我々は以前、腸由来のトリプトファン代謝産物であるインドール-3-プロピオン酸（IPA）の血清濃度が肝線維症患者で低いことを報告した。本研究では、肥満者の肝臓におけるトランスクリプトームとDNAメチロームを血清IPA濃度との関連で調査するとともに、in vitroにおける肝星細胞（HSC）の表現型不活性化を誘導するIPAの役割についても検討した。
本研究には、クオピオ肥満外科センター（KOBS）で減量手術を受けた、2型糖尿病（T2DM）のない肥満患者116名（年齢46.8±9.3歳、BMI：42.7±5.0 kg/m²）が参加した。循環IPA濃度は液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）で測定し、肝臓トランスクリプトーム解析は全RNAシーケンスで行い、DNAメチル化解析はInfinium HumanMethylation450 BeadChipを用いて行った。ヒト肝星細胞（LX-2）をin vitro実験に使用した。
血清IPA濃度は、肝臓におけるアポトーシス、ミトファジー、および寿命経路に関与する遺伝子の発現と相関していた。AKTセリン/スレオニンキナーゼ1（AKT1）遺伝子は、肝臓の転写産物およびDNAメチル化プロファイルにおいて最も豊富で主要な相互作用遺伝子であった。IPA処理は、LX-2細胞の線維化、アポトーシス、および生存を制御することが知られている遺伝子の発現を調節することにより、アポトーシスを誘導し、ミトコンドリア呼吸を減少させ、細胞形態およびミトコンドリアダイナミクスを変化させた。
これらのデータを総合すると、IPAには治療効果の可能性があり、アポトーシスを誘導してHSCの表現型を不活性な状態へと変化させることで、HSCの活性化とミトコンドリア代謝を阻害し、肝線維化を抑制する可能性が広がることを裏付けている。
肥満とメタボリックシンドロームの蔓延は、代謝関連脂肪肝疾患（MASLD）の発生率増加と関連しており、この疾患は一般人口の25～30%に影響を及ぼしている[1]。MASLDの病因の主な結果は肝線維化であり、線維性細胞外マトリックス（ECM）の継続的な蓄積を特徴とする動的なプロセスである[2]。肝線維化に関与する主な細胞は肝星細胞（HSC）であり、静止、活性化、不活性化、老化の4つの表現型が知られている[3, 4]。HSCは活性化され、静止型から、α-平滑筋アクチン（α-SMA）とI型コラーゲン（Col-I）の発現が増加した高エネルギー需要の増殖性線維芽細胞様細胞に分化転換する可能性がある[5, 6]。肝線維化の逆転中、活性化されたHSCはアポトーシスまたは不活性化によって除去される。これらのプロセスには、線維形成遺伝子のダウンレギュレーションや生存促進遺伝子（NF-κBやPI3K/Aktシグナル伝達経路など）の調節[7, 8]、ミトコンドリアのダイナミクスと機能の変化[9]が含まれます。
腸で産生されるトリプトファン代謝産物インドール-3-プロピオン酸（IPA）の血清レベルは、MASLDを含むヒトの代謝性疾患で低下していることがわかっています[10–13]。IPAは食物繊維の摂取量と関連しており、抗酸化作用と抗炎症作用があることが知られており、食事誘発性非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）表現型をin vivoおよびin vitroで軽減します[11–14]。私たちの以前の研究では、クオピオ肥満外科手術研究（KOBS）において、肝線維症のある患者の血清IPAレベルは、肝線維症のない肥満患者よりも低いことが示されました。さらに、ヒト肝星細胞（LX-2）モデルにおいて、IPA治療により細胞接着、細胞遊走、造血幹細胞活性化の古典的なマーカーである遺伝子の発現が減少することが示され、IPAは潜在的な肝保護代謝産物であることが示されました[15]。しかし、IPAがHSCのアポトーシスとミトコンドリアの生体エネルギーを活性化することによって、どのように肝線維症の退縮を誘導するのかは依然として不明である。
本研究では、肥満だが2型糖尿病ではない（KOBS）被験者の肝臓において、血清IPAがアポトーシス、ミトファジー、および長寿経路に関与する遺伝子の発現と関連していることを明らかにした。さらに、IPAが不活性化経路を介して活性化造血幹細胞（HSC）の除去と分解を誘導することも判明した。これらの結果はIPAの新たな役割を示しており、肝線維症の退縮を促進するための潜在的な治療標的となる可能性を示唆している。
KOBSコホートにおける以前の研究では、肝線維症患者は肝線維症のない患者と比較して循環IPAレベルが低いことが示されました[15]。2型糖尿病の潜在的な交絡効果を除外するために、進行中のKOBS研究から2型糖尿病のない肥満患者116人（平均年齢±SD：46.8±9.3歳、BMI：42.7±5.0 kg/m2）（表1）を研究対象集団として募集しました[16]。すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供し、研究プロトコルはヘルシンキ宣言に従って北サヴォ郡病院の倫理委員会によって承認されました（54/2005、104/2008、27/2010）。
肝生検検体は肥満外科手術中に採取され、経験豊富な病理医によって、以前に説明した基準に従って組織学的に評価された[17, 18]。評価基準は補足表S1にまとめられており、以前に説明されている[19]。
