さまざまな植物防御理論は、植物の特殊化した代謝のパターンを説明するための重要な理論的指針を提供しますが、それらの主要な予測はまだ検証されていません。ここでは、バイアスタンデム質量分析（MS / MS）分析を使用して、タバコ弱毒化株のメタボロームを個々の植物から集団および近縁種に体系的に調査し、情報内の化合物スペクトルに基づいて多数の質量分析特徴理論を処理しました。最適防御（OD）理論と移動ターゲット（MT）理論の主要な予測をテストするためのフレームワーク。植物メタボロミクスの情報コンポーネントはOD理論と一致していますが、草食動物によるメタボロミクスダイナミクスに関するMT理論の主な予測とは矛盾しています。ミクロからマクロの進化スケールまで、ジャスモン酸シグナルがODの主な決定要因として特定され、エチレンシグナルはMS / MS分子ネットワークによって注釈付けされた草食動物固有の応答の微調整を提供しました。
多様な構造を持つ特殊代謝物は、植物の環境適応、特に外敵からの防御において主要な役割を果たしています (1)。植物に見られる特殊代謝物の驚くべき多様性は、数十年にわたり、その生態学的機能の様々な側面に関する詳細な研究を促し、植物と昆虫の相互作用の進化的・生態学的発展を論じる植物防御理論の長いリストを形成してきました。実証研究は重要な指針を提供しています (2)。しかし、これらの植物防御理論は、主要な予測が同じ分析レベルにあり (3)、実験的に検証されて次の理論発展サイクルに進むという、仮説的演繹的推論の規範的な道をたどっていません (4)。技術的な制限により、データ収集は特定の代謝カテゴリーに制限され、特殊な代謝物の包括的な分析が排除されているため、理論発展に不可欠なカテゴリー間の比較が妨げられています (5)。包括的なメタボロミクスデータと、異なる植物グループ間の代謝空間の処理ワークフローを比較するための共通通貨の欠如は、この分野の科学的成熟を妨げています。
タンデム質量分析（MS/MS）メタボロミクスの分野における最新の開発により、特定のシステムクレードの種内および種間の代謝変化を包括的に特徴付けることができ、計算手法と組み合わせてこれらの複雑な混合物間の構造類似性を計算することができます。化学の予備知識（5）。分析とコンピューティングの高度な技術の組み合わせは、代謝多様性の生態学的および進化論的理論による多くの予測を長期的にテストするために必要なフレームワークを提供します。シャノン（6）は、1948年に独創的な論文で初めて情報理論を紹介し、情報の数学的分析の基礎を築きました。これは、当初の用途以外にも多くの分野で使用されています。ゲノミクスでは、情報理論は配列保存情報の定量化にうまく適用されています（7）。トランスクリプトミクス研究では、情報理論はトランスクリプトームの全体的な変化を分析します（8）。以前の研究では、情報理論の統計的フレームワークをメタボロミクスに適用し、植物の組織レベルの代謝の専門知識を記述しました（9）。ここでは、共通通貨における代謝多様性を特徴とする情報理論の統計的フレームワークと MS/MS ベースのワークフローを組み合わせて、草食動物によって誘発されるメタボロームの植物防御理論の主要な予測を比較します。
植物防御の理論的枠組みは通常、相互に包含的であり、2 つのカテゴリに分類できます。1 つは、最適防御 (OD) (10)、移動標的 (MT) (11) および外観 (12) 理論などの防御機能に基づいて植物特有の代謝物の分布を説明しようとするもので、もう 1 つは、炭素:栄養バランス仮説 (13)、成長速度仮説 (14)、成長と分化の平衡仮説 (15) などのように、資源の利用可能性の変化が植物の成長と特殊な代謝物の蓄積にどのように影響するかを機械的な説明を求めるものです。2 つの理論セットは、分析のレベルが異なります (4)。ただし、機能レベルでの防御機能を含む 2 つの理論が、植物の構成的防御と誘導性防御に関する議論を支配しています。1 つは、植物が高価な化学防御に投資するのは必要なときだけ、たとえば摂取されたときだと仮定する OD 理論です。したがって、草本動物が攻撃した場合は、将来の攻撃の可能性に応じて、防御機能を持つ化合物が割り当てられます (10)。 MT仮説は、代謝物の変化に方向性はなく、代謝物がランダムに変化することで、攻撃する草食動物の代謝の「運動目標」を阻害する可能性を生み出すと提唱する。言い換えれば、これら2つの理論は、草食動物の攻撃後に起こる代謝リモデリングについて、防御機能を伴う代謝物の一方向性蓄積（OD）と非方向性代謝変化（MT）の関係という、正反対の予測を行っている（11）。
OD仮説とMT仮説は、メタボロームの誘発変化だけでなく、特定の生態環境におけるこれらの代謝変化の適応コストと便益など、これらの代謝物の蓄積による生態学的および進化的影響も考慮に入れています（16）。両仮説とも、高価であるか否かに関わらず、特殊な代謝物の防御機能を認識していますが、OD仮説とMT仮説を区別する重要な予測は、誘発される代謝変化の方向性にあります。OD理論の予測は、これまで最も実験的な注目を集めてきました。これらの検証には、温室および自然環境における特定の化合物の異なる組織の直接的または間接的な防御機能の研究、および植物の発育段階における変化が含まれます（17-19）。しかしながら、これまでのところ、あらゆる生物の代謝多様性を包括的に解析するためのワークフローと統計的枠組みが欠如しているため、2つの理論間の主な違い（つまり、代謝変化の方向性）の予測はまだ検証されていません。ここでは、そのような解析を提供します。
植物特異的代謝物の最も重要な特徴の一つは、単一植物、個体群、類似種に至るまで、あらゆるレベルで極めて多様な構造的多様性を有することである(20)。個体群レベルでは、特殊代謝物における多くの量的変化が観察される一方、種レベルでは通常、強い質的差異が維持されている(20)。したがって、植物の代謝多様性は機能的多様性の主要な側面であり、異なるニッチ、特に特殊な昆虫と一般的な草食動物による侵入可能性が異なるニッチへの適応性を反映している(21)。フランケル(22)による植物特異的代謝物の存在理由に関する画期的な論文以来、様々な昆虫との相互作用は重要な選択圧とみなされ、これらの相互作用が進化の過程で植物を形作ってきたと考えられている。代謝経路(23)。特殊代謝物の多様性における種間差は、草食動物に対する植物の恒常的および誘導的防御に関連する生理学的バランスを反映している可能性もある。なぜなら、両種はしばしば負の相関関係にあるからである(24)。常に良好な防御を維持することは有益であるかもしれないが、防御に関連するタイムリーな代謝変化は、植物が貴重な資源を他の生理学的投資に割り当て（19、24）、共生の必要性を回避することを可能にするという明らかな利点をもたらす。付随的損害（25）。さらに、昆虫食草食動物によって引き起こされるこれらの特殊な代謝物の再編成は、集団内での破壊的な分布につながる可能性があり（26）、ジャスモン酸（JA）シグナルの大幅な自然変化を直接的に反映している可能性があり、この変化は集団内で維持される可能性があります。JAシグナルの高低は、草食動物に対する防御と特定の種との競争との間のトレードオフです（27）。さらに、特殊な代謝物の生合成経路は、進化の過程で急速に喪失および変形を受け、その結果、近縁種間での代謝分布が不均一になります（28）。これらの多型は、草食動物のパターンの変化に応じて急速に確立される可能性があり（29）、これは草食動物群集の変動が代謝の異質性を推進する重要な要因であることを意味します。
ここでは、具体的には以下の問題を解決しました。(I) 草食昆虫はどのようにして植物のメタボロームを再構成するのか？(II) 長期防御理論の予測を検証するために定量化できる代謝可塑性の主な情報要素は何ですか？(III) 攻撃者に固有の方法で植物のメタボロームを再プログラムするかどうか、もしそうなら、植物ホルモンは特定の代謝反応を調整する上でどのような役割を果たし、どの代謝物が防御の種特異性に寄与するのか？(Iv) 多くの防御理論による予測は生物組織のすべてのレベルに拡張できるため、引き起こされる代謝反応が内部比較から種間比較までどの程度一貫しているかを尋ねました。この目的のために、我々はタバコニコチンの葉のメタボロームを体系的に研究した。タバコニコチンは、豊富で特殊な代謝を持つ生態学的モデル植物であり、2種類の在来草食動物、チョウセンアサガオ（Ms）（非常に攻撃的で、主に食用）の幼虫に有効である。ナス科とスポドプテラ・リトラリス（Sl）では、ワタムシは一種の「属」であり、ナス科の宿主植物と他の属と科の宿主は植物食である。我々は、MS/MSメタボロミクススペクトルを解析し、情報理論の統計記述子を抽出して、OD理論とMT理論を比較した。主要代謝物の同一性を明らかにするために特異性マップを作成する。分析は、N. nasiの在来個体群と密接に関連するタバコ種にまで拡張され、植物ホルモンシグナリングとOD誘導の共分散をさらに分析した。
