール間で大きく異なります（図S8）。Hj（ここでは種レベルのγ多様性と呼ぶ）とδjを可視化すると、異なる種が代謝空間で非常に異なるグループに集約され、種レベルの分裂が通常、励起よりも顕著であることがわかります。N. linearとN. obliquusを除いて、誘導効果のダイナミックレンジは広範囲にわたります（図5B）。対照的に、N. purpureaやN. obtusifoliaなどの種は、処理に対する代謝応答がそれほど明確ではありませんが、メタボロームはより多様です。誘導された代謝応答の種特異的な分布は、特殊化とガンマ多様性の間に有意な負の相関をもたらしました（PCC = -0.46、P = 4.9×10-8）。 OS誘導によるJAレベルの変化は、メタボロームの特異性と正の相関があり、各種が示す代謝ガンマ多様性とは負の相関がある（図5Bおよび図S9）。注目すべきは、図5Cで「シグナル応答」種として一般的に言及されている種、例えばNepenthes nematodes、Nepenthes nepenthes、Nepenthes acute、Nepenthes attenuatedなどは、30分で顕著な兆候を示したことである。最近のOS特異的JAおよびJA-Ileの発生は、Nepenthes mills、Nepenthes powdery、N. obtusifoliaなどの「シグナル非応答」と呼ばれる他の細菌がOS特異性を示さずにJA-Ile Edge誘導のみを示す（図5C）。代謝レベルでは、前述のように、attenuated Nepenthesでは、シグナル応答物質がOS特異性を示し、δjを大幅に増加させ、Hjを減少させた。このOS特異的プライミング効果は、シグナル非反応種に分類された種では検出されませんでした（図5、DおよびE）。OS特異的代謝物はシグナル応答性種間でより頻繁に共有され、これらのシグナルクラスターはシグナル応答が弱い種とクラスターを形成しますが、シグナル応答が弱い種では相互依存性が低くなります（図S8）。この結果は、OS特異的なJA誘導と下流メタボロームのOS特異的な再構成が種レベルで連動していることを示しています。
次に、メチルJA（MeJA）を含むラノリンペーストを用いて植物を処理し、これらのカップリングモードが、植物の細胞質に存在する外因性JAによって適用されるJAの利用可能性によって制限されるかどうかを調べた。急速な脱エステル化はJAである。JAの継続的な供給によって引き起こされる、シグナル応答種からシグナル非応答種への段階的な変化の同じ傾向が見つかった（図5、DおよびE）。要するに、MeJA処理は、線状線虫N. obliquus、N. aquaticus、N. pallens、およびN. mikimotoiのメタボロームを強く再プログラムし、δjの大幅な増加とHjの減少をもたらした。N. purpureaはδjの増加のみを示し、Hjは示さなかった。以前に極めて低いレベルのJAを蓄積することが示されていたN. obtusifoliaも、メタボローム再構成の観点からMeJA処理にほとんど反応しなかった。これらの結果は、JA 産生またはシグナル伝達が、シグナルに反応しない種では生理的に制限されていることを示しています。この仮説を検証するために、W + W、W + OSMs、および W + OSS1 トランスクリプトーム (39) によって誘導された 4 つの種 (N. pallens、N. mills、N. pink、および N. microphylla) を研究しました。メタボローム リモデリングのパターンと一致して、トランスクリプトーム空間では種は明確に分離されており、その中で N. attenuated は OS 誘導 RDPI が最も高く、N. gracilis は最も低い値を示しました (図 6A)。しかし、N. oblonga によって誘導されたトランスクリプトームの多様性は 4 つの種の中で最も低いことがわかりました。これは、以前に 7 つの種で示された N. oblonga のメタボロームの多様性が最も高いこととは対照的です。以前の研究では、JA シグナルを含む初期防御シグナルに関連する一連の遺伝子が、Nicotiana 種の草食動物関連エリシターによって誘導される初期防御応答の特異性を説明することが示されています (39)。これら4種のJAシグナル伝達経路を比較すると、興味深いパターンが明らかになった（図6B）。AOC、OPR3、ACX、COI1など、この経路のほとんどの遺伝子は、これら4種で比較的高い誘導レベルを示した。しかし、JAを生物学的に活性なJA-Ile蓄積転写産物に変換する重要な遺伝子であるJAR4の転写レベルは、特にN. mills、Nepenthes pieris、N. microphyllaでは非常に低い。さらに、N. bifidumでは、別の遺伝子AOSの転写産物のみが検出されなかった。これらの遺伝子発現の変化は、シグナル無反応種におけるJA産生の低下によって誘発される極端な表現型と、N. gracilisの誘導の原因となっている可能性がある。