空腹時血清サンプルを非標的液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）で分析し、メタボロミクス分析を行った（n = 116）。サンプルは、以前に記載したように、UHPLC-qTOF-MSシステム（1290 LC、6540 qTOF-MS、Agilent Technologies、Waldbronn、Karlsruhe、ドイツ）を使用して分析した19。イソプロピルアルコール（IPA）の同定は、保持時間とMS/MSスペクトルを純粋な標準物質と比較することに基づいて行った。IPAシグナル強度（ピーク面積）は、以降のすべての分析で考慮した[20]。
肝臓全体のRNAシーケンスはIllumina HiSeq 2500を使用して実施し、データは以前に記載された方法で前処理しました[19, 21, 22]。ミトコンドリア機能/生合成に影響を与える転写産物の標的差分発現解析は、MitoMiner 4.0データベース[23]から選択した1957個の遺伝子を使用して実施しました。肝臓DNAメチル化解析は、以前に記載された方法と同じ方法でInfinium HumanMethylation450 BeadChip（Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して実施しました[24, 25]。
ヒト肝星細胞（LX-2）は、Stefano Romeo教授より提供され、DMEM/F12培地（Biowest、L0093-500、1% Pen/Strep；Lonza、DE17-602E、2% FBS；Gibco、10270-106）で培養および維持した。IPAの作用用量を選択するために、LX-2細胞をDMEM/F12培地で異なる濃度のIPA（10 μM、100 μM、1 mM；Sigma、220027）で24時間処理した。さらに、HSCを不活性化するIPAの能力を調べるために、LX-2細胞を無血清培地で5 ng/ml TGF-β1（R&D systems、240-B-002/CF）と1 mM IPAで24時間共処理した。対応する溶媒対照として、TGF-β1処理には0.1% BSAを含む4 nM HClを使用し、IPA処理には0.05% DMSOを使用し、併用処理には両方を一緒に使用した。
アポトーシスは、製造元の指示に従って、7-AAD を含む FITC Annexin V アポトーシス検出キット (Biolegend、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、カタログ番号 640922) を使用して評価した。簡単に説明すると、LX-2 (1 × 10⁵ 細胞/ウェル) を 12 ウェルプレートで一晩培養し、その後、IPA または IPA と TGF-β1 の複数用量で処理した。翌日、浮遊細胞と付着細胞を回収し、トリプシン処理し、PBS で洗浄し、Annexin V 結合バッファーに再懸濁し、FITC-Annexin V と 7-AAD と共に 15 分間インキュベートした。
生細胞中のミトコンドリアは、Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific、Carlsbad、CA) を使用して酸化活性を染色した。MTR アッセイでは、LX-2 細胞を IPA および TGF-β1 と同密度でインキュベートした。24 時間後、生細胞をトリプシン処理し、PBS で洗浄した後、血清フリー培地で 100 μM MTR とともに 37 °C で 20 分間インキュベートした（既報 [ 26 ] 参照）。生細胞形態解析では、前方散乱 (FSC) および側方散乱 (SSC) パラメータを使用して、細胞サイズと細胞質の複雑さをそれぞれ解析した。
すべてのデータ（30,000イベント）はNovoCyte Quanteon（Agilent社製）を使用して取得され、NovoExpress® 1.4.1またはFlowJo V.10ソフトウェアを使用して解析されました。
酸素消費速度 (OCR) と細胞外酸性化速度 (ECAR) は、メーカーの指示に従って Seahorse XF Cell Mito Stress を搭載した Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies、Santa Clara、CA) を使用してリアルタイムで測定されました。簡単に説明すると、2 × 10⁴ 個の LX-2 細胞を XF96 細胞培養プレートに播種しました。一晩培養した後、細胞をイソプロパノール (IPA) と TGF-β1 で処理しました (補足方法 1)。データ解析は、Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator を含む Seahorse XF Wave ソフトウェアを使用して実行されました。これにより、バイオエナジェティック ヘルス インデックス (BHI) が計算されました [27]。
全RNAをcDNAに転写した。具体的な方法については、参考文献[15]を参照のこと。ヒト60Sリボソーム酸性タンパク質P0（RPLP0）およびシクロフィリンA1（PPIA）mRNAレベルを構成的遺伝子コントロールとして使用した。QuantStudio 6 proリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher、オランダ、ランズメール）をTaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit（Applied Biosystems）またはSensifast SYBR Lo-ROX Kit（Bioline、BIO 94050）とともに使用し、比較Ct値サイクリングパラメータ（ΔΔCt）および∆∆Ct法を用いて相対遺伝子発現倍率を算出した。プライマーの詳細は補足表S2およびS3に記載されている。