草食タバコの葉のメタボロームの可塑性と構造に関する全体像を把握するために、我々は以前に開発した分析・計算ワークフローを用いて、植物抽出物から高解像度データ非依存のMS/MSスペクトルを包括的に収集・デコンボリューションした（9）。この非分化法（MS/MSと呼ばれる）は、冗長性のない化合物スペクトルを構築することができ、このスペクトルはここで説明するすべての化合物レベルの分析に使用することができる。これらのデコンボリューションされた植物代謝物は様々な種類があり、数百から数千の代謝物（ここでは約500～1000秒/MS/MS）から構成されている。ここでは、情報理論の枠組みで代謝可塑性を考察し、代謝頻度分布のシャノンエントロピーに基づいてメタボロームの多様性と専門性を定量化する。以前に実装した式（8）を使用して、メタボローム多様性（Hj指標）、代謝プロファイルの特殊化（δj指標）、および単一代謝物の代謝特異性（Si指標）を定量化するために使用できる一連の指標を計算しました。 さらに、相対距離可塑性指数（RDPI）を適用して、草食動物のメタボローム誘導性を定量化しました（図1A）（30）。 この統計的枠組みの中で、MS/MSスペクトルを基本情報単位として扱い、MS/MSの相対的存在量を頻度分布マップに処理し、シャノンエントロピーを使用してそこからメタボローム多様性を推定します。 メタボロームの特殊化は、単一のMS/MSスペクトルの平均特異性によって測定されます。 したがって、草食動物誘導後の一部のMS/MSクラスの存在量の増加は、スペクトル誘導性、RDPIおよび特殊化、つまりδj指数の増加に変換されます。 Hj多様性指数の低下は、生成されるMS/MSの数が減少したか、プロファイル頻度分布が不均一な方向に変化し、全体的な不確実性が低下したことを反映しています。Si指数の計算により、特定の草食動物によって誘導されるMS/MSと、逆に誘導に反応しないMS/MSを特定することが可能になり、これはMT予測とOD予測を区別するための重要な指標となります。
(A) 草食性 (H1～Hx) MS/MS データ誘導性 (RDPI)、多様性 (Hj 指数)、特化度 (δj 指数)、代謝物特異性 (Si 指数) を表す統計記述子。特化度 (δj) の増加は、平均して草食性特有の代謝物がより多く生成されることを示し、多様性 (Hj) の減少は、代謝物の生成量の減少または分布マップにおける代謝物の不均一な分布を示す。Si 値は、代謝物が特定の条件 (ここでは草食性) に特異的であるか、逆に同じレベルに維持されているかを評価する。(B) 情報理論軸を用いた防御理論予測の概念図。OD 理論は、草食動物の攻撃によって防御代謝物が増加し、δj が増加すると予測する。同時に、代謝情報の不確実性が低下する方向にプロファイルが再編成されるため、Hj は減少する。 MT理論は、草食動物の攻撃がメタボロームに非方向性な変化を引き起こし、代謝情報の不確実性の増加を示す指標としてHjを増加させ、Siのランダムな分布を引き起こすと予測しています。私たちはまた、防御値の高い代謝物が特に増加し（高いSi値）、他の代謝物はランダムな反応を示す（低いSi値）混合モデル、すなわちベストMTを提案しました。
情報理論記述子を用いて、我々は OD 理論を解釈し、非誘導構成状態における草食動物誘導性の特殊代謝物変化が、(i) 代謝特異性 (Si 指数) の増加を促し、メタボローム特異性 (δj 指数) の増加 (より高い防御値を持つ特定の特殊代謝物グループの増加)、および (ii) 代謝頻度分布からレプチン体への分布の変化によるメタボローム多様性 (Hj 指数) の減少につながると予測する。単一の代謝物レベルでは、秩序だった Si 分布が予想され、代謝物はその防御値に応じて Si 値を増加させる (図 1B)。これに沿って、我々は MT 理論を説明し、励起により (i) 代謝物の非方向性変化が生じ、δj 指数が減少すること、および (ii) 代謝の不確実性の増加により Hj 指数が増加することが予測される。またはランダム性であり、これは一般化多様性の形でシャノンエントロピーによって定量化できる。代謝構成に関しては、MT理論はSiのランダムな分布を予測します。特定の代謝物は特定の条件下で特定の状態にあり、他の代謝物は特定の条件下ではないこと、そしてそれらの防御値は環境に依存することを考慮し、δjとHjがSi増加の2方向に分布する混合防御モデルも提案しました。このモデルでは、防御値の高い特定の代謝物群のみがSiを特に増加させ、他の代謝物はランダムに分布します（図1B）。
情報理論記述子の軸上で再定義された防衛理論の予測を検証するために、エキスパート（Ms）またはジェネラリスト（Sl）の草食動物の幼虫をNepenthes pallens の葉で育てました（図 2A）。MS/MS 分析を使用して、幼虫の摂食後に採取した葉組織のメタノール抽出物から 599 の非冗長 MS/MS スペクトル（データ ファイル S1）を取得しました。RDPI、Hj、および δj インデックスを使用して、MS/MS 構成ファイルの情報コンテンツの再構成を視覚化すると、興味深いパターンが明らかになります（図 2B）。全体的な傾向として、情報記述子で説明されているように、幼虫が葉を食べ続けると、すべての代謝再構成の程度が時間とともに増加します。草食動物が食べてから 72 時間後、RDPI が大幅に増加します。損傷を受けていないコントロールと比較して、Hj は大幅に減少しましたが、これは δj インデックスによって定量化された代謝プロファイルの特殊化の程度の増加によるものでした。この明らかな傾向はOD理論の予測と一致しているが、代謝物のランダムな（方向性のない）変化が防御カモフラージュとして利用されているとするMT理論の主な予測とは矛盾している（図1B）。これら2種の草食動物の口腔分泌物（OS）エリシター含有量と摂食行動は異なるものの、直接摂食は24時間および72時間の収穫期間中にHjとδjの方向に同様の変化をもたらした。唯一の違いはRDPIの72時間目に発生した。Ms摂食によって引き起こされた代謝と比較して、Sl摂食によって誘発された全体的な代謝はより高かった。
(A) 実験設計：一般的なブタ（S1）または熟練した（Ms）草食動物に、脱塩したウツボカズラの葉を与え、模擬草食動物には、標準化された葉の位置の傷の穿刺を処理するために、Ms（W + OSMs）のOSを使用します。S1（W + OSSl）幼虫または水（W + W）。コントロール（C）は損傷のない葉です。（B）特殊代謝マップ（599 MS/MS、データファイルS1）に対して計算された誘導性（管理図と比較したRDPI）、多様性（Hj指数）および特化（δj指数）。アスタリスクは、草食動物への直接給餌とコントロールグループとの間の有意差を示します（対応のあるt検定によるStudentのt検定、*P<0.05および***P<0.001）。ns、重要ではない。 (C) 模擬草食動物処理後の主要代謝物スペクトル（青枠、アミノ酸、有機酸、糖；データファイルS2）と特殊代謝物スペクトル（赤枠 443 MS/MS；データファイルS1）の時間分解能指数。色付きの帯は95%信頼区間を示す。アスタリスクは、処理群と対照群間の有意差を示す（二次分散分析（ANOVA）、事後多重比較についてはTukeyのHSD（HSP）による有意差検定、*P<0.05、**P<0.01、*** P<0.001）。(D) 散布図と特殊代謝物プロファイルの特殊化（異なる処理を施した繰り返しサンプル）。
草食動物が誘導するメタボロームレベルのリモデリングが、個々の代謝物レベルの変化に反映されているかどうかを調べるため、まず、草食動物の抵抗性が実証されているウツボカズラ（Nepenthes pallens）の葉でこれまでに研究されてきた代謝物に焦点を当てました。フェノールアミドは、昆虫の食害過程で蓄積するヒドロキシシナミド-ポリアミン抱合体であり、昆虫のパフォーマンスを低下させることが知られています（32）。対応するMS/MSの前駆体を検索し、それらの累積速度論曲線をプロットしました（図S1）。予想通り、クロロゲン酸（CGA）やルチンなど、食害に対する防御に直接関与しないフェノール誘導体は、食害後にダウンレギュレーションされます。対照的に、草食動物はフェノールアミドを非常に強力にすることができます。2種類の草食動物の継続的な摂食により、フェノールアミドの励起スペクトルはほぼ同じになり、このパターンはフェノールアミドのde novo合成において特に顕著でした。 17-ヒドロキシゲラニルノナンジオールジテルペン配糖体（17-HGL-DTG）経路を調べると、同じ現象が観察されます。この経路は、効果的な抗草食動物機能（33）を持つ多数の非環式ジテルペンを生成し、そのうちMs. Feeding with Slは同様の発現プロファイルを引き起こしました（図S1）。