(A) 草食動物による食害誘導後 30 分後に採取した近縁の 4 種のタバコの初期転写応答の再プログラミングの情報理論分析。RDPI は、草食動物 OS によって誘導された葉と傷のコントロールを比較することによって計算されます。色は異なる種を示し、記号は異なる処理方法を示します。(B) 4 種の JA シグナル伝達経路における遺伝子発現の分析。簡略化された JA 経路がボックス プロットの横に示されています。異なる色は異なる処理方法を示します。アスタリスクは、W + OS 処理と W + W コントロールの間に有意差があることを示します (ペアワイズ差のスチューデント t 検定の場合、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。OPDA、12-オキソフィトジエン酸。OPC-8: 0,3-オキソ-2(2′(Z)-ペンテニル)-シクロペンタン-1-オクタン酸。
最後の部分では、異なる植物種のメタボロームの昆虫種特異的な再構築が草食動物に対する抵抗性にどのように影響するかを研究しました。これまでの研究では、Nicotiana属が強調されていました。Msと幼虫に対する抵抗性は大きく異なります（40）。ここでは、このモデルとそれらの代謝可塑性との関連性を研究しました。上記の4つのタバコ種を使用し、草食動物によって引き起こされるメタボロームの多様性と特化と植物のMsとSlに対する抵抗性との相関関係をテストしたところ、汎用的なSlに対する抵抗性、多様性、特化性はすべて正の相関関係にあることがわかりましたが、専門的な雌に対する抵抗性と特化性との相関関係は弱く、多様性との相関関係は有意ではありませんでした（図S10）。S1抵抗性に関しては、以前にJAシグナル伝達レベルとメタボローム可塑性の両方を示すことが示された弱体化したN. chinensisとN. gracilisの両方が草食動物誘導に対して大きく異なる反応を示し、同様に高い抵抗性を示しました。
過去 60 年間、植物防御理論は理論的枠組みを提供し、研究者たちはそれに基づいて植物の特殊代謝産物の進化と機能を数多く予測してきた。これらの理論のほとんどは、強い推論の通常の手順に従わない (41)。それらは同じ分析レベルで重要な予測 (3) を提案する。重要な予測の検証によって特定の理論を分析できるようになると、この分野は前進する。支持されるが、他の理論は拒否される (42)。代わりに、新しい理論は異なる分析レベルで予測を行い、記述的考察の新しい層を追加する (42)。しかし、機能レベルで提案された 2 つの理論、MT と OD は、草食動物によって引き起こされる特殊代謝の変化の重要な予測として簡単に説明できる。OD 理論は、特殊代謝の「空間」の変化は方向性が非常に高いと考えている。MT 理論は、これらの変化は方向性がなく、代謝空間にランダムに配置され、防御価値の高い代謝産物を持つ傾向があると考えている。 OD および MT 予測のこれまでの検証は、限られた数の事前「防御」化合物を使用してテストされてきました。これらの代謝物中心のテストでは、草食動物による摂食中のメタボローム再構成の範囲と軌跡を分析する能力が排除され、植物メタボロームの変化を全体として考慮できる重要な予測を必要とする一貫した統計的フレームワーク内でのテストも許可されません。ここでは、計算 MS に基づくメタボロミクスの革新的な技術を使用し、情報理論記述子の一般的な通貨でデコンボリューション MS 分析を実行して、グローバルメタボロミクスレベルで提案された 2 つの違いをテストしました。この理論の重要な予測。情報理論は、特に生物多様性と栄養フロー研究の文脈で、多くの分野で応用されています (43)。しかし、私たちが知る限り、これは植物の代謝情報空間を記述し、環境シグナルに対する一時的な代謝変化に関連する生態学的問題を解決するために使用された最初のアプリケーションです。特に、この方法の強みは、植物種内および種間のパターンを比較し、草食動物が異なる種から種間マクロ進化パターンへと進化してきた過程を、進化のさまざまなレベルで調べることができる点にある。代謝。
