我々は以前、肝線維症患者において腸管由来トリプトファン代謝物であるインドール-3-プロピオン酸（IPA）の血清レベルが低いことを報告した。本研究では、肥満肝臓におけるトランスクリプトームおよびDNAメチロームと血清IPAレベルの関連性、ならびにin vitroにおける肝星細胞（HSC）の表現型不活化誘導におけるIPAの役割について検討した。
本研究には、クオピオ肥満外科センター（KOBS）で肥満手術を受けた、2型糖尿病（T2DM）を患っていない肥満患者116名（年齢46.8 ± 9.3歳、BMI：42.7 ± 5.0 kg/m²）が含まれました。循環IPA濃度は液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）で測定し、肝臓トランスクリプトーム解析はtotal RNAシーケンシングで、DNAメチル化解析はInfinium HumanMethylation450 BeadChipを用いて行いました。in vitro実験にはヒト肝星細胞（LX-2）を使用しました。
血清IPA濃度は、肝臓におけるアポトーシス、ミトファジー、および寿命延長経路に関与する遺伝子の発現と相関していた。AKTセリン/スレオニンキナーゼ1（AKT1）遺伝子は、肝臓転写産物およびDNAメチル化プロファイルにおいて最も豊富かつ優位に相互作用する遺伝子であった。IPA投与は、LX-2細胞における線維化、アポトーシス、および生存を制御することが知られている遺伝子の発現を調節することにより、アポトーシスを誘導し、ミトコンドリア呼吸を減少させ、細胞形態およびミトコンドリアの動態を変化させた。
これらのデータを総合すると、IPA には潜在的な治療効果があり、アポトーシスを誘導して HSC 表現型を不活性状態に移行させ、それによって HSC の活性化とミトコンドリア代謝を阻害することで肝線維症を阻害する可能性が広がることが裏付けられます。
肥満やメタボリックシンドロームの蔓延は、代謝関連脂肪性肝疾患（MASLD）の発生率増加と関連しており、この疾患は一般人口の25%～30%に影響を及ぼしています [1]。MASLDの原因となる主な結果は肝線維症であり、これは線維性細胞外マトリックス（ECM）の持続的な蓄積を特徴とする動的なプロセスです [2]。肝線維症に関与する主な細胞は肝星細胞（HSC）であり、静止型、活性化型、不活性化型、老化型の4つの既知の表現型を示します [3, 4]。HSCは活性化され、静止型からエネルギー需要の高い増殖性線維芽細胞様細胞へと分化転換し、α-平滑筋アクチン（α-SMA）とI型コラーゲン（Col-I）の発現が増加します [5, 6]。肝線維化の回復過程において、活性化造血幹細胞はアポトーシスまたは不活性化によって排除されます。これらのプロセスには、線維化遺伝子のダウンレギュレーション、生存促進遺伝子（NF-κBやPI3K/Aktシグナル伝達経路など）の調節[7, 8]、およびミトコンドリアの動態と機能の変化が含まれます[9]。
腸で生成されるトリプトファン代謝物インドール-3-プロピオン酸（IPA）の血清レベルは、MASLDを含むヒトの代謝性疾患で低下していることがわかっている[10–13]。IPAは食物繊維摂取と関連があり、抗酸化作用と抗炎症作用で知られており、in vivoおよびin vitroで食事誘発性非アルコール性脂肪肝炎（NASH）の表現型を減弱させる[11–14]。いくつかのエビデンスは、Kuopio Bariatric Surgery Study（KOBS）において、肝線維症患者の血清IPAレベルは肝線維症のない肥満患者よりも低かったことを実証した我々の以前の研究から得られている。さらに、我々は、IPA治療がヒト肝星細胞（LX-2）モデルにおける細胞接着、細胞遊走、造血幹細胞活性化の古典的なマーカーである遺伝子の発現を低下させ、IPAが潜在的な肝保護代謝物であることを示した[15]。しかし、IPA がどのようにして HSC アポトーシスとミトコンドリアの生体エネルギーを活性化して肝線維症の退縮を誘導するのかは不明のままです。
本研究では、血清IPAが、肥満を伴う非2型糖尿病（KOBS）患者の肝臓において、アポトーシス、マイトファジー、および寿命延長に関わる遺伝子発現と関連していることを実証しました。さらに、IPAは不活化経路を介して活性化造血幹細胞（HSC）の除去と分解を誘導できることも明らかにしました。これらの結果は、IPAの新たな役割を明らかにし、肝線維化の退縮を促進する潜在的な治療標的となる可能性があります。
KOBSコホートにおける先行研究では、肝線維化患者は肝線維化のない患者と比較して循環IPA濃度が低いことが示されている[15]。2型糖尿病の潜在的な交絡因子を排除するために、進行中のKOBS研究[16]から2型糖尿病を患っていない肥満患者116名（平均年齢±標準偏差：46.8±9.3歳、BMI：42.7±5.0 kg/m2）（表1）を研究対象集団として登録した。全参加者は書面によるインフォームドコンセントを得ており、研究プロトコルはヘルシンキ宣言（54/2005、104/2008、27/2010）に基づき、北サボ郡立病院の倫理委員会によって承認された。