草食動物による直接摂食実験の欠点は、草食動物の葉の消費速度と摂食時間が異なることで、傷や草食動物による草食動物特有の影響を排除することが難しいことです。誘導された葉の代謝反応の草食動物種特異性をより適切に解決するために、採取したばかりのOS（OSMとOSS1）を一貫した葉の位置の標準穿刺Wに直接適用することにより、MsおよびSl幼虫の摂食をシミュレートしました。この手順はW + OS処理と呼ばれ、組織損失の速度や量の違いによる交絡効果を引き起こすことなく、草食動物によって引き起こされる反応の開始を正確にタイミングすることにより、誘導を標準化します（図2A）（34）。MS/MS分析および計算パイプラインを使用して、直接摂食実験から以前に集められたスペクトルと重複する443のMS/MSスペクトル（データファイルS1）を取得しました。このMS/MSデータセットの情報理論解析により、草食動物のシミュレーションによる葉特化メタボロームの再プログラミングは、OS特異的な誘導を示したことが示された（図2C）。特に、OSS1処理と比較して、OSMは4時間でメタボローム特化の強化を引き起こした。注目すべきは、直接草食動物摂食実験データセットと比較して、Hjとδjを座標として使用して2次元空間で視覚化された代謝動態と、時間の経過とともに模擬草食動物処理に応じたメタボローム特化の方向性が一貫して増加していることである（図2D）。同時に、アミノ酸、有機酸、糖の含有量を定量化し（データファイルS2）、このメタボロームの専門知識の標的増加が、模擬草食動物に応じた中心炭素代謝の再構成によるものかどうかを調べました（図S2）。このパターンをより明確に説明するために、先に述べたフェノールアミドおよび17-HGL-DTG経路の代謝蓄積動態をさらにモニタリングした。草食動物におけるOS特異的誘導は、フェノールアミド代謝における異なる転座パターンへと変換される（図S3）。クマリンおよびカフェオイル基を含むフェノールアミドはOSS1によって優先的に誘導され、OSMはフェルリル抱合体の特異的誘導を引き起こす。17-HGL-DTG経路では、下流のマロニル化およびジマロニル化生成物による異なるOS誘導が検出された（図S3）。
次に、OSM を使用して草食動物のロゼット植物の葉を処理することをシミュレートする、タイムコースマイクロアレイデータセットを使用して、OS によって誘発されるトランスクリプトーム可塑性について研究しました。サンプリング動態は、基本的にこのメタボロミクス研究で使用された動態と重なっています (35)。時間の経過とともに代謝可塑性が特に増加するメタボローム再構成と比較して、Ms によって誘発される葉では、トランスクリプトーム誘導性 (RDPI) と特化 (δj) が 1 時間で一過性の転写バーストが観察され、この時点での多様性 (Hj) が大幅に増加し、BMP1 の発現が大幅に減少し、続いてトランスクリプトーム特化の緩和が見られました (図 S4)。代謝遺伝子ファミリー（P450、糖転移酵素、BAHDアシルトランスフェラーゼなど）は、前述の初期高度特化モデルに従って、一次代謝由来の構造単位から特殊な代謝物を組み立てるプロセスに関与する。事例研究として、フェニルアラニン経路を解析した。解析により、フェノールアミド代謝におけるコア遺伝子は、非誘引植物と比較して草食植物で高度にOS誘導され、発現パターンが密接に整合していることが確認された。この経路の上流にある転写因子MYB8と構造遺伝子PAL1、PAL2、C4H、4CLは、早期に転写開始を示した。フェノールアミドの最終組み立てに役割を果たすアシルトランスフェラーゼ、例えばAT1、DH29、CV86は、長期にわたる上方制御パターンを示している（図S4）。上記の観察結果は、トランスクリプトーム特化の早期開始とメタボロミクス特化の後期強化が連動モードであることを示しており、これは強力な防御反応を開始する同期制御システムによるものである可能性がある。
植物ホルモンシグナル伝達の再構成は、草食動物の情報を統合して植物の生理機能を再プログラムする調節層として機能します。草食動物シミュレーション後、主要な植物ホルモンカテゴリーの累積的なダイナミクスを測定し、それらの間の時間的な共発現を可視化しました[ピアソン相関係数（PCC）> 0.4]（図3A）。予想通り、生合成に関連する植物ホルモンは、植物ホルモン共発現ネットワーク内で結びついています。さらに、代謝特異性（Siインデックス）がこのネットワークにマッピングされ、異なる処理によって誘導される植物ホルモンが強調されています。草食動物特異的な反応の2つの主要な領域が描かれています。1つはJAクラスターであり、JA（その生物学的に活性な形態であるJA-Ile）およびその他のJA誘導体は最高のSiスコアを示しています。もう1つはエチレン（ET）です。ジベレリンは草食動物特異性を中程度にしか増加させなかったのに対し、サイトカイニン、オーキシン、アブシシン酸などの他の植物ホルモンは草食動物に対する誘導特異性が低かった。W + W単独と比較して、OS処理（W + OS）によるJA誘導体のピーク値の増幅は、基本的にJAの強力な特異的指標に変換できる。意外なことに、エリシター含有量の異なるOSMとOSS1は、JAとJA-Ileの同様の蓄積を引き起こすことが知られている。OSS1とは対照的に、OSMはOSMによって特異的かつ強く誘導されるのに対し、OSS1は基底損傷に対する反応を増幅しない（図3B）。
(A) 草食動物誘導性植物ホルモン蓄積動態シミュレーションにおけるPCC計算に基づく共発現ネットワーク解析。ノードは単一の植物ホルモンを表し、ノードのサイズは処理間の植物ホルモン固有のSi指数を表す。(B) 異なる処理によって引き起こされた葉におけるJA、JA-Ile、ETの蓄積を異なる色で示す。アプリコット：W + OSM、青：W + OSSl、黒：W + W、灰色：C（対照）。アスタリスクは、処理と対照間の有意差を示す（二元配置分散分析に続いてTukey HSD事後多重比較、*** P <0.001）。 JA生合成における(C)697 MS/MS（データファイルS1）と知覚スペクトル障害（irAOCおよびirCOI1）およびETシグナル障害を伴うETR1における(D)585 MS/MS（データファイルS1）の情報理論解析。2種類の模擬草食動物処理により、植物系統および空ベクター（EV）対照植物が誘発された。アスタリスクは、W+OS処理と無損傷対照との間の有意差を示す（二元配置分散分析、Tukey HSD事後多重比較、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。（E）特化に対する散在性抵抗性の散布図。色は異なる遺伝子組み換え株を表し、記号は異なる処理方法を表す：三角形はW + OSS1、四角形はW + OSM、円はC
次に、JAとETの生合成（irAOCとirACO）と知覚（irCOI1とsETR1）の重要なステップにおいて遺伝子組み換えされた弱毒化ウツボカズラ株（irCOI1とsETR1）を使用して、これら2つの植物ホルモンの草食動物に対する代謝再プログラミングの相対的な寄与を分析します。以前の実験と一致して、空キャリア（EV）植物での草食動物-OSの誘導（図3、C〜D）と、OSMによって引き起こされたHjインデックスの全体的な減少とδjインデックスの増加を確認しました。この応答は、OSS1によって引き起こされた応答よりも顕著です。Hjとδjを座標として使用する2本の折れ線グラフは、特定の調節解除を示しています（図3E）。最も明らかな傾向は、JAシグナルを欠く株では、草食動物によって引き起こされるメタボロームの多様性と特殊化の変化がほぼ完全に排除されていることです（図3C）。対照的に、sETR1植物におけるサイレントET知覚は、草食動物の代謝変化に対する全体的な影響はJAシグナリングの影響よりもはるかに低いものの、OSMとOSS1の興奮間のHjおよびδj指標の差を減衰させます（図3Dおよび図S5）。これは、JAシグナル伝達の中核機能に加えて、ETシグナル伝達は草食動物の種特異的な代謝応答の微調整としても機能していることを示しています。この微調整機能と一致して、sETR1植物における全体的なメタボローム誘導性には変化がありませんでした。一方、sETR1植物と比較して、irACO植物は草食動物による代謝変化の全体的な振幅は同様でしたが、OSMとOSS1の刺激間ではHjおよびδjスコアが有意に異なっていました（図S5）。