核DNA（ncDNA）とミトコンドリアDNA（mtDNA）は、既報[28]に記載されているように、DNeasy blood and tissue kit（Qiagen）を用いて抽出した。mtDNAの相対量は、補足方法2に詳述されているように、各標的mtDNA領域と3つの核DNA領域の幾何平均（mtDNA/ncDNA）の比を計算することによって算出した。mtDNAおよびncDNAのプライマーの詳細は、補足表S4に記載されている。
生細胞は、細胞間および細胞内ミトコンドリアネットワークを可視化するために、Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific、Carlsbad、CA) で染色した。LX-2 細胞 (1 × 10⁴ 細胞/ウェル) を、対応するガラス底培養プレート (Ibidi GmbH、Martinsried、ドイツ) 内のガラススライド上で培養した。24 時間後、生の LX-2 細胞を 37 °C で 20 分間 100 μM MTR と共にインキュベートし、細胞核を既報 [29] に従って DAPI (1 μg/ml、Sigma-Aldrich) で染色した。ミトコンドリアネットワークは、Zeiss LSM 800共焦点モジュールを搭載したZeiss Axio Observer倒立顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging GmbH、イエナ、ドイツ）を用いて、37℃、5% CO2の加湿雰囲気下で63×NA 1.3対物レンズを使用して可視化した。各サンプルタイプについて10枚のZシリーズ画像を取得した。各Zシリーズは30枚の切片からなり、各切片の厚さは9.86 μmである。各サンプルについて、ZEN 2009ソフトウェア（Carl Zeiss Microimaging GmbH、イエナ、ドイツ）を使用して10種類の視野の画像を取得し、補足方法3に詳述されているパラメータに従ってImageJソフトウェア（v1.54d）[30, 31]を使用してミトコンドリア形態解析を行った。
細胞は、0.1 Mリン酸緩衝液中の2%グルタルアルデヒドで固定し、続いて1%四酸化オスミウム溶液（Sigma Aldrich、米国ミズーリ州）で固定し、アセトン（Merck、ドイツ・ダルムシュタット）で徐々に脱水し、最後にエポキシ樹脂に包埋した。超薄切片を作製し、1%酢酸ウラニル（Merck、ドイツ・ダルムシュタット）と1%クエン酸鉛（Merck、ドイツ・ダルムシュタット）で染色した。超微細構造画像は、加速電圧80 kVのJEM 2100F EXII透過型電子顕微鏡（日本電子株式会社、東京都）を用いて取得した。
IPAで24時間処理したLX-2細胞の形態は、ツァイス倒立型光学顕微鏡（Zeiss Axio Vert.A1およびAxioCam MRm、ドイツ、イエナ）を用いて50倍の倍率で位相差顕微鏡観察により分析した。
臨床データは、平均値±標準偏差または中央値（四分位範囲：IQR）で表した。3つの研究グループ間の差を比較するために、一元配置分散分析（連続変数）またはχ²検定（カテゴリ変数）を使用した。多重検定の補正には偽陽性率（FDR）を使用し、FDR < 0.05の遺伝子を統計的に有意とみなした。CpG DNAメチル化とIPAシグナル強度との相関を調べるためにスピアマン相関分析を使用し、名目上のp値（p < 0.05）を報告した。
パスウェイ解析は、ウェブベースの遺伝子セット解析ツール（WebGestalt）を用いて、循環血清IPA濃度と関連する3093個の肝臓転写産物のうち、268個の転写産物（名目p < 0.01）、119個のミトコンドリア関連転写産物（名目p < 0.05）、および4350個のCpGについて実施した。重複遺伝子の検索には、無料で利用可能なVenny DB（バージョン2.1.0）ツールを使用し、タンパク質間相互作用の可視化にはStringDB（バージョン11.5）を使用した。
LX-2実験では、サンプルはD'Agostino-Pearson検定を用いて正規性の検定を行った。データは少なくとも3つの生物学的複製から得られ、Bonferroni事後検定を用いた一元配置分散分析（ANOVA）に供した。p値が0.05未満の場合を統計的に有意とした。データは平均値±標準偏差で示し、各図に実験回数を記載した。すべての解析およびグラフ作成は、Windows版GraphPad Prism 8統計ソフトウェア（GraphPad Software Inc.、バージョン8.4.3、米国サンディエゴ）を用いて行った。
まず、血清IPAレベルと肝臓、全身、ミトコンドリアの転写産物との関連性を調査した。全転写産物プロファイルでは、血清IPAレベルと最も強く関連する遺伝子はMAPKAPK3（FDR = 0.0077、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ3）であった。ミトコンドリア関連の転写産物プロファイルでは、最も強く関連する遺伝子はAKT1（FDR = 0.7621、AKTセリン/スレオニンキナーゼ1）であった（追加ファイル1および追加ファイル2）。
次に、グローバル転写産物（n = 268、p < 0.01）とミトコンドリア関連転写産物（n = 119、p < 0.05）を解析し、最終的にアポトーシスが最も重要な標準経路であることを確認しました（p = 0.0089）。血清IPAレベルに関連するミトコンドリア転写産物については、アポトーシス（FDR = 0.00001）、ミトファジー（FDR = 0.00029）、およびTNFシグナル伝達経路（FDR = 0.000006）に焦点を当てました（図1A、表2、および補足図1A-B）。