肝生検標本は肥満外科手術中に採取され、経験豊富な病理医によって、以前に記載された基準[17, 18]に従って組織学的に評価された。評価基準は補足表S1にまとめられており、以前に記載された[19]。
空腹時血清サンプルを非標的液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）によりメタボロミクス解析（n = 116）した。サンプルは、既報19と同様にUHPLC-qTOF-MSシステム（1290 LC、6540 qTOF-MS、Agilent Technologies、Waldbronn、Karlsruhe、ドイツ）を用いて分析した。イソプロピルアルコール（IPA）の同定は、保持時間とMS/MSスペクトルと純品標準物質との比較に基づいて行った。IPAシグナル強度（ピーク面積）は、以降のすべての解析において考慮された[20]。
全肝臓RNAシークエンシングはIllumina HiSeq 2500を用いて実施し、データは既報[19, 21, 22]に従って前処理した。MitoMiner 4.0データベース[23]から選択された1957個の遺伝子を用いて、ミトコンドリア機能／生合成に影響を与える転写産物の標的発現差解析を実施した。肝臓DNAメチル化解析は、既報[24, 25]と同様の方法論を用いて、Infinium HumanMethylation450 BeadChip（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて実施した。
ヒト肝星細胞（LX-2）は、Stefano Romeo教授よりご提供いただき、DMEM/F12培地（Biowest社、L0093-500、1% Pen/Strep；Lonza社、DE17-602E、2% FBS；Gibco社、10270-106）で培養・維持しました。IPAの作用濃度を選択するため、LX-2細胞をDMEM/F12培地中の異なる濃度のIPA（10 μM、100 μM、1 mM；Sigma社、220027）で24時間処理しました。さらに、IPAによるHSC不活性化能を調査するため、LX-2細胞を無血清培地中の5 ng/ml TGF-β1（R&D systems社、240-B-002/CF）と1 mM IPAで24時間共処理しました。対応する溶媒対照については、TGF-β1 処理には 0.1% BSA を含む 4 nM HCL を使用し、IPA 処理には 0.05% DMSO を使用し、併用処理では両方を一緒に使用しました。
アポトーシスは、FITCアネキシンVアポトーシス検出キット（7-AAD添加）（Biolegend社、カリフォルニア州サンディエゴ、カタログ番号640922）を用いて、製造元の指示に従って評価した。LX-2（1×105個/ウェル）を12ウェルプレートで一晩培養し、IPAまたはIPAとTGF-β1を複数回投与して処理した。翌日、浮遊細胞と接着細胞を回収し、トリプシン処理後、PBSで洗浄し、アネキシンV結合バッファーに再懸濁し、FITC-アネキシンVおよび7-AAD添加で15分間インキュベートした。
生細胞中のミトコンドリアは、Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) を用いて酸化活性染色を行った。MTRアッセイでは、LX-2細胞をIPAおよびTGF-β1と等密度でインキュベートした。24時間後、生細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄した後、以前報告したように[26]、無血清培地中の100μM MTRとともに37℃で20分間インキュベートした。生細胞形態解析では、細胞サイズと細胞質複雑性を、それぞれ前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）パラメータを用いて解析した。
すべてのデータ (30,000 イベント) は NovoCyte Quanteon (Agilent) を使用して取得され、NovoExpress® 1.4.1 または FlowJo V.10 ソフトウェアを使用して分析されました。
酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化速度（ECAR）は、Seahorse XF Cell Mito Stressを装備したSeahorse Extracellular Flux Analyzer（Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、製造元の指示に従ってリアルタイムで測定された。簡単に説明すると、2×104 LX-2細胞/ウェルをXF96細胞培養プレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞をイソプロパノール（IPA）およびTGF-β1で処理した（補足方法1）。データ解析は、Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generatorを含むSeahorse XF Waveソフトウェアを用いて行った。このデータから、生体エネルギー健康指数（BHI）が算出された[27]。