草食動物の種特異的な反応に重要な寄与をする特殊な代謝物を同定し、ETシグナルを通してその生成を微調整するために、我々は以前に開発された構造MS/MS法を使用した。この方法は、バイクラスタリング法を利用して、MS/MSフラグメント[正規化ドット積（NDP）]と中性損失（NL）に基づく類似性スコアから代謝ファミリーを再推定する。ETトランスジェニックラインの解析を通して構築されたMS/MSデータセットは585のMS/MS（データファイルS1）を生成し、これを7つの主要なMS/MSモジュール（M）にクラスタリングすることによって解決した（図4A）。これらのモジュールの中には、以前に特徴付けられた特殊な代謝物が密集しているものがあり、たとえば、M1、M2、M3、M4、M7には、さまざまなフェノール誘導体（M1）、フラボノイド配糖体（M2）、アシル糖（M3とM4）、17-HGL-DTG（M7）が豊富に含まれさらに、各モジュールの単一代謝物の代謝特異的情報（Si インデックス）が計算され、その Si 分布を直感的に確認できます。つまり、高い草食性と遺伝子型特異性を示す MS/MS スペクトルは高い Si 値によって特徴付けられ、尖度統計は右尾隅に毛皮の分布を示しています。このような痩せたコロイド分布の 1 つが M1 で検出され、フェノールアミドが最も高い Si 画分を示しました（図 4B）。前述の M7 の草食誘導性 17-HGL-DTG は中程度の Si スコアを示し、2 つの OS タイプ間で中程度の差別的制御を示しています。対照的に、ルチン、CGA、アシル糖などの構成的に生成されるほとんどの特殊代謝物は、最も低い Si スコアに分類されます。特殊代謝物間の構造の複雑さと Si 分布をより詳細に調査するために、各モジュールの分子ネットワークが構築されました（図 4B）。 OD理論の重要な予測（図1Bにまとめられている）は、草食後の特殊代謝物の再編成は、特にその特異性を高めることによって（ランダムな分布とは対照的に）高い防御値を持つ代謝物の一方的な変化につながるはずであるということである（モード）MT理論によって予測される防御代謝物。M1に蓄積されたフェノール誘導体のほとんどは、昆虫のパフォーマンスの低下と機能的に関連している（32）。24時間後のEV対照植物の誘導葉と構成葉の間でM1代謝物のSi値を比較すると、草食昆虫後の多くの代謝物の代謝特異性が有意に増加傾向にあることが観察された（図4C）。 Si値の特異的な増加は防御フェノールアミドでのみ検出され、このモジュールに共存する他のフェノールおよび未知の代謝物ではSi値の増加は検出されなかった。これは特殊なモデルであり、OD理論に関連している。草食動物による代謝変化の主な予測は一貫している。フェノールアミドスペクトルのこの特異性がOS特異的ETによって誘発されたかどうかを検証するために、代謝物Si指数をプロットし、EVおよびsETR1遺伝子型におけるOSMとOSS1の発現差を調べた（図4D）。sETR1では、フェナミド誘導によるOSMとOSS1の発現差は大幅に減少した。JAが不十分な株で収集されたMS/MSデータにもバイクラスタリング法を適用し、JA制御による代謝特化に関連する主要なMS/MSモジュールを推定した（図S6）。
(A) 共有フラグメント（NDP類似度）と共有ニュートラルロス（NL類似度）に基づく585 MS/MSのクラスタリング結果から、モジュール（M）は既知の化合物ファミリーと一致するか、未知または代謝されにくい代謝物組成と一致することが分かりました。各モジュールの横には、代謝物（MS/MS）特異性（Si）分布が表示されています。（B）モジュール型分子ネットワーク：ノードはMS/MS、エッジはNDP（赤）およびNL（青）MS/MSスコア（カットオフ、> 0.6）を表します。段階的な代謝物特異性指数（Si）は、モジュールに基づいて色分けされ（左）、分子ネットワークにマッピングされています（右）。（C）EV植物のモジュールM1の構成状態（コントロール）および誘導状態（模擬草食動物）における24時間後：分子ネットワーク図（Si値はノードサイズ、防御フェノールアミドは青で強調表示）。 (D) EV および ET 知覚が障害されたスペクトル線 sETR1 の M1 分子ネットワーク図。フェノール化合物は緑の円ノードで示され、W + OSM 処理と W + OSS1 処理間の有意差 (P 値) はノード サイズで示されています。CP、N-カフェオイルチロシン。CS、N-カフェオイルスペルミジン。FP、N-フェルラ酸エステル尿酸。FS、N-フェルリルスペルミジン。CoP、N'、N "-クマロリルチロシン。DCS、N'、N"-ジカフェオイルスペルミジン。CFS、N'、N"-カフェオイル、フェルロイルスペルミジン。クコの Lycium barbarum Son。Nick。O-AS、O-アシル糖。
我々はさらに、単一の弱毒化ウツボカズラ遺伝子型から自然集団へと解析を拡張した。自然集団では、草食動物の JA レベルと特定の代謝産物レベルの強い種内変化が以前に説明されている (26)。このデータセットを使用して 43 の遺伝資源をカバーします。これらの遺伝資源は、N. pallens の植物 123 種で構成されています。これらの植物は、ユタ州、ネバダ州、アリゾナ州、カリフォルニア州のさまざまな自生地で収集された種子から採取されました (図 S7)。メタボローム多様性 (ここでは集団レベルと呼ぶ) (β 多様性) と OSM による特殊化を計算しました。以前の研究と一致して、Hj 軸と δj 軸に沿って広範囲の代謝変化が観察され、遺伝資源は草食動物に対する代謝応答の可塑性に大きな違いがあることが示されました (図 S7)。この構成は、草食動物によって引き起こされるJAs変化のダイナミックレンジに関する過去の観察結果を彷彿とさせ、単一集団において非常に高い値を維持しています（26, 36）。JAとJA-Ileを用いてHjとδjの全体レベルの相関を検証したところ、JAとメタボロームβ多様性および特化指数との間に有意な正の相関関係があることが分かりました（図S7）。これは、集団レベルで検出された草食動物誘発性のJAs誘導における不均一性は、昆虫草食動物からの選択によって引き起こされた主要な代謝多型によるものである可能性を示唆しています。
これまでの研究で、タバコの種類は、誘導性および構成性の代謝防御への依存度と種類が大きく異なることが示されています。これらの抗草食動物シグナル伝達および防御能力の変化は、昆虫個体群圧、植物ライフサイクル、および特定の種が生育するニッチにおける防御生産コストによって制御されていると考えられています。私たちは、北米と南米原産の6種のタバコ属植物について、草食動物によって誘導される葉のメタボロームリモデリングの一貫性について研究しました。これらの種は、Nepenthes North Americaと近縁であり、Nicotiana Bociflo. La、N. nicotinis、Nicotiana n. attenuated grass、Nicotiana tabacum、線状タバコ、タバコ（Nicotiana spegazzinii）、および葉タバコ（Nicotiana obtusifolia）です（図5A）（37）。これらの種のうち、よく特徴づけられているN. pleaseを含む6種はペチュニア系統の一年生植物であり、オブツシフォリアN.は姉妹系統であるトリゴノフィラエ系統の多年生植物である（38）。続いて、昆虫摂食における種レベルの代謝再編成を研究するため、これら7種に対してW + W、W + OSM、およびW + OSS1の誘導を行った。
(A) 最大尤度に基づくブートストラップ系統樹[核グルタミン合成(38)]と7つの密接に関連するニコチアナ種(異なる色)(37)の地理的分布。(B) 7つのニコチアナ種の代謝プロファイルの特殊化多様性の散布図(939 MS/MS、データファイルS1)。種レベルでは、メタボローム多様性は特殊化の程度と負の相関関係にある。代謝多様性と特殊化およびJA蓄積との種レベルの相関の分析を、図2に示す。S9。色、異なるタイプ。三角形、W + OSS1。四角形、W + OSM。(C) ニコチアナのJAとJA-Ileのダイナミクスは、OS励起振幅に従ってランク付けされています(2元配置分散分析とTukey HSD事後多重比較、* P <0.05、** P <0.01、* ** W + OSとW + Wの比較では、P <0.001)。草食性およびメチルJA（MeJA）をシミュレートした後の各種における（D）多様性と（E）特化の箱ひげ図。アスタリスクは、W + OSとW + W、またはラノリンとW（Lan + W）、またはLanとMeJA（Lan + MeJa）とLan対照群との間の有意差を示す（二元配置分散分析、その後TukeyのHSD事後多重比較、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。