血清IPAレベルとの関連におけるヒト肝臓のグローバル転写産物、ミトコンドリア関連転写産物、およびDNAメチル化の重複解析。Aは、血清IPAレベルに関連する3092個のCpGサイトにマッピングされた268個のグローバル転写産物、119個のミトコンドリア関連転写産物、およびDNAメチル化転写産物を表す（グローバル転写産物およびDNAメチル化転写産物のp値<0.01、ミトコンドリア転写産物のp値<0.05）。主な重複転写産物は中央に示されている（AKT1およびYKT6）。B 最も高い相互作用スコア（0.900）を持つ13個の遺伝子と他の遺伝子との相互作用マップは、オンラインツールStringDBを使用して、血清IPAレベルと有意に関連する56個の重複遺伝子（黒線領域）から構築された。緑：Gene Ontology（GO）細胞構成要素：ミトコンドリア（GO：0005739）にマッピングされた遺伝子。 AKT1は、データ（テキストマイニング、実験、データベース、共発現に基づく）に基づくと、他のタンパク質との相互作用において最も高いスコア（0.900）を持つタンパク質です。ネットワークのノードはタンパク質を表し、エッジはタンパク質間の接続を表します。
腸内細菌叢の代謝産物はDNAメチル化を介してエピジェネティックな組成を調節できるため[32]、血清IPAレベルが肝臓のDNAメチル化と関連しているかどうかを調査しました。血清IPAレベルと関連する2つの主要なメチル化部位は、プロリン-セリンリッチ領域3（C19orf55）と熱ショックタンパク質ファミリーB（小）メンバー6（HSPB6）の近くにあることがわかりました（追加ファイル3）。4350 CpGのDNAメチル化（p < 0.01）は血清IPAレベルと相関しており、長寿調節経路に豊富でした（p = 0.006）（図1A、表2、および補足図1C）。
ヒト肝臓における血清IPAレベル、グローバル転写産物、ミトコンドリア関連転写産物、およびDNAメチル化の関連性の根底にある生物学的メカニズムを理解するために、以前のパスウェイ解析で同定された遺伝子の重複解析を実施しました（図1A）。重複する56個の遺伝子（図1Aの黒線内）のパスウェイ濃縮解析の結果、アポトーシス経路（p = 0.00029）が、ベン図（補足図2および図1A）に示すように、3つの解析に共通する2つの遺伝子、AKT1とYKT6（YKT6 v-SNAREホモログ）を強調していることが示されました。興味深いことに、AKT1（cg19831386）とYKT6（cg24161647）は血清IPAレベルと正の相関があることが分かりました（追加ファイル3）。遺伝子産物間の潜在的なタンパク質相互作用を特定するために、重複する56個の遺伝子の中から共通領域スコアが最も高い13個の遺伝子（0.900）を選択し、相互作用マップを作成しました。信頼度レベル（周辺信頼度）によると、最も高いスコア（0.900）を持つAKT1遺伝子が上位にありました（図1B）。
経路解析に基づき、アポトーシスが主要な経路であることが判明したため、IPA処理がin vitroでのHSCのアポトーシスに影響を与えるかどうかを調査した。我々は以前、異なる濃度のIPA（10 μM、100 μM、および1 mM）がLX-2細胞に対して無毒であることを示した[15]。この研究では、10 μMおよび100 μMでのIPA処理により、生存細胞および壊死細胞の数が増加した。しかし、対照群と比較して、1 mM IPA濃度では細胞生存率が低下したが、細胞壊死率は変化しなかった（図2A、B）。次に、LX-2細胞でアポトーシスを誘導する最適な濃度を見つけるために、10 μM、100 μM、および1 mM IPAを24時間試験した（図2A-Eおよび補足図3A-B）。興味深いことに、IPA 10 μMと100 μMはアポトーシス率（％）を低下させたが、IPA 1 mMは対照と比較して後期アポトーシスとアポトーシス率（％）を増加させたため、さらなる実験のために選択された（図2A～D）。
IPAはLX-2細胞のアポトーシスを誘導する。アネキシンVと7-AADの二重染色法を用いて、フローサイトメトリーによりアポトーシス率と細胞形態を定量化した。BA細胞を10 μM、100 μM、1 mMのIPAで24時間、またはF-H TGF-β1（5 ng/ml）と1 mMのIPAを無血清培地で24時間インキュベートした。A：生細胞（アネキシンV-/7AAD-）；B：壊死細胞（アネキシンV-/7AAD+）；C、F：初期（アネキシンV+/7AAD-）；D、G：後期（アネキシンV+/7AAD+）；E、H：アポトーシス率（%）における初期および後期アポトーシス細胞の総数の割合。データは平均値±標準偏差で表され、n = 3回の独立した実験である。統計的比較は、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置分散分析によって行った。*p < 0.05; ****p < 0.0001
以前にも示したように、5 ng/ml TGF-β1 は、古典的なマーカー遺伝子の発現を増加させることにより HSC の活性化を誘導することができます [15]。LX-2 細胞を 5 ng/ml TGF-β1 と 1 mM IPA を組み合わせて処理しました (図 2E–H)。TGF-β1 処理ではアポトーシス率に変化はありませんでしたが、IPA の併用処理では、TGF-β1 処理と比較して後期アポトーシスとアポトーシス率 (%) が増加しました (図 2E–H)。これらの結果は、1 mM IPA が TGF-β1 誘導とは独立して LX-2 細胞のアポトーシスを促進できることを示しています。
さらに、LX-2細胞におけるIPAのミトコンドリア呼吸への影響を調べた。その結果、1 mMのIPAは、対照群と比較して、酸素消費速度（OCR）パラメータ（非ミトコンドリア呼吸、基礎呼吸、最大呼吸、プロトンリーク、ATP産生）を低下させたが（図3A、B）、生体エネルギー健康指数（BHI）は変化しなかった。