主成分分析（PCA）は、多変量データセットを次元削減空間に変換し、データの主な傾向を説明できるようにするため、通常はメタボロームのデコンボリューションなどのデータセットを解析するための探索的手法として使用されます。しかし、次元削減はデータセットの情報内容の一部を失うため、PCAは、草食動物が特殊分野（例えば、豊富さ、分布）の多様性をどのように再構成するか、代謝物の量、特定の草食動物の誘導状態の予測因子となる代謝物など、生態学理論に特に関連する特性に関する定量的情報を提供することはできません。特異性、多様性、誘導性の観点から、葉特異的代謝物プロファイルの情報内容を分解すると、草食動物の摂食が特定の代謝を活性化できることがわかりました。予想外にも、実装された情報理論指標で説明されているように、2 種の草食動物 (夜間摂食の雑食性 Sl とナス科専門 Ms ) の攻撃後の結果的な代謝状況には大きな重複があることが観察されました。摂食行動と濃度は大きく異なりますが。OS における脂肪酸-アミノ酸複合体 (FAC) 開始剤 (31)。草食動物 OS を使用して標準化された穿刺傷を処理することにより、シミュレートされた草食動物処理も同様の傾向を示しました。草食動物の攻撃に対する植物の反応をシミュレートするこの標準化された手順は、異なる時期にさまざまな程度の損傷につながる草食動物の摂食行動の変化によって引き起こされる交絡因子を排除します (34)。OSM の主な原因として知られる FAC は、OSS1 で JAS や他の植物ホルモンの反応を減少させますが、OSS1 では数百倍減少します (31)。しかし、OSS1 では OSM と比較して同様のレベルの JA 蓄積を引き起こしました。弱毒化したウツボカズラのJA応答はOSMに非常に敏感であり、FACは水で1:1000に希釈しても活性を維持できることが以前に実証されている（44）。したがって、OSS1のFACはOSMに比べて非常に低いが、十分なJA放出を誘導するには十分である。これまでの研究では、ポリン様タンパク質（45）とオリゴ糖（46）がOSS1の植物防御応答を誘発する分子の手がかりとして使用できることが示されてきた。しかし、OSS1のこれらのエリシターが本研究で観察されたJAの蓄積の原因であるかどうかはまだ不明である。
異なる草食動物や外因性JAまたはSA（サリチル酸）の適用によって引き起こされる異なる代謝フィンガープリントを記述した研究は少ないものの（47）、植物の草ネットワークにおける草食動物種特異的な摂動とその特定の個人情報への影響を調べた研究はない。代謝の全体的な影響は体系的に研究されている。この分析により、JA以外の他の植物ホルモンとの内部ホルモンネットワーク接続が、草食動物によって引き起こされる代謝再編成の特異性を形成することがさらに確認された。特に、OSMによって引き起こされるETはOSS1によって引き起こされるETよりも有意に大きいことが検出された。このモードは、OSMにFAC含有量が多いことと一致しており、これはETバーストを引き起こすための必要かつ十分な条件である（48）。植物と草食動物の相互作用の文脈では、植物特異的な代謝物ダイナミクスに対するETのシグナル機能は依然として散発的であり、単一の化合物グループのみを対象としている。さらに、ほとんどの研究では、ETまたはその前駆体またはさまざまな阻害剤の外因性適用を使用してETの調節を研究しており、その中でこれらの外因性化学物質の適用は多くの非特異的な副作用を引き起こします。私たちの知る限り、この研究は、ETを使用して機能不全のトランスジェニック植物を生成および認識し、植物のメタボロームのダイナミクスを調整するETの役割を大規模に体系的に調査した最初のものです。草食動物特異的なET誘導は、最終的にメタボローム応答を調節することができます。最も重要なのは、ET生合成（ACO）および認識（ETR1）遺伝子のトランスジェニック操作であり、フェノールアミドの草食動物特異的なde novo蓄積を明らかにしました。ETは、プトレシンN-メチルトランスフェラーゼを調節することにより、JA誘導ニコチン蓄積を微調整できることが以前に示されています（49）。しかし、機械的な観点からは、ETがフェナミドの誘導をどのように微調整するかは明らかではありません。 ETのシグナル伝達機能に加えて、代謝フラックスはS-アデノシル-1-メチオニンへと迂回され、ポリアミノフェノールアミドへの投資を調節することもある。S-アデノシル-1-メチオニンはETであり、ポリアミン生合成経路の共通中間体である。ETシグナルがフェノールアミドのレベルを調節するメカニズムについては、さらなる研究が必要である。