デュアルクラスター法を使用して、939 MS/MS から 9 つのモジュールを識別しました (データファイル S1)。異なる処理によって再構成された MS/MS の構成は、種間で異なるモジュール間で大きく異なります (図 S8)。Hj (ここでは種レベルの γ 多様性と呼ぶ) と δj を視覚化すると、異なる種が代謝空間で非常に異なるグループに集約していることがわかります。代謝空間では、種レベルの分裂が通常、興奮よりも顕著です。N. linear と N. obliquus を除いて、これらは誘導効果の広いダイナミック レンジを示しています (図 5B)。対照的に、N. purpurea や N. obtusifolia などの種は、処理に対する代謝応答がそれほど明白ではありませんが、メタボロームはより多様です。誘導された代謝応答の種特異的な分布は、特殊化とガンマ多様性の間に有意な負の相関をもたらしました (PCC = -0.46、P = 4.9×10-8)。 OS によって引き起こされる JA レベルの変化は、メタボロームの特殊化と正の相関があり、それぞれの種が示す代謝ガンマ多様性と負の相関があります (図 5B および図 S9)。 図 5C で「シグナル応答」種と呼ばれる種、例えば Nepenthes nepenthes、Nepenthes acute、Nepenthes attenuated は、30 分で有意な兆候を引き起こしたことは注目に値します。最近の OS 特異的 JA および JA-Ile の発生は、Nepenthes mills、Nepenthes powdery、N. obtusifolia などの「シグナル非応答性」と呼ばれる他の細菌では、OS 特異性を示さずに JA-Ile Edge 誘導のみを示しています (図 5C)。代謝レベルでは、前述のように、弱毒化 Nepenthes の場合、シグナル応答性物質は OS 特異性を示し、δj を大幅に増加させ、Hj を減少させました。このOS特異的プライミング効果は、シグナル非反応性種に分類される種では検出されなかった（図5、DおよびE）。OS特異的代謝物はシグナル応答性種間でより頻繁に共有されており、これらのシグナルクラスターはシグナル応答が弱い種とクラスターを形成する一方、シグナル応答が弱い種は相互依存性が低い（図S8）。この結果は、OS特異的なJA誘導と下流メタボロームのOS特異的再構成が種レベルで連動していることを示している。
次に、メチルJA（MeJA）を含むラノリンペーストを使用して植物を処理し、これらのカップリングモードが、植物の細胞質にある外因性JAによって適用されるJAの利用可能性によって制限されるかどうかを調べました。 JAの急速な脱エステル化です。 JAの継続的な供給によって引き起こされる、シグナル応答性種からシグナル非応答性種への緩やかな変化の同じ傾向を確認しました（図5、DおよびE）。 つまり、MeJA処理は線虫、N. obliquus、N. aquaticus、N. pallens、およびN. mikimotoiのメタボロームを強力に再プログラムし、δjが大幅に増加し、Hjが減少しました。 N. purpureaはδjの増加のみを示しましたが、Hjは増加しませんでした。 以前にJAの蓄積レベルが非常に低いことが示されているN. obtusifoliaも、メタボローム再構成の点でMeJA処理にほとんど反応しません。これらの結果は、シグナル非応答性種では JA 産生またはシグナル伝達が生理的に制限されていることを示している。この仮説を検証するために、W + W、W + OSM、および W + OSS1 トランスクリプトームによって誘導される 4 種 (N. pallens、N. mills、N. pink、および N. microphylla) を調べた (39)。メタボロームリモデリングのパターンと一致して、種はトランスクリプトーム空間で十分に分離されており、その中で N. attenuated は最高の OS 誘導 RDPI を示し、N. gracilis は最低であった (図 6A)。しかし、N. oblonga によって誘導されるトランスクリプトーム多様性は 4 種の中で最も低く、以前に 7 種で示されている N. oblonga の最高のメタボローム多様性とは対照的であることが判明した。以前の研究では、JA シグナルを含む初期防御シグナルに関連する一連の遺伝子が、Nicotiana 種における草食動物関連エリシターによって誘導される初期防御応答の特異性を説明することが示されている (39)。これら4種のJAシグナル伝達経路を比較すると、興味深いパターンが明らかになりました（図6B）。AOC、OPR3、ACX、COI1など、この経路のほとんどの遺伝子は、これら4種において比較的高い誘導レベルを示しました。しかし、重要な遺伝子であるJAR4は、JAを生物学的に活性なJA-Ile蓄積転写産物に変換するのですが、その転写レベルは非常に低く、特にN. mills、Nepenthes pieris、N. microphyllaでは顕著でした。さらに、別の遺伝子AOSの転写産物のみがN. bifidumでは検出されませんでした。これらの遺伝子発現の変化は、シグナル無力種におけるJA産生の低下によって誘発される極端な表現型と、N. gracilisの誘導に関与している可能性があります。
(A) 草食誘導後30分に採取した4種の近縁タバコの初期転写応答の再プログラミングに関する情報理論解析。RDPIは、草食OSによって誘導された葉を創傷対照と比較することで算出される。色は異なる種を示し、記号は異なる処理方法を示す。(B) 4種のJAシグナル伝達経路における遺伝子発現の解析。簡略化されたJA経路は箱ひげ図の横に示されている。異なる色は異なる処理方法を示す。アスタリスクは、W + OS処理とW + W対照の間に有意差があることを示す（ペアワイズ差のスチューデントt検定では、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。OPDA：12-オキソフィトジエン酸、OPC-8：0,3-オキソ-2（2′(Z)-ペンテニル）-シクロペンタン-1-オクタン酸。
最後の部分では、異なる植物種の昆虫種特異的なメタボロームのリモデリングが、どのようにして草食動物に対して耐性を持つことができるかを研究しました。以前の研究では、Nicotiana属に重点が置かれていました。Msとlarvaに対する耐性は大きく異なります（40）。ここでは、このモデルと代謝可塑性との関係を研究しました。上記の4種のタバコを使用し、草食動物によって引き起こされるメタボロームの多様性と特殊化と、植物のMsおよびSlに対する耐性との相関関係をテストしたところ、ジェネラリストSlに対する耐性、多様性、および特殊化はすべて正の相関関係にあるのに対し、エキスパートレディに対する耐性と特殊化との相関は弱く、多様性との相関は有意ではないことがわかりました（図S10）。S1耐性に関しては、以前にJAシグナル伝達レベルとメタボローム可塑性の両方を示すことが示された弱毒化されたN. chinensisとN. gracilisはどちらも、草食動物誘導に対する応答が大きく異なり、同様に高い耐性を示しました。
過去 60 年間で、植物防御理論は理論的枠組みを提供し、研究者はそれに基づいて植物の特殊代謝物のかなりの数の進化と機能を予測してきました。これらの理論のほとんどは、強力な推論の通常の手順 (41) に従っていません。それらは同じ分析レベルで重要な予測 (3) を提案しています。重要な予測のテストによって特定の理論を分析できるようになると、この分野は前進しています。その分野は支持されますが、他の理論は拒否されます (42)。代わりに、新しい理論は異なる分析レベルで予測を行い、記述的考慮事項の新しいレイヤーを追加します (42)。ただし、機能レベルで提案された 2 つの理論、MT 理論と OD 理論は、草食動物によって引き起こされる特殊な代謝変化の重要な予測として簡単に説明できます。OD 理論は、特殊な代謝「空間」の変化は非常に方向性があると考えています。MT 理論は、これらの変化は方向性がなく、代謝空間内にランダムに配置され、防御価値の高い代謝物を持つ傾向があると考えています。 OD および MT 予測に関するこれまでの調査は、先験的な「防御」化合物の狭いセットを使用してテストされてきました。これらの代謝物中心のテストでは、草食動物の食害中のメタボローム再構成の範囲と軌跡を分析することができず、一貫した統計的枠組み内でのテストでは全体として考えることができる重要な予測を要求することができません。植物メタボロームの変化を定量化します。ここでは、計算 MS に基づくメタボロミクスの革新的な技術を使用し、情報理論記述子の一般的な通貨でデコンボリューション MS 分析を実行して、グローバルメタボロミクスレベルで提案された 2 つの違いをテストしました。この理論の重要な予測。情報理論は多くの分野で応用されていますが、特に生物多様性と栄養素フローの研究の文脈で応用されています (43)。しかし、私たちが知る限り、これは植物の代謝情報空間を記述し、環境の合図に応じた一時的な代謝変化に関連する生態学的問題を解決するために使用される最初のアプリケーションです。特に、この方法の優れた点は、植物種内および植物種間のパターンを比較し、草食動物が進化の異なる段階において、異なる種から種間の大進化パターンへとどのように進化してきたかを調べることができる点にあります。代謝。