IPAはLX-2細胞のミトコンドリア呼吸を減少させる。ミトコンドリア呼吸曲線（OCR）は、ミトコンドリア呼吸パラメータ（非ミトコンドリア呼吸、基礎呼吸、最大呼吸、プロトンリーク、ATP生成、SRC、およびBHI）として示される。細胞AおよびBは、それぞれ10 μM、100 μM、および1 mMのIPAで24時間インキュベートした。細胞CおよびDは、それぞれ血清フリー培地中でTGF-β1（5 ng/ml）および1 mMのIPAで24時間インキュベートした。すべての測定値は、CyQuantキットを使用してDNA含有量で正規化した。BHI：生体エネルギー健康指数；SRC：呼吸予備能；OCR：酸素消費速度。データは、平均値±標準偏差（SD）として示され、n = 5の独立した実験である。統計的比較は、一元配置分散分析およびボンフェローニ事後検定を使用して行った。 *p < 0.05; **p < 0.01; および ***p < 0.001
IPAがTGF-β1活性化LX-2細胞の生体エネルギープロファイルに及ぼす影響をより包括的に理解するために、OCRによるミトコンドリア酸化リン酸化を分析した（図3C、D）。その結果、TGF-β1処理は、対照群と比較して最大呼吸、呼吸予備能（SRC）、およびBHIを低下させることが示された（図3C、D）。さらに、併用処理は基礎呼吸、プロトンリーク、およびATP産生を低下させたが、SRCおよびBHIはTGF-β1処理群よりも有意に高かった（図3C、D）。
また、Seahorseソフトウェアが提供する「細胞エネルギー表現型テスト」も実施しました（補足図4A～D）。補足図3Bに示すように、TGF-β1処理後にはOCRとECARの両方の代謝ポテンシャルが低下しましたが、併用療法群とIPA処理群では対照群と比較して差は見られませんでした。さらに、OCRの基礎レベルとストレスレベルの両方が、対照群と比較して併用療法とIPA処理後に低下しました（補足図4C）。興味深いことに、併用療法でも同様のパターンが観察され、TGF-β1処理と比較してECARの基礎レベルとストレスレベルに変化は見られませんでした（補足図4C）。HSCでは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の減少と、TGF-β1処理後のSCRとBHIを回復させる併用療法の能力は、代謝ポテンシャル（OCRとECAR）を変化させませんでした。これらの結果を総合すると、IPAはHSCの生体エネルギーを低下させる可能性があり、IPAはHSCの表現型を不活性化へとシフトさせる低いエネルギープロファイルを誘導する可能性があることを示唆している（補足図4D）。
IPAがミトコンドリアのダイナミクスに及ぼす影響は、ミトコンドリアの形態とネットワーク接続の3次元定量化とMTR染色を用いて調査した（図4および補足図5）。図4は、対照群と比較して、TGF-β1処理により平均表面積、分岐数、総分岐長、分岐接合数が減少し（図4AおよびB）、ミトコンドリアの割合が球形から中間形態に変化したことを示している（図4C）。対照群と比較して、平均ミトコンドリア体積が減少し、ミトコンドリアの割合が球形から中間形態に変化したのはIPA処理のみであった（図4A）。対照的に、球形度、平均分岐長、およびミトコンドリア膜電位依存性MTRによって評価されたミトコンドリア活性（図4AおよびE）は変化せず、これらのパラメータは群間で差がなかった。これらの結果を総合すると、TGF-β1とIPAによる処理は、生きたLX-2細胞におけるミトコンドリアの形状とサイズ、およびネットワークの複雑さを調節するようであることが示唆される。
IPAはLX-2細胞のミトコンドリアダイナミクスとミトコンドリアDNA量を変化させる。A. 血清フリー培地でTGF-β1（5 ng/ml）と1 mM IPAを24時間インキュベートした生きたLX-2細胞の代表的な共焦点画像。ミトコンドリアネットワークはMitotracker™ Red CMXRosで染色され、核はDAPIで青く染色されている。すべてのデータには、グループごとに少なくとも15枚の画像が含まれている。各サンプルタイプについて10枚のZスタック画像を取得した。各Z軸シーケンスには、厚さ9.86 μmのスライスが30枚含まれている。スケールバー：10 μm。B. 画像に適応閾値を適用して識別された代表的なオブジェクト（ミトコンドリアのみ）。各グループのすべての細胞について、ミトコンドリア形態ネットワーク接続の定量的分析と比較を行った。C. ミトコンドリア形状比の頻度。 0に近い値は球形、1に近い値は糸状であることを示します。D ミトコンドリアDNA（mtDNA）含有量は、材料と方法に記載されているように測定しました。E Mitotracker™ Red CMXRos分析は、材料と方法に記載されているように、フローサイトメトリー（30,000イベント）で実施しました。データは平均値±標準偏差（n = 3回の独立した実験）として示されています。統計的比較は、一元配置分散分析とボンフェローニ事後検定を使用して行いました。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
次に、ミトコンドリア数の指標としてLX-2細胞のmtDNA含有量を分析した。対照群と比較して、TGF-β1処理群ではmtDNA含有量が増加した（図4D）。TGF-β1処理群と比較して、併用処理群ではmtDNA含有量が減少した（図4D）。これは、IPAがmtDNA含有量、ひいてはミトコンドリア数、さらにはミトコンドリア呼吸を減少させる可能性を示唆している（図3C）。さらに、IPAは併用処理においてmtDNA含有量を減少させたが、MTRを介したミトコンドリア活性には影響を与えなかった（図4A～C）。