長らく、構造が不明な特殊代謝物が多数存在するため、特定の代謝カテゴリーに集中的に注目しても、生物学的相互作用後の代謝多様性の時間的変化を厳密に評価することは困難でした。現在、情報理論分析に基づくと、バイアスのない代謝物に基づくMS/MSスペクトル取得の主な結果は、草食動物が草食動物を摂食または模倣することで、葉のメタボロームの全体的な代謝多様性が減少する一方で、その特異性が高まるということです。草食動物によって引き起こされるこの一時的なメタボローム特異性の増加は、トランスクリプトーム特異性の相乗的な増加と関連しています。このより大きなメタボローム特異性（より高いSi値を持つ）に最も寄与する特徴は、以前に特徴付けられた草食機能を持つ特殊代謝物です。このモデルはOD理論の予測と一致しますが、メタボローム再プログラミングのランダム性に関連するMTの予測とは一致しません。しかし、このデータは混合モデル（最適なMT；図1B）の予測とも一致している。なぜなら、防御機能が不明な他の未解明の代謝物は、依然としてランダムなSi分布に従う可能性があるからである。
この研究でさらに捉えられた注目すべきパターンは、微小進化レベル（単一の植物とタバコの集団）からより大きな進化スケール（近縁のタバコ種）まで、進化組織の異なるレベルが「最良の防御」にあり、草食動物の能力に大きな違いがあるということです。Moore ら（20）と Kessler と Kalske（1）は、Whittaker（50）によって最初に区別された生物多様性の 3 つの機能レベルを、化学的多様性の構成的および誘導的時間的変化に変換することを独立して提案しました。これらの著者はどちらも、大規模なメタボロームデータ収集の手順をまとめておらず、これらのデータから代謝的多様性を計算する方法も概説していません。この研究では、Whittaker の機能分類に若干の調整を加え、α-代謝的多様性を特定の植物の MS/MS スペクトルの多様性、β-代謝的多様性を集団のグループの基本的種内代謝、γ-代謝的多様性を類似種の分析の拡張とみなします。
JAシグナルは、草食動物の幅広い代謝応答に不可欠です。しかし、JA生合成の種内調節がメタボロームの多様性に寄与する厳密な定量的テストは不足しており、JAシグナルがより大きなマクロ進化スケールでのストレス誘発性代謝多様化の一般的な部位であるかどうかは依然として不明です。私たちは、Nepenthes herbivorousの草食性の性質がメタボロームの特殊化を誘導し、Nicotiana種の集団内および近縁のNicotiana種間のメタボローム特殊化の変動がJAシグナルと系統的に正の相関関係にあることを観察しました。さらに、JAシグナルが損なわれると、単一の遺伝子型の草食動物によって誘導される代謝特異性がキャンセルされます（図3、CおよびE）。自然に弱毒化したウツボカズラの個体群における代謝スペクトルの変化は主に定量的であるため、本解析における代謝β多様性および特異性の変化は、代謝産物が豊富な化合物群の強い活性化によって大きく引き起こされていると考えられる。これらの化合物群はメタボロームプロファイルの一部を支配し、JAシグナルとの正の相関関係をもたらす。
タバコの近縁種の生化学的メカニズムは大きく異なるため、代謝産物は定性的な側面で特定され、より分析的になります。情報理論による捕捉された代謝プロファイルの処理により、草食動物による誘導が代謝ガンマ多様性と特化の間のトレードオフを悪化させることが明らかになりました。JAシグナルはこのトレードオフにおいて中心的な役割を果たします。メタボローム特化の増加は主要なOD予測と一致し、JAシグナルと正の相関がありますが、JAシグナルは代謝ガンマ多様性と負の相関があります。これらのモデルは、植物のOD能力は、微小進化スケールであろうとより大きな進化スケールであろうと、主にJAの可塑性によって決定されることを示しています。JA生合成の欠陥を回避する外因性JA適用実験により、近縁のタバコ種は、草食動物によって誘導されるJAとメタボロームの可塑性の様式と同様に、シグナル応答性種とシグナル非応答性種に区別できることがさらに明らかになりました。シグナルに反応しない種は、内因性JAを産生できないため反応できず、生理学的制約を受ける。これは、JAシグナル伝達経路のいくつかの主要遺伝子（N. crescensのAOSおよびJAR4）の変異によって引き起こされる可能性がある。この結果は、これらの種間マクロ進化パターンが、主に内部ホルモンの認識と反応性の変化によって引き起こされる可能性があることを強調している。