主成分分析（PCA）は、多変量データセットを次元削減空間に変換し、データの主な傾向を説明できるようにするため、通常、デコンボリューションメタボロームなどのデータセットを解析するための探索的手法として使用されます。ただし、次元削減によってデータセットの情報内容の一部が失われ、PCAは、草食動物が専門分野（たとえば、豊富さ、分布、および豊富さ）の代謝産物の多様性をどのように再構成するかなど、生態学理論に特に関連する特性に関する定量的な情報を提供できません。特定の草食動物の誘導状態を予測する代謝産物はどれですか？特異性、多様性、誘導性の観点から、葉固有の代謝産物プロファイルの情報内容を分解し、草食動物の摂食が特定の代謝を活性化できることがわかりました。予想外にも、実装された情報理論指標で説明されているように、2 種類の草食動物 (夜食の汎用植物 Sl) とナス科の専門家 Ms. の攻撃後に、結果として生じる代謝状況に大きな重複があることが観察されました。摂食行動と濃度は大幅に異なりますが。脂肪酸アミノ酸複合体 (FAC) は OS で開始されます (31)。標準化された刺し傷を治療するために草食動物 OS を使用することで、模擬草食動物の治療でも同様の傾向が見られました。草食動物の攻撃に対する植物の反応をシミュレートするこの標準化された手順により、草食動物の摂食行動の変化によって引き起こされる交絡因子が排除され、異なる時期にさまざまな程度の損傷につながります (34)。OSM の主な原因として知られている FAC は、OSS1 における JAS およびその他の植物ホルモン反応を低下させますが、OSS1 は数百倍も低下させます (31)。ただし、OSS1 は OSM と比較して同程度の JA 蓄積を引き起こしました。弱毒化ウツボカズラにおけるJA応答はOSMに対して非常に敏感であることが既に実証されており、FACは水で1:1000に希釈されても活性を維持する（44）。したがって、OSMと比較してOSS1中のFACは非常に低い値であっても、十分なJA発生を誘導するのに十分である。これまでの研究では、ポリン様タンパク質（45）やオリゴ糖（46）がOSS1における植物防御応答を誘発する分子的手がかりとして利用できることが示されている。しかしながら、OSS1中のこれらのエリシターが、本研究で観察されたJA蓄積の原因であるかどうかは依然として不明である。
異なる草食動物や外因性のJAやSA（サリチル酸）の施用によって引き起こされる異なる代謝指紋を記述した研究はほとんどないが（47）、植物の草本ネットワークにおける草食動物の種特異的な摂動とそれが特定の個人情報に及ぼす影響を摂動した研究はない。代謝の全体的な影響は体系的に研究されている。この分析により、JA以外の他の植物ホルモンとの内部ホルモンネットワークのつながりが、草食動物によって引き起こされる代謝再編成の特異性を形作ることがさらに確認された。特に、OSMによって引き起こされるETはOSS1によって引き起こされるETよりも有意に大きいことを検出した。このモードは、OSM中のFAC含有量が多いことと一致しており、これはETバーストを誘発するための必要かつ十分な条件である（48）。植物と草食動物の相互作用の文脈では、植物特異的代謝物の動態に対するETのシグナル伝達機能はまだ散発的であり、単一の化合物グループのみをターゲットにしている。さらに、ET の調節を研究する研究のほとんどは、ET またはその前駆体またはさまざまな阻害剤の外因性適用を用いており、これらの外因性化学物質適用は多くの非特異的な副作用を引き起こす。我々の知る限り、本研究は、ET を使用して障害のあるトランスジェニック植物を生成および認識し、植物のメタボローム動態を調整することにおける ET の役割を大規模に体系的に調べた初めての研究である。草食動物特異的な ET 誘導は、最終的にメタボローム応答を調節することができる。最も重要なのは、ET 生合成 (ACO) 遺伝子と認識 (ETR1) 遺伝子のトランスジェニック操作であり、これにより草食動物特異的なフェノールアミドの新規蓄積が明らかになった。ET はプトレシン N-メチルトランスフェラーゼを制御することにより、JA 誘発性のニコチン蓄積を微調整できることが以前に示されている (49)。しかし、機械的な観点からは、ET がフェナミドの誘導を微調整する方法は明らかではない。 ETのシグナル伝達機能に加え、代謝フラックスはS-アデノシル-1-メチオニンに転換され、ポリアミノフェノールアミドへの投資を制御する。S-アデノシル-1-メチオニンはETであり、ポリアミン生合成経路の共通中間体である。ETシグナルがフェノールアミドのレベルを制御するメカニズムについては、さらなる研究が必要である。
長い間、構造不明の特殊代謝物が多数あるため、特定の代謝カテゴリーに強い関心を向けても、生物学的相互作用後の代謝多様性の時間的変化を厳密に評価することができませんでした。現在、情報理論分析に基づくと、偏りのない代謝物に基づくMS/MSスペクトル取得の主な結果は、草食動物が草食動物を食べる、または草食動物を模倣することで、葉のメタボロームの全体的な代謝多様性が低下し続ける一方で、その特殊化の程度が高まっていることです。草食動物によるメタボロームの特異性のこの一時的な増加は、トランスクリプトームの特異性の相乗的な増加と関連しています。このより大きなメタボロームの特殊化に最も寄与する特徴（より高いSi値を持つ）は、以前に特徴付けられた草食機能を持つ特殊代謝物です。このモデルはOD理論の予測と一致していますが、メタボロームの再プログラミングのランダム性に関連するMTの予測とは一致していません。しかし、このデータは混合モデル（最良の MT、図 1B）の予測とも一致しており、防御機能が不明な他の未特性代謝物は依然としてランダムな Si 分布に従う可能性があるからです。
この研究によってさらに捉えられた注目すべきパターンは、ミクロ進化レベル（単一の植物とタバコの個体群）からより大きな進化スケール（近縁のタバコ種）まで、さまざまなレベルの進化組織が「最善の防御」にあるということです。草食動物の能力には大きな違いがあります。Moore et al.（20）とKesslerとKalske（1）はそれぞれ独立して、Whittaker（50）によって最初に区別された生物多様性の3つの機能レベルを、化学的多様性の構成的および誘発された時間的変化に変換することを提案しました。これらの著者はどちらも、大規模メタボロームデータ収集の手順を要約していません。また、これらのデータから代謝多様性を計算する方法は概説されていません。この研究では、Whittaker の機能分類に若干の調整を加え、α 代謝多様性を特定の植物の MS/MS スペクトルの多様性として、β 代謝多様性を集団空間の基本的な種内代謝として考慮し、γ 代謝多様性は類似種の分析の拡張となります。
JAシグナルは、草食動物の幅広い代謝応答に必須である。しかしながら、JA生合成の種内制御がメタボローム多様性に及ぼす影響について、厳密な定量的検証は不足しており、JAシグナルが、より高次のマクロ進化スケールにおけるストレス誘発性代謝多様化の普遍的な場であるかどうかは依然として不明である。我々は、Nepenthes herbivorousの草食性はメタボロームの特殊化を誘導し、Nicotiana属の個体群内および近縁種間のメタボロームの特殊化の多様性は、JAシグナル伝達と系統的に正の相関関係にあることを観察した。さらに、JAシグナルが損なわれると、単一遺伝子型の草食動物によって誘導される代謝特異性は打ち消される（図3、CおよびE）。自然減弱したウツボカズラ個体群の代謝スペクトルの変化は主に定量的であるため、本解析における代謝βの多様性と特異性の変化は、代謝産物に富む化合物カテゴリーの強い励起によって主に引き起こされている可能性がある。これらの化合物クラスはメタボロームプロファイルの一部を支配しており、JAシグナルとの正の相関関係を示している。
近縁のタバコ種の生化学的メカニズムは非常に異なるため、代謝物は定性的な側面で具体的に識別され、より分析的です。捕捉された代謝プロファイルを情報理論で処理すると、草食動物の誘導が代謝ガンマ多様性と特化の間のトレードオフを悪化させることが明らかになりました。JAシグナルはこのトレードオフにおいて中心的な役割を果たしています。メタボローム特化の増加は主要なOD予測と一致し、JAシグナルと正の相関がありますが、JAシグナルは代謝ガンマ多様性と負の相関があります。これらのモデルは、植物のOD容量は、ミクロ進化スケールであれ、より大きな進化スケールであれ、主にJAの可塑性によって決定されることを示しています。JA生合成の欠陥を回避する外因性JA適用実験により、近縁のタバコ種は、草食動物によって誘導されるJAとメタボローム可塑性のモードと同様に、シグナル応答性種とシグナル非応答性種に区別できることがさらに明らかになりました。シグナル非応答性種は、内因性JAを産生できないため応答できず、生理学的限界に陥ります。これは、JAシグナル伝達経路におけるいくつかの重要な遺伝子（N. crescensのAOSおよびJAR4）の変異によって引き起こされる可能性があります。この結果は、これらの種間大進化パターンが、主に体内のホルモンの知覚と応答性の変化によって引き起こされる可能性があることを浮き彫りにしています。