我々は、LX-2細胞における線維化、アポトーシス、生存、およびミトコンドリアダイナミクスに関連する遺伝子のmRNAレベルとIPAとの関連性を調査した（図5A～D）。対照群と比較して、TGF-β1処理群では、コラーゲンI型α2鎖（COL1A2）、α平滑筋アクチン（αSMA）、マトリックスメタロプロテイナーゼ2（MMP2）、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子1（TIMP1）、およびダイナミン1様遺伝子（DRP1）などの遺伝子の発現が増加しており、線維化と活性化の増加を示している。さらに、対照群と比較して、TGF-β1処理は核プレグナンX受容体（PXR）、カスパーゼ8（CASP8）、MAPKAPK3、B細胞α阻害因子、核因子κ遺伝子軽ペプチド増強因子（NFκB1A）、および核因子κBキナーゼサブユニットβ阻害因子（IKBKB）のmRNAレベルを低下させた（図5A～D）。TGF-β1処理と比較して、TGF-β1とIPAの併用処理はCOL1A2とMMP2の発現を低下させたが、PXR、TIMP1、B細胞リンパ腫-2（BCL-2）、CASP8、NFκB1A、NFκB1-β、およびIKBKBのmRNAレベルを上昇させた。 IPA処理により、MMP2、Bcl-2関連タンパク質X（BAX）、AKT1、視神経萎縮タンパク質1（OPA1）、およびミトコンドリア融合タンパク質2（MFN2）の発現が有意に減少したが、CASP8、NFκB1A、NFκB1B、およびIKBKBの発現は対照群と比較して増加した。しかし、カスパーゼ-3（CASP3）、アポトーシスペプチダーゼ活性化因子1（APAF1）、ミトコンドリア融合タンパク質1（MFN1）、および分裂タンパク質1（FIS1）の発現には差は見られなかった。これらの結果を総合すると、IPA処理は線維化、アポトーシス、生存、およびミトコンドリアダイナミクスに関連する遺伝子の発現を調節することを示唆している。我々のデータは、IPA処理がLX-2細胞の線維化を減少させると同時に、表現型を不活性化方向にシフトさせることで生存を促進することを示唆している。
IPAはLX-2細胞における線維芽細胞、アポトーシス、生存率、およびミトコンドリアダイナミクス遺伝子の発現を調節する。ヒストグラムは、LX-2細胞を無血清培地中でTGF-β1とIPAで24時間誘導した後の、内因性コントロール（RPLP0またはPPIA）に対するmRNA発現量を示す。Aは線維芽細胞、Bはアポトーシス細胞、Cは生存細胞、Dはミトコンドリアダイナミクス遺伝子の発現を示す。データは平均値±標準偏差（SD）で示し、n=3回の独立した実験である。統計的比較は、一元配置分散分析（ANOVA）とボンフェローニ事後検定を用いて行った。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
次に、フローサイトメトリーにより細胞サイズ（FSC-H）と細胞質複雑性（SSC-H）の変化を評価し（図6A、B）、IPA処理後の細胞形態の変化を透過型電子顕微鏡（TEM）と位相差顕微鏡で評価した（補足図6A-B）。予想通り、TGF-β1処理群の細胞は対照群と比較してサイズが大きくなり（図6A、B）、粗面小胞体（ER*）とファゴリソソーム（P）の典型的な拡張が見られ、造血幹細胞（HSC）の活性化を示した（補足図6A）。しかし、TGF-β1処理群と比較して、TGF-β1とIPAの併用処理群では細胞サイズ、細胞質複雑性（図6A、B）、およびER*含有量が減少した（補足図6A）。さらに、IPA処理により、対照群と比較して細胞サイズ、細胞質の複雑性（図6A、B）、PおよびER*含有量（補足図6A）が減少した。加えて、IPA処理24時間後には、対照群と比較してアポトーシス細胞の含有量が増加した（白い矢印、補足図6B）。これらの結果を総合すると、1 mMのIPAはHSCのアポトーシスを刺激し、TGF-β1によって誘導される細胞形態パラメータの変化を逆転させ、それによって細胞サイズと複雑性を調節し、HSCの不活性化と関連している可能性があることが示唆される。
IPAはLX-2細胞の細胞サイズと細胞質の複雑性を変化させる。フローサイトメトリー分析の代表的な画像。分析では、LX-2細胞に特異的なゲーティング戦略を使用した。細胞集団を定義するためにSSC-A/FSC-A、二重細胞を識別するためにFSC-H/FSC-A、細胞サイズと複雑性分析のためにSSC-H/FSC-Hを使用した。細胞をTGF-β1（5 ng/ml）と1 mM IPAとともに無血清培地で24時間インキュベートした。LX-2細胞は、細胞サイズと細胞質の複雑性分析のために、左下象限（SSC-H-/FSC-H-）、左上象限（SSC-H+/FSC-H-）、右下象限（SSC-H-/FSC-H+）、右上象限（SSC-H+/FSC-H+）に分配した。 B. 細胞形態は、FSC-H（前方散乱光、細胞サイズ）およびSSC-H（側方散乱光、細胞質複雑性）を用いたフローサイトメトリーにより解析した（30,000イベント）。データは平均値±標準偏差（n=3回の独立した実験）として示した。統計的比較は、一元配置分散分析およびボンフェローニ事後検定を用いて行った。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001、****p < 0.0001