植物と草食動物の相互作用に加えて、代謝多様性の探求は、環境への生物学的適応と複雑な表現型形質の進化の研究におけるすべての重要な理論的進歩に関連しています。最新のMS機器によって取得されるデータ量の増加に伴い、代謝多様性に関する仮説検証は、個体/カテゴリーの代謝物の違いを超えて、予期せぬパターンを明らかにするグローバル分析を実行できるようになりました。大規模分析のプロセスにおいて重要なメタファーは、データを探索するために使用できる意味のあるマップを考案するという考え方です。したがって、バイアスのないMS/MSメタボロミクスと情報理論の現在の組み合わせの重要な成果は、異なる分類学的スケールで代謝多様性を閲覧するためのマップを構築するために使用できる単純な指標を提供することです。これは、この方法の基本的な要件です。ミクロ/マクロ進化と群集生態学の研究。
マクロ進化レベルでは、EhrlichとRavenの植物と昆虫の共進化理論（51）の中核は、種間代謝多様性の変動が植物系統の多様化の原因であると予測することである。しかし、この画期的な研究の発表から50年が経過したが、この仮説はほとんど検証されていない（52）。これは主に、長距離にわたる植物系統間で類似した代謝特性の系統発生特性によるものである。この希少性を利用して、ターゲット分析法を固定することができる。情報理論によって処理される現在のMS/MSワークフローは、未知の代謝物（事前の代謝物選択なし）のMS/MS構造類似性を定量化し、これらのMS/MSをMS/MSのセットに変換するため、専門的な代謝では、これらのマクロ進化モデルは分類スケールで比較される。単純な統計指標。このプロセスは、事前の予測なしに配列アライメントを使用して多様化率または形質進化を定量化できる系統発生分析に似ている。
生化学レベルでは、FirnとJonesのスクリーニング仮説（53）は、代謝的多様性がさまざまなレベルで維持され、以前は無関係であったり代替されていた代謝物の生物学的活性を発揮するための原材料を提供することを示しています。情報理論的手法は、代謝物の特殊化中に発生するこれらの代謝物特異的な進化的遷移を、提案された進化的スクリーニングプロセスの一部として定量化できる枠組みを提供します。すなわち、特定の環境の阻害された代謝物から、低特異性から高特異性への生物学的に活性な適応です。
総じて、分子生物学の黎明期には、重要な植物防御理論が開発され、演繹的仮説駆動法が科学的進歩の唯一の手段であると広く考えられてきました。これは主に、全メタボロームを測定する技術的な限界によるものです。仮説駆動法は他の因果メカニズムを選択するのに特に有用ですが、生化学ネットワークの理解を深める能力は、現代のデータ集約型科学で現在利用可能な計算方法よりも限定的です。したがって、予測できない理論は利用可能なデータの範囲をはるかに超えているため、研究分野における進歩の仮説式/テストサイクルは廃止できません（4）。ここで紹介するメタボロミクスの計算ワークフローは、代謝的多様性の最近の（どのように）および最終的な（なぜ）問題への関心を再び高め、理論主導のデータサイエンスの新時代に貢献できると私たちは考えています。この時代は、以前の世代にインスピレーションを与えた重要な理論を再検討するものです。
直接的な草食動物の摂食は、開花中のバラの株1本につき、淡色のウツボカズラの葉1枚に2齢幼虫またはSl幼虫を飼育することによって行われ、1株あたり10株の反復実験が行われた。昆虫の幼虫はクランプで挟まれ、感染後24時間および72時間後に残りの葉組織が採取され、急速冷凍され、代謝物が抽出された。
草食動物による処理を高度に同期した方法でシミュレートする。方法は、布製パターンホイールを使用して、布製ガーランドの成長段階にある植物の完全に展開した3枚の葉の主脈の両側に3列の棘を刺し、直ちに1:5希釈Msを適用するか、手袋をはめた指でS1 OSを刺し傷に挿入する。上記のように葉を収穫して処理する。前述の方法を使用して、一次代謝物と植物ホルモンを抽出する（54）。
外因性JAの適用については、各品種の開花期のバラ6株の葉柄葉3枚に、150μgのMeJAを含むラノリンペースト20μl（Lan + MeJA）、ラノリンペースト20μlと傷口処理剤（Lan + W）を塗布するか、または対照として純粋なラノリン20μlを塗布した。葉は処理後72時間で採取し、液体窒素で急速凍結し、使用するまで-80℃で保存した。