植物と草食動物の相互作用に加えて、代謝多様性の探究は、環境への生物学的適応と複雑な表現型特性の進化の研究におけるすべての重要な理論的進歩に関連しています。現代のMS機器によって取得されるデータ量の増加に伴い、代謝多様性に関する仮説検定は、個体/カテゴリー代謝物の違いを超えてグローバル分析を実行し、予期しないパターンを明らかにすることができます。大規模分析のプロセスにおいて重要なメタファーは、データの探索に使用できる意味のあるマップを構想するという考え方です。したがって、バイアスのないMS/MSメタボロミクスと情報理論の現在の組み合わせの重要な結果は、異なる分類スケールで代謝多様性を閲覧するためのマップを構築するために使用できる単純な指標を提供することです。これは、この方法の基本要件です。ミクロ/マクロ進化と群集生態学の研究。
マクロ進化レベルでは、エーリッヒとレイヴン（51）による植物と昆虫の共進化理論の中核は、種間の代謝多様性の変化が植物系統の多様化の原因であると予測することです。しかし、この画期的な研究が発表されてから50年経ちますが、この仮説はほとんど検証されていません（52）。これは主に、長距離の植物系統間で比較可能な代謝特性の系統学的特徴によるものです。この希少性を利用して、ターゲット分析方法を固定することができます。情報理論によって処理される現在のMS/MSワークフローは、未知の代謝物（事前の代謝物選択なし）のMS/MS構造類似性を定量化し、これらのMS/MSをMS/MSのセットに変換します。したがって、専門的な代謝では、これらのマクロ進化モデルは分類スケールで比較されます。単純な統計指標。このプロセスは系統解析に似ており、事前の予測なしに配列アライメントを使用して多様化または形質進化の速度を定量化できます。
生化学レベルでは、FirnとJones（53）のスクリーニング仮説は、代謝多様性が様々なレベルで維持され、以前は無関係であった、あるいは代替された代謝物の生物学的活性を発揮するための原料を提供していることを示しています。情報理論手法は、代謝物の特異化の過程で起こるこれらの代謝物特異的な進化的遷移を、提案されている進化的スクリーニングプロセスの一部として定量化できる枠組みを提供します。これは、特定の環境における低特異性から高特異性への生物学的に活性な適応、つまり阻害された代謝物です。
概して、分子生物学の初期には重要な植物防御理論が開発され、演繹的な仮説駆動型手法が科学の進歩の唯一の手段であると広く考えられてきました。これは主に、メタボローム全体を測定するという技術的な限界によるものです。仮説駆動型手法は他の因果メカニズムを選択する際に特に有用ですが、生化学的ネットワークの理解を深める能力は、現代のデータ集約型科学で現在利用可能な計算手法よりも限られています。したがって、予測できない理論は利用可能なデータの範囲をはるかに超えているため、研究分野における進歩の仮説的公式/テストサイクルを廃止することはできません (4)。ここで紹介するメタボロミクスの計算ワークフローは、代謝多様性に関する最近の（どのように）そして最終的な（なぜ）問題への関心を再燃させ、理論に基づくデータサイエンスの新時代に貢献できると予測しています。この時代は、以前の世代にインスピレーションを与えた重要な理論を再検討した時代でした。
草食動物による直接摂食は、開花したバラ1株の淡色ウツボカズラの葉1枚に2齢幼虫またはSl幼虫を10回飼育することにより実施しました。幼虫はクランプで挟み、感染後24時間および72時間に残りの葉組織を採取して急速凍結し、代謝物を抽出しました。
高度に同期した方法で草食動物による処理をシミュレートする。方法は、布製パターンホイールを用いて、布製ガーランドの成長段階にある植物の3枚の完全に展開した葉の中央脈の両側にある3列の棘に穴を開け、直ちに1:5希釈のMSを塗布する。または、手袋をはめた指でS1 OSを穿刺傷に挿入する。上記のように葉を収穫し、処理する。前述の方法を用いて、一次代謝物と植物ホルモンを抽出する（54）。
外因性JA処理では、各種バラ6株の開花植物それぞれについて、3枚の葉柄にMeJA 150μgを含むラノリンペースト20μl（Lan + MeJA）、およびラノリンと創傷処理液20μl（Lan + W）を塗布した。対照として、純粋ラノリン20μlを用いた。葉は処理後72時間で収穫し、液体窒素で急速凍結し、使用時まで-80℃で保存した。
当研究グループでは、JAおよびETのトランスジェニック系統として、irAOC (36)、irCOI1 (55)、irACO、sETR1 (48) の4系統を同定しました。irAOCはJAおよびJA-Ileの濃度を顕著に低下させましたが、irCOI1はJAに対して感受性を示しませんでした。EVと比較して、JA-Ileの蓄積は増加しました。同様に、irACOはETの産生を減少させ、ETに対して非感受性のsETR1はEVと比較してETの産生を増加させます。
光音響レーザー分光計（Sensor Sense社製ETD-300リアルタイムETセンサー）を用いて、非侵襲的にET測定を実施しました。処理後直ちに、葉の半分を切り取り、4mlの密閉ガラスバイアルに移し、5時間以内にヘッドスペースを蓄積させました。測定中は、各バイアルに、Sensor Sense社製触媒を用いてCO2と水分を除去した純空気を毎時2リットルの流量で8分間流しました。
マイクロアレイデータは（35）で最初に発表され、国立生物工学情報センター（NCBI）の遺伝子発現総合データベース（アクセッション番号GSE30287）に保存されています。本研究では、W + OSM処理によって生じた葉と損傷を受けていない対照群のデータを抽出しました。生の強度はlog2です。統計解析の前に、Rソフトウェアパッケージを用いてベースラインを75パーセンタイルに変換し、正規化しました。
Nicotiana属の元のRNAシーケンシング（RNA-seq）データは、NCBI Short Reading Archives（SRA）から取得し、プロジェクト番号はPRJNA301787で、Zhouら（39）によって報告されたもので、（56）の説明に従って進めました。W + W、W + OSM、W + OSS1で処理されたNicotiana属の生データがこの研究で分析用に選択され、次の方法で処理されました。まず、生のRNA-seq読み取りをFASTQ形式に変換しました。HISAT2はFASTQをSAMに変換し、SAMtoolsはSAMファイルをソートされたBAMファイルに変換します。StringTieは遺伝子発現を計算するために使用され、その表現方法は、1000塩基フラグメントあたり1000万シーケンスされた転写フラグメントがあるというものです。
分析に使用したAcclaimクロマトグラフィーカラム（150 mm x 2.1 mm、粒子径2.2μm）と4 mm x 4 mmガードカラムは同じ材料でできています。Dionex UltiMate 3000超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）システムでは、以下のバイナリグラジエントを使用しています。0～0.5分：アイソクラティック90% A [脱イオン水、0.1% (v/v) アセトニトリル、0.05% ギ酸]、10% B（アセトニトリル、0.05% ギ酸）。0.5～23.5分：グラジエント相はそれぞれ10% Aと90% B。23.5～25分：アイソクラティック10% Aと90% B。流量は400μl/分です。すべての MS 分析では、正イオン化モード (キャピラリー電圧 4500 V、キャピラリー出口 130 V、乾燥温度 200°C、乾燥空気流量 10 リットル/分) で動作するエレクトロスプレー ソースを備えた四重極および飛行時間型 (qTOF) 分析装置にカラム溶出液を注入します。