IPAなどの腸内代謝物は研究のホットトピックとなっており、腸内細菌叢に新たな標的が発見される可能性を示唆している。したがって、ヒトの肝線維症と関連付けられている代謝物であるIPA[15]が、動物モデルで潜在的な抗線維化化合物であることが示されていることは興味深い[13, 14]。本研究では、2型糖尿病（T2D）のない肥満者において、血清IPAと肝臓全体のトランスクリプトミクスおよびDNAメチル化との関連性を初めて実証し、アポトーシス、ミトファジー、長寿、および肝臓恒常性を調節する可能性のある候補遺伝子AKT1を強調した。本研究のもう1つの新規性は、LX-2細胞におけるIPA処理とアポトーシス、細胞形態、ミトコンドリア生体エネルギーおよびダイナミクスとの相互作用を実証したことであり、HSC表現型を不活性化にシフトさせる低エネルギースペクトルを示し、IPAが肝線維症の改善の潜在的な候補であることを示唆している。
循環血清IPAに関連する肝臓遺伝子に豊富に含まれる最も重要な標準経路は、アポトーシス、ミトファジー、および寿命であることがわかりました。ミトコンドリア品質管理（MQC）システムの破壊は、ミトコンドリア機能不全、ミトファジー、およびアポトーシスにつながり、それによってMASLDの発生を促進します[33、34]。したがって、IPAは肝臓におけるアポトーシス、ミトファジー、および寿命を介して細胞ダイナミクスとミトコンドリアの完全性を維持することに関与している可能性があると推測できます。私たちのデータは、3つのアッセイに共通する2つの遺伝子、YKT6とAKT1を示しました。YKT6は細胞膜融合のプロセスに関与するSNAREタンパク質であることは注目に値します。 YKT6は、オートファゴソーム上でSTX17およびSNAP29と開始複合体を形成することにより、オートファゴソームとリソソームの融合を促進することで、オートファジーとミトファジーに役割を果たします[35]。さらに、YKT6機能の喪失はミトファジーの障害を引き起こし[36]、YKT6のアップレギュレーションは肝細胞癌（HCC）の進行と関連しており、細胞生存率の増加を示しています[37]。一方、AKT1は最も重要な相互作用遺伝子であり、PI3K/AKTシグナル伝達経路、細胞周期、細胞移動、増殖、焦点接着、ミトコンドリア機能、コラーゲン分泌など、肝疾患において重要な役割を果たします[38–40]。活性化された PI3K/AKT シグナル伝達経路は、細胞外マトリックス (ECM) の産生を担う造血幹細胞 (HSC) を活性化することができ、その調節異常は肝線維症の発生と進行に寄与する可能性がある [40]。さらに、AKT は p53 依存性細胞アポトーシスを阻害する主要な細胞生存因子の 1 つであり、AKT の活性化は肝細胞アポトーシスの阻害と関連している可能性がある [41, 42]。得られた結果は、IPA が肝細胞のアポトーシスへの移行または生存の決定に影響を与えることにより、肝ミトコンドリア関連アポトーシスに関与している可能性があることを示唆している。これらの効果は、肝臓の恒常性に重要な AKT および/または YKT6 候補遺伝子によって制御されている可能性がある。
我々の結果は、1 mM IPA が TGF-β1 処理とは無関係に LX-2 細胞でアポトーシスを誘導し、ミトコンドリア呼吸を減少させることを示した。アポトーシスは線維症の解消と造血幹細胞 (HSC) の活性化の主要な経路であり、肝線維症の可逆的な生理的反応における重要なイベントでもあることは注目に値する [4, 43]。さらに、併用処理後の LX-2 細胞における BHI の回復は、ミトコンドリア生体エネルギーの調節における IPA の潜在的な役割に関する新たな洞察をもたらした。静止状態および不活性状態では、造血細胞は通常、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を利用して ATP を生成し、代謝活性は低い。一方、HSC の活性化は、解糖状態への移行に伴うエネルギー需要を補償するために、ミトコンドリア呼吸と生合成を増強する [44]。 IPAが代謝能とECARに影響を与えなかったという事実は、解糖経路の優先順位が低いことを示唆している。同様に、別の研究では、1 mM IPAが心筋細胞、ヒト肝細胞株（Huh7）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）のミトコンドリア呼吸鎖活性を調節できることが示された。しかし、心筋細胞の解糖にはIPAの影響は見られず、IPAが他の細胞タイプの生体エネルギーに影響を与える可能性があることが示唆された[45]。したがって、1 mM IPAはmtDNAの量を変えることなく線維形成遺伝子発現、細胞形態、ミトコンドリア生体エネルギーを大幅に減少させることができるため、穏やかな化学的脱共役剤として作用する可能性があると推測される[46]。ミトコンドリア脱共役剤は、培養誘発性線維症およびHSC活性化を阻害し[47]、脱共役タンパク質（UCP）やアデニンヌクレオチド転座酵素（ANT）などの特定のタンパク質によって調節または誘導されるミトコンドリアATP産生を減少させる。細胞の種類によっては、この現象は細胞をアポトーシスから保護したり、アポトーシスを促進したりする可能性がある[46]。しかし、造血幹細胞の不活性化におけるミトコンドリア脱共役剤としてのIPAの役割を解明するには、さらなる研究が必要である。