当研究グループでは、irAOC（36）、irCOI1（55）、irACO、sETR1（48）の4つのJAおよびETトランスジェニック系統を同定しました。irAOCはJAおよびJA-Ileレベルが著しく低下しましたが、irCOI1はJAに感受性を示しませんでした。EVと比較すると、JA-Ileの蓄積が増加しました。同様に、irACOはETの産生を減少させ、ETに感受性を示さないsETR1はEVと比較してETの産生を増加させます。
光音響レーザー分光計（Sensor Sense社製ETD-300リアルタイムETセンサー）を用いて、非侵襲的にET測定を行った。処理直後、葉の半分を切り取り、4mlの密閉ガラスバイアルに移し、5時間以内にヘッドスペースを蓄積させた。測定中は、各バイアルを、Sensor Sense社製の触媒を通してCO2と水分を除去した純空気を、毎時2リットルの流量で8分間流した。
マイクロアレイデータは元々(35)で公開され、国立生物工学情報センター(NCBI)遺伝子発現総合データベース(アクセッション番号GSE30287)に保存されています。本研究では、W + OSMs処理によって生じた葉と無傷の対照に対応するデータを抽出しました。生の強度はlog2です。統計解析の前に、ベースラインはRソフトウェアパッケージを使用して75パーセンタイルに変換および正規化されました。
Nicotiana 種の元の RNA シーケンス (RNA-seq) データは、NCBI Short Reading Archives (SRA) から取得され、プロジェクト番号は PRJNA301787 で、Zhou ら (39) によって報告され、(56) に記載されているように処理されました。Nicotiana 種に対応する W + W、W + OSM、および W + OSS1 で処理された生データが本研究の分析用に選択され、次のように処理されました。まず、生 RNA-seq の読み取りが FASTQ 形式に変換されました。HISAT2 は FASTQ を SAM に変換し、SAMtools は SAM ファイルをソートされた BAM ファイルに変換します。StringTie は遺伝子発現の計算に使用され、その発現方法は、1000 塩基あたりの断片数、100 万シーケンス転写断片数です。
分析に使用した Acclaim クロマトグラフィー カラム (150 mm x 2.1 mm、粒子サイズ 2.2μm) と 4 mm x 4 mm ガード カラムは同じ材料で構成されています。Dionex UltiMate 3000 超高速液体クロマトグラフィー (UHPLC) システムでは、次のバイナリ グラジエントを使用します。0 ～ 0.5 分、等濃度 90% A [脱イオン水、0.1% (v/v) アセトニトリル、0.05% ギ酸]、10% B (アセトニトリル、0.05% ギ酸)。0.5 ～ 23.5 分、グラジエント相はそれぞれ 10% A と 90% B。23.5 ～ 25 分、等濃度 10% A と 90% B。流速は 400μl/分です。すべてのMS分析では、カラム溶出液を、正イオン化モードで動作するエレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極飛行時間型（qTOF）分析装置に注入します（キャピラリー電圧4500V、キャピラリー出口130V、乾燥温度200℃、乾燥空気流量10リットル/分）。
データと無関係または区別できないMS/MSフラグメント分析（以下、MS/MSと呼ぶ）を実行して、検出可能な代謝プロファイル全体の構造情報を取得します。無差別MS/MSメソッドの概念は、四重極が非常に大きな質量分離ウィンドウを持っているという事実に基づいています[したがって、すべての質量電荷比（m/z）シグナルをフラグメントとみなします]。このため、Impact II装置ではCE傾斜を作成できなかったため、衝突誘起解離衝突エネルギー（CE）値を増加させて、いくつかの独立した分析を実行しました。簡単に言うと、まず、UHPLC-エレクトロスプレーイオン化/qTOF-MSを使用して、単一質量分析モード（ソース内フラグメンテーションによって生成される低フラグメンテーション条件）でサンプルを分析し、繰り返し周波数5 Hzでm/z 50から1500までスキャンします。 MS/MS分析の衝突ガスとして窒素を使用し、次の4つの異なる衝突誘起解離電圧（20、30、40、50 eV）で独立した測定を実行します。測定プロセス全体を通して、四重極はm/z 50から1500までの最大の質量分離ウィンドウを持ちます。