データと無関係または区別がつかないMS/MSフラグメント分析（以下、MS/MS）を実行して、検出可能な代謝プロファイル全体に関する構造情報を取得します。無差別MS/MS法の概念は、四重極の質量分離ウィンドウが非常に大きい（したがって、すべての質量電荷比（m/z）信号をフラグメントとして扱う）という事実に基づいています。このため、Impact II機器はCE傾斜を作成できなかったため、衝突誘起解離衝突エネルギー（CE）値を増加させて、複数の独立した分析を実行しました。つまり、最初にUHPLC-エレクトロスプレーイオン化/qTOF-MSでシングル質量分析モード（インソースフラグメンテーションによって生成される低フラグメンテーション条件）を使用してサンプルを分析し、繰り返し周波数5 Hzでm/z 50～1500をスキャンします。 MS/MS分析の衝突ガスとして窒素を使用し、20、30、40、50 eVの4つの異なる衝突誘起解離電圧で独立した測定を実行します。測定プロセス全体を通して、四重極はm/z 50～1500の最大の質量分離ウィンドウを持ちます。フロントボディのm/zと分離幅実験を200に設定すると、質量範囲は機器の操作ソフトウェアによって自動的にアクティブになり、0 Daになります。単一質量モードと同様に質量フラグメントをスキャンします。質量キャリブレーションには、ギ酸ナトリウム（イソプロパノール50 ml、ギ酸200 μl、1M NaOH水溶液1 ml）を使用します。Brukerの高精度キャリブレーションアルゴリズムを使用して、一定期間の平均スペクトルを実行した後、データファイルがキャリブレーションされます。生データファイルをNetCDF形式に変換するには、Data Analysis v4.0ソフトウェア（Brook Dalton、ブレーメン、ドイツ）のエクスポート機能を使用します。 MS/MS データ セットは、オープン メタボロミクス データベース MetaboLights (www.ebi.ac.uk) にアクセッション番号 MTBLS1471 で保存されています。
MS/MSアセンブリは、低衝突エネルギーおよび高衝突エネルギーにおけるMS1とMS/MS品質の信号間の相関分析と新たに実装されたルールを用いることで実現できます。Rスクリプトは前駆体から生成物への分布の相関分析を実現し、C#スクリプト（https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline）はルールの実装に使用されています。
バックグラウンドノイズによる偽陽性エラーや、少数のサンプルで特定のm/z特徴を検出することによって引き起こされる誤った相関を減らすために、RパッケージXCMS（バックグラウンドノイズ補正用）の「filled peak」機能を使用して、「NA」（未検出ピーク）の強度を置き換える必要があります。fill peak機能を使用すると、データセット内に相関計算に影響を与える「0」の強度値がまだ多く存在します。次に、filled peak機能を使用した場合と使用しない場合のデータ処理結果を比較し、平均補正推定値に基づいてバックグラウンドノイズ値を計算し、これらの0の強度値を計算したバックグラウンド値に置き換えます。また、強度がバックグラウンド値の3倍を超えた特徴のみを考慮し、「真のピーク」としました。PCC計算では、サンプル前駆体（MS1）のm/z信号と、少なくとも8つの真のピークを持つフラグメントデータセットのみが考慮されます。
サンプル全体におけるプリカーサー品質特性の強度が、低衝突エネルギーまたは高衝突エネルギーにさらされた同じ品質特性の強度低下と有意に相関し、かつCAMERAによって同位体ピークとして分類されていない場合、その特性をさらに詳細に定義することができます。次に、3秒以内（ピーク保持の推定保持時間ウィンドウ）のプリカーサー-プロダクトの可能性のあるすべてのペアを計算することで、相関分析を実行します。m/z値がプリカーサー値よりも低く、データセット内のプリカーサーと同じサンプル位置でMS/MSフラグメンテーションが発生した場合にのみ、フラグメントとみなされます。
これら 2 つの簡単なルールに基づいて、識別されたプリカーサーの m/z よりも大きい m/z 値を持つ指定されたフラグメントを除外し、プリカーサーが出現するサンプル位置と指定されたフラグメントに基づきます。また、MS1 モードで生成された多くのインソース フラグメントによって生成された品質特徴を候補プリカーサーとして選択し、冗長な MS/MS 化合物を生成することもできます。このデータの冗長性を減らすために、スペクトルの NDP 類似度が 0.6 を超え、CAMERA によって注釈が付けられたクロマトグラム「pcgroup」に属する場合は、それらをマージします。最後に、異なる衝突エネルギーで同じ m/z 値を持つすべての候補ピークの中で最高強度のピークを選択することにより、プリカーサーとフラグメントに関連付けられた 4 つの CE 結果すべてを最終的なデコンボリューションされた複合スペクトルにマージします。後続の処理手順は、複合スペクトルの概念に基づいており、特定の衝突エネルギーでのみ検出できるフラグメントがあるため、フラグメンテーションの確率を最大化するために必要なさまざまな CE 条件を考慮に入れています。
代謝プロファイルの誘導性を計算するためにRDPI (30) が用いられた。代謝スペクトル多様性（Hj指数）は、MS/MS頻度分布のシャノンエントロピーを用いてMS/MS前駆体の存在量から、Martínezら(8)が示した以下の式を用いて導出される。Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) ここで、Pijはj番目のサンプル（j = 1, 2, …, m）におけるi番目のMS/MSの相対頻度に対応する（i = 1, 2, …, m）t）。
代謝特異性（Si指数）は、対象サンプル間の頻度に対する、特定のMS/MSの発現同一性として定義されます。MS/MS特異性は、Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi) として計算されます。
次の式を使用して、各jサンプルのメタボローム特異的δj指数とMS/MS特異性の平均δj = ∑i = 1mPijSiを測定する。
MS/MSスペクトルはペアでアラインメントされ、2つのスコアに基づいて類似度が計算されます。まず、標準的なNDP（コサイン相関法とも呼ばれます）を使用して、次の式でスペクトル間のセグメント類似度をスコアリングします。NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 ここで、S1とS2はそれぞれ、スペクトル1とスペクトル2、およびWS1、iとWS2の場合、iは、2つのスペクトル間のi番目の共通ピークの差が0.01 Da未満となるピーク強度に基づく重みを表します。重みは、MassBankの提案に従って、W = [ピーク強度] m [品質] n、m = 0.5、n = 2で計算されます。
2つ目のスコアリング手法として、MS/MS間で共有されるNLを解析する手法が実装されました。このために、MSフラグメンテーションプロセスで頻繁に発生する52個のNLリストと、弱毒化ウツボカズラ属（9, 26）の二次代謝産物のMS/MSスペクトルに対して以前に注釈が付けられた、より具体的なNL（データファイルS1）を使用しました。各MS/MSについて、それぞれ現在のNLと存在しないNLに対応する1と0のバイナリベクトルを作成します。ユークリッド距離の類似性に基づいて、バイナリNLベクトルの各ペアのNL類似度スコアが計算されます。
デュアルクラスタリングを行うために、Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA) の拡張版であるRパッケージDiffCoExを使用しました。MS/MSスペクトルのNDPスコアリング行列とNLスコアリング行列を用いて、DiffCoExで比較相関行列を計算しました。バイナリクラスタリングは、cutreeDynamicパラメータをmethod = “hybrid”、cutHeight = 0.9999、deepSplit = T、minClusterSize = 10に設定して行いました。DiffCoExのRソースコードは、Tesson et al. (57) の追加ファイル1からダウンロードしました。必要なR WGCNAソフトウェアパッケージは、https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNAにあります。
MS/MS 分子ネットワーク解析を実行するために、NDP および NL 類似性タイプに基づいてペアスペクトル接続を計算し、Cytoscape ソフトウェアを使用して、CyFilescape yFiles レイアウト アルゴリズム拡張アプリケーションの有機レイアウトを使用してネットワーク トポロジを視覚化しました。
データの統計解析にはRバージョン3.0.1を使用しました。統計的有意性は二元配置分散分析（ANOVA）を用いて評価し、その後、TukeyのHSD（Hostly Significant Difference）事後検定を実施しました。草食動物群と対照群の差を分析するために、同じ分散を持つ2つのサンプル群の両側分布をStudent t検定を用いて解析しました。
この記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1をご覧ください。
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