全RNAをcDNAに転写した。具体的な方法については文献[15]を参照のこと。ヒト60Sリボソーム酸性タンパク質P0（RPLP0）およびシクロフィリンA1（PPIA）mRNAレベルを構成遺伝子コントロールとして使用した。QuantStudio 6 proリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher、Landsmeer、オランダ）をTaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit（Applied Biosystems）またはSensifast SYBR Lo-ROX Kit（Bioline、BIO 94050）と併用し、比較Ct値サイクリングパラメータ（ΔΔCt）およびΔΔCt法を用いて相対遺伝子発現フォールドを算出した。プライマーの詳細は補足表S2およびS3に記載されている。
核DNA（ncDNA）およびミトコンドリアDNA（mtDNA）は、既報[28]のDNeasy血液・組織キット（Qiagen社）を用いて抽出した。mtDNAの相対量は、補足方法2に詳述されているように、各標的mtDNA領域と3つの核DNA領域の幾何平均（mtDNA/ncDNA）の比を計算することで算出した。mtDNAおよびncDNA用プライマーの詳細は、補足表S4に示されている。
生細胞は、細胞間および細胞内のミトコンドリアネットワークを可視化するために、Mitotracker™ Red CMXRos（MTR）（Thermo Fisher Scientific、カリフォルニア州カールスバッド）で染色した。LX-2細胞（1×104個/ウェル）を、対応するガラス底培養プレート（Ibidi GmbH、ドイツ、マルティンスリート）のガラススライド上で培養した。24時間後、生LX-2細胞を100μM MTRで37℃で20分間インキュベートし、細胞核を既報[29]に従ってDAPI（1μg/ml、Sigma-Aldrich）で染色した。ミトコンドリアネットワークは、Zeiss LSM 800共焦点モジュールを搭載したZeiss Axio Observer倒立顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging GmbH、ドイツ、イエナ）を用いて、37℃、5% CO2の加湿雰囲気下で63×NA 1.3対物レンズを用いて可視化した。各サンプルタイプについて10枚のZシリーズ画像を取得した。各Zシリーズには、厚さ9.86 μmの切片が30枚含まれている。各サンプルについて、ZEN 2009ソフトウェア（Carl Zeiss Microimaging GmbH、ドイツ、イエナ）を用いて10の異なる視野の画像を取得し、ImageJソフトウェア（v1.54d）[30, 31]を用いて、補足方法3に詳述するパラメータに従ってミトコンドリア形態解析を実施した。
細胞は0.1 Mリン酸緩衝液中の2%グルタルアルデヒドで固定し、続いて1%四酸化オスミウム溶液（Sigma Aldrich、ミズーリ州、米国）で固定した。アセトン（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）で徐々に脱水した後、エポキシ樹脂に包埋した。超薄切片を作製し、1%酢酸ウラニル（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）および1%クエン酸鉛（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）で染色した。超微細構造画像は、JEM 2100F EXII透過型電子顕微鏡（JEOL Ltd、東京、日本）を用いて加速電圧80 kVで取得した。
IPA で 24 時間処理した LX-2 細胞の形態を、Zeiss 倒立光学顕微鏡 (Zeiss Axio Vert.A1 および AxioCam MRm、イエナ、ドイツ) を使用して 50 倍の倍率で位相差顕微鏡検査により分析しました。
臨床データは平均値±標準偏差または中央値（四分位範囲：IQR）として表されました。3つの研究群間の差異を比較するために、一元配置分散分析（連続変数）またはχ²検定（カテゴリ変数）が用いられました。多重検定の補正には偽陽性率（FDR）が用いられ、FDR < 0.05の遺伝子は統計的に有意であると判断されました。CpG DNAメチル化とIPAシグナル強度の相関にはスピアマン相関分析が用いられ、名目p値（p < 0.05）が報告されました。
パスウェイ解析は、ウェブベースの遺伝子セット解析ツール（WebGestalt）を用いて実施しました。この解析では、循環血清IPA濃度と関連する268の転写産物（名目p < 0.01）、119のミトコンドリア関連転写産物（名目p < 0.05）、および3093の肝臓転写産物のうち4350のCpG遺伝子が対象となりました。重複遺伝子の検出には無料で利用可能なVenny DB（バージョン2.1.0）ツールを使用し、タンパク質間相互作用の可視化にはStringDB（バージョン11.5）を使用しました。