フロントボディm/zと分離幅実験が200に設定されている場合、質量範囲は装置のオペレーティングソフトウェアによって自動的にアクティブ化され、0 Daになります。シングル質量モードと同様に質量フラグメントをスキャンします。質量校正にはギ酸ナトリウム（50 mlイソプロパノール、200 μlギ酸、1 ml 1M NaOH水溶液）を使用します。Brukerの高精度校正アルゴリズムを使用して、指定された時間内に平均スペクトルを実行した後、データファイルが校正されます。データ解析v4.0ソフトウェア（Brook Dalton、ブレーメン、ドイツ）のエクスポート機能を使用して、生データファイルをNetCDF形式に変換します。 MS/MSデータセットは、オープンメタボロミクスデータベースMetaboLights（www.ebi.ac.uk）にアクセッション番号MTBLS1471で保存されています。
MS/MSアセンブリは、低衝突エネルギーと高衝突エネルギーにおけるMS1とMS/MS品質信号間の相関分析と、新たに実装されたルールによって実現できます。Rスクリプトは、前駆物質から生成物への分布の相関分析を実現するために使用され、C#スクリプト（https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline）は、ルールの実装に使用されます。
バックグラウンドノイズによる偽陽性エラーや、少数のサンプルで特定の m/z 特徴を検出することによって生じる偽相関を減らすために、R パッケージ XCMS (バックグラウンドノイズ補正用) の「filled peak」関数を使用して、「NA」(未検出ピーク) 強度を置き換える必要があります。filled peak 関数を使用すると、データセットには相関計算に影響を与える「0」強度値がまだ多く存在します。そこで、filled peak 関数を使用した場合と使用しなかった場合のデータ処理結果を比較し、平均補正推定値に基づいてバックグラウンドノイズ値を計算して、これらの 0 強度値を計算されたバックグラウンド値で置き換えます。また、強度がバックグラウンド値の 3 倍を超える特徴のみを考慮し、「真のピーク」とみなします。PCC 計算では、少なくとも 8 つの真のピークを持つサンプル前駆体 (MS1) およびフラグメントデータセットの m/z シグナルのみを考慮します。
サンプル全体の前駆物質の品質特性の強度が、低または高衝突エネルギーにさらされた同じ品質特性の強度の低下と有意に相関しており、CAMERA によってその特性が同位体ピークとしてラベル付けされていない場合、さらに詳細に定義することができます。次に、3 秒 (ピーク保持の推定保持時間ウィンドウ) 以内のすべての可能な前駆物質-生成物ペアを計算することにより、相関分析を実行します。m/z 値が前駆物質の値よりも低く、かつ、それが由来する前駆物質と同じデータセット内のサンプル位置で MS/MS フラグメンテーションが発生する場合にのみ、それはフラグメントとみなされます。
これら 2 つの単純なルールに基づいて、特定された前駆物質の m/z 値よりも大きい m/z 値を持つ指定されたフラグメントを除外し、前駆物質が現れるサンプル位置と指定されたフラグメントに基づいて除外します。また、MS1 モードで生成された多数のインソースフラグメントによって生成された品質特性を候補前駆物質として選択し、冗長な MS/MS 化合物を生成することも可能になります。このデータ冗長性を減らすために、スペクトルの NDP 類似度が 0.6 を超え、CAMERA によって注釈が付けられたクロマトグラム「pcgroup」に属する場合は、それらをマージします。最後に、前駆物質とフラグメントに関連付けられた 4 つの CE 結果すべてを、異なる衝突エネルギーで同じ m/z 値を持つすべての候補ピークの中で最も強度の高いピークを選択することによって、最終的なデコンボリューション複合スペクトルにマージします。後続の処理ステップは複合スペクトルの概念に基づいており、一部のフラグメントは特定の衝突エネルギーでのみ検出できるため、フラグメント化の確率を最大化するために必要なさまざまな CE 条件を考慮しています。