次に、ミトコンドリア呼吸の変化が、生きたLX-2細胞のミトコンドリア形態に反映されるかどうかを調べた。興味深いことに、TGF-β1処理はミトコンドリアの割合を球形から中間形に変化させ、ミトコンドリアの分岐が減少し、ミトコンドリア分裂の重要な因子であるDRP1の発現が増加する[48]。さらに、ミトコンドリアの断片化は全体的なネットワークの複雑さと関連しており、融合から分裂への移行は造血幹細胞（HSC）の活性化に重要であり、ミトコンドリア分裂の阻害はHSCのアポトーシスにつながる[49]。したがって、我々の結果は、TGF-β1処理が、活性化された造血幹細胞（HSC）に関連するミトコンドリア分裂でより一般的な分岐の減少を伴うミトコンドリアネットワークの複雑さの低下を誘導する可能性があることを示している。さらに、我々のデータは、IPAがミトコンドリアの球形から中間形への割合を変化させ、それによってOPA1とMFN2の発現を減少させることを示した。研究によると、OPA1のダウンレギュレーションはミトコンドリア膜電位の低下を引き起こし、細胞のアポトーシスを誘発する可能性がある[50]。MFN2はミトコンドリア融合とアポトーシスを媒介することが知られている[51]。得られた結果は、TGF-β1および/またはIPAによるLX-2細胞の誘導が、ミトコンドリアの形状とサイズ、ならびに活性化状態とネットワークの複雑さを調節しているように見えることを示唆している。
我々の結果は、TGFβ-1とIPAの併用療法が、アポトーシス回避細胞における線維化、アポトーシス、および生存関連遺伝子のmRNA発現を調節することにより、mtDNAと細胞形態学的パラメータを減少させる可能性があることを示している。実際、IPAはAKT1およびCOL1A2やMMP2などの重要な線維化遺伝子のmRNA発現レベルを低下させたが、アポトーシスに関連するCASP8の発現レベルを増加させた。我々の結果は、IPA処理後、BAX発現が減少し、TIMP1ファミリーサブユニット、BCL-2、およびNF-κBのmRNA発現が増加したことを示しており、IPAがアポトーシスを回避する造血幹細胞（HSC）の生存シグナルを刺激する可能性があることを示唆している。これらの分子は、活性化された造血幹細胞において生存促進シグナルとして作用する可能性があり、これは抗アポトーシス蛋白質（Bcl-2など）の発現増加、プロアポトーシス性BAXの発現減少、およびTIMPとNF-κBの複雑な相互作用に関連している可能性がある[5, 7]。IPAはPXRを介して作用し、TGF-β1とIPAの併用治療によりPXR mRNA発現レベルが増加し、HSC活性化の抑制が示された。活性化されたPXRシグナル伝達は、in vivoとin vitroの両方でHSC活性化を阻害することが知られている[52, 53]。我々の結果は、IPAがアポトーシスの促進、線維化とミトコンドリア代謝の減少、および生存シグナルの増強によって活性化HSCの除去に関与する可能性があることを示している。これらは、活性化HSC表現型を不活性化表現型に変換する典型的なプロセスである。 IPAのアポトーシスにおける潜在的なメカニズムと役割に関するもう1つの可能性のある説明は、主にミトファジー（内在性経路）と外因性TNFシグナル伝達経路（表1）を介して機能不全のミトコンドリアを除去することであり、これはNF-κB生存シグナル伝達経路に直接リンクしている（補足図7）。興味深いことに、IPA関連の濃縮遺伝子はアポトーシス経路でアポトーシス促進シグナルと生存促進シグナルを誘導することができ[54]、IPAがこれらの遺伝子と相互作用することによってアポトーシス経路または生存を誘導する可能性があることを示唆している。しかし、HSC活性化中にIPAがどのようにアポトーシスまたは生存を誘導するか、およびそのメカニズム経路は依然として不明である。
IPAは、腸内細菌叢を介して食事由来のトリプトファンから生成される微生物代謝物です。研究により、腸内環境において抗炎症作用、抗酸化作用、およびエピジェネティック調節作用を有することが示されています。[55] また、IPAは腸管バリア機能を調節し、酸化ストレスを軽減することが示されており、これが局所的な生理作用に寄与している可能性があります。[56] 実際、IPAは循環を介して標的臓器に運ばれ、トリプトファン、セロトニン、およびインドール誘導体と類似した主要代謝物構造を共有しているため、IPAは競合的な代謝運命をもたらす代謝作用を発揮します。[52] IPAは、酵素または受容体上の結合部位をめぐってトリプトファン由来の代謝物と競合し、正常な代謝経路を阻害する可能性があります。このことから、治療域をよりよく理解するために、その薬物動態および薬力学に関するさらなる研究が必要であることが強調されます。[57]これが造血幹細胞（HSC）でも起こり得るかどうかは、今後の研究で明らかになるだろう。
本研究にはいくつかの限界があることを認識しています。IPAに関連する関連性を具体的に検討するため、2型糖尿病（T2DM）患者を除外しました。このため、本研究結果の2型糖尿病および進行性肝疾患患者への適用範囲が制限されることを認識しています。ヒト血清中のIPAの生理的濃度は1～10μMですが[11, 20]、1mMのIPA濃度は、最も毒性のない濃度[15]と最も高いアポトーシス率に基づいて選択され、壊死細胞集団の割合に差はありませんでした。本研究では生理的濃度を超えるIPAを使用しましたが、IPAの有効用量については現在コンセンサスが得られていません[52]。本研究の結果は有意ですが、IPAのより広範な代謝運命は依然として活発な研究分野です。さらに、血清IPAレベルと肝臓転写産物のDNAメチル化との関連性に関する我々の知見は、造血幹細胞（HSC）だけでなく肝臓組織からも得られた。我々は、IPAが造血幹細胞（HSC）の活性化と関連しているという以前のトランスクリプトーム解析の知見[15]に基づき、ヒトLX-2細胞を使用することを選択した。HSCは肝線維化の進行に関与する主要な細胞である。肝臓は複数の細胞型から構成されているため、IPAの役割と他の肝細胞型との相互作用を研究するには、カスパーゼ活性化とDNA断片化、およびタンパク質レベルを含む作用機序と組み合わせた肝細胞-HSC-免疫細胞共培養システムなどの他の細胞モデルも考慮する必要がある。