LX-2実験では、サンプルの正規性検定をD'Agostino-Pearson検定を用いて実施しました。データは少なくとも3回の生物学的反復から取得し、一元配置分散分析（ANOVA）とBonferroni事後検定を実施しました。p値0.05未満を統計的に有意としました。データは平均値±SDで示し、各図には実験回数を示しています。すべての解析およびグラフ作成は、Windows用統計ソフトウェアGraphPad Prism 8（GraphPad Software Inc.、バージョン8.4.3、米国サンディエゴ）を使用して実施しました。
まず、血清IPA値と肝臓、全身、およびミトコンドリアの転写産物との関連性を調べた。全転写産物プロファイルにおいて、血清IPA値と最も強く関連する遺伝子はMAPKAPK3（FDR = 0.0077；ミトゲン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ3）であった。ミトコンドリア関連転写産物プロファイルにおいて、最も強く関連する遺伝子はAKT1（FDR = 0.7621；AKTセリン／スレオニンキナーゼ1）であった（追加ファイル1および追加ファイル2）。
次に、全体転写産物（n = 268; p < 0.01）とミトコンドリア関連転写産物（n = 119; p < 0.05）を解析し、最終的にアポトーシスが最も重要な標準経路であると特定しました（p = 0.0089）。血清IPA値に関連するミトコンドリア転写産物については、アポトーシス（FDR = 0.00001）、マイトファジー（FDR = 0.00029）、およびTNFシグナル伝達経路（FDR = 0.000006）に焦点を当てました（図1A、表2、および補足図1A-B）。
血清IPAレベルに関連したヒト肝臓におけるグローバル転写産物、ミトコンドリア関連転写産物、およびDNAメチル化の重複解析。Aは、血清IPAレベルに関連する3092のCpGサイトにマッピングされた268のグローバル転写産物、119のミトコンドリア関連転写産物、およびDNAメチル化転写産物を表しています（グローバル転写産物とDNAメチル化ではp​​値<0.01、ミトコンドリア転写産物ではp値<0.05）。主要な重複転写産物は中央に示されています（AKT1とYKT6）。B 相互作用スコアが最も高い13の遺伝子と他の遺伝子の相互作用マップは、オンラインツールStringDBを使用して、血清IPAレベルと有意に関連付けられた56の重複遺伝子（黒線領域）から作成されました。緑：遺伝子オントロジー（GO）細胞成分：ミトコンドリア（GO:0005739）にマッピングされた遺伝子。 AKT1は、テキストマイニング、実験、データベース、共発現に基づくデータに基づき、他のタンパク質との相互作用において最も高いスコア（0.900）を示したタンパク質です。ネットワークノードはタンパク質を表し、エッジはタンパク質間の接続を表します。
腸内細菌叢の代謝物はDNAメチル化を介してエピジェネティックな構成を制御することが示唆されているため[32]、血清IPA濃度が肝臓DNAメチル化と関連しているかどうかを調べた。血清IPA濃度と関連する2つの主要なメチル化部位は、プロリン・セリンリッチ領域3（C19orf55）と熱ショックタンパク質ファミリーB（小）メンバー6（HSPB6）付近であった（追加ファイル3）。4350 CpGのDNAメチル化（p < 0.01）は血清IPA濃度と相関し、長寿制御経路に富んでいた（p = 0.006）（図1A、表2、補足図1C）。
血清IPAレベル、包括的転写産物、ミトコンドリア関連転写産物、およびヒト肝臓におけるDNAメチル化との関連の生物学的メカニズムを解明するため、前回のパスウェイ解析で同定された遺伝子のオーバーラップ解析を行った（図1A）。56個のオーバーラップ遺伝子（図1Aの黒線内）のパスウェイエンリッチメント解析の結果、アポトーシスパスウェイ（p = 0.00029）が、3つの解析に共通する2つの遺伝子、AKT1とYKT6（YKT6 v-SNAREホモログ）を強調していることが示された（ベン図（補足図2および図1A））。興味深いことに、AKT1（cg19831386）およびYKT6（cg24161647）は血清IPAレベルと正の相関関係にあることがわかった（追加ファイル3）。遺伝子産物間の潜在的なタンパク質相互作用を同定するため、重複遺伝子56個のうち、共通領域スコア（0.900）が最も高い13個の遺伝子を入力として選択し、相互作用マップを構築した。信頼度（周辺信頼度）によると、最も高いスコア（0.900）を示すAKT1遺伝子が最上位に位置づけられた（図1B）。
パスウェイ解析の結果、アポトーシスが主要なパスウェイであることがわかったので、IPA処理がin vitroでのHSCのアポトーシスに影響するかどうかを調査しました。以前、異なる用量のIPA（10μM、100μM、1mM）はLX-2細胞に対して無毒であることを実証しました[15]。この研究では、10μMおよび100μMのIPA処理により、生存細胞および壊死細