RDPI (30) は、代謝プロファイルの誘導性を計算するために使用されました。代謝スペクトル多様性 (Hj 指数) は、Martínez ら (8) によって記述された次の式を使用して、MS/MS 頻度分布のシャノン エントロピーを使用して、MS/MS 前駆体の存在量から導出されます。Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) ここで、Pij は、j 番目のサンプル (j = 1, 2,…, m) における i 番目の MS/MS の相対頻度 (i = 1, 2, …, m) t に対応します。
代謝特異性（Si指数）は、検討対象のサンプル間の頻度に関連した、特定のMS/MSの発現同一性として定義されます。MS/MS特異性は、Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)として計算されます。
各 j サンプルのメタボローム特異的 δj 指数を測定するには、次の式を使用します。MS/MS 特異性の平均値 δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MSスペクトルはペアで整列され、類似性は2つのスコアに基づいて計算されます。まず、標準NDP（コサイン相関法とも呼ばれる）を使用して、次の式を使用してスペクトル間のセグメント類似性をスコアします。NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 ここで、S1とS2はスペクトル1とスペクトル2、およびWS1、iとWS2に対応し、iは、2つのスペクトル間のi番目の共通ピークの差が0.01 Da未満であるピーク強度に基づく重みを表します。重みは、MassBankが提案するように、次のように計算されます。W = [ピーク強度] m [品質] n、m = 0.5、n = 2。
2 番目のスコアリング方法が導入され、MS/MS 間で共有される NL を分析することになりました。この目的のために、MS フラグメンテーション プロセス中に頻繁に遭遇する 52 の NL リストと、弱体化した Nepenthes 種の二次代謝産物の MS/MS スペクトル用に以前に注釈が付けられたより具体的な NL (データ ファイル S1) (9、26) を使用しました。各 MS/MS に対して、それぞれ現在の NL と存在しない NL に対応する 1 と 0 のバイナリ ベクトルを作成します。ユークリッド距離の類似性に基づいて、バイナリ NL ベクトルの各ペアについて NL 類似性スコアが計算されます。
デュアルクラスタリングを実行するために、Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA) の拡張に基づいた R パッケージ DiffCoEx を使用しました。MS/MS スペクトルの NDP および NL スコアリングマトリックスを使用して、DiffCoEx を使用して比較相関マトリックスを計算しました。バイナリクラスタリングは、「cutreeDynamic」パラメータを method = “hybrid”、cutHeight = 0.9999、deepSplit = T、minClusterSize = 10 に設定して実行します。DiffCoEx の R ソースコードは、Tesson ら (57) の追加ファイル 1 からダウンロードしました。必要な R WGCNA ソフトウェアパッケージは、https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA にあります。
MS/MS分子ネットワーク解析を行うために、NDPおよびNL類似性タイプに基づいてペアスペクトル接続性を計算し、CytoscapeソフトウェアのCyFilescape yFilesレイアウトアルゴリズム拡張アプリケーション内の有機レイアウトを使用してネットワークトポロジーを可視化しました。
データの統計解析にはRバージョン3.0.1を使用しました。統計的有意性は、二元配置分散分析（ANOVA）とそれに続くTukeyのHSD事後検定を用いて評価しました。草食処理群と対照群の差を分析するために、分散が同じ2つのサンプル群の両側分布をStudentのt検定を用いて分析しました。
本記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1 を参照してください。
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情報理論は、特殊なメタボロームの比較や、試験防御理論の予測のための普遍的な基準を提供する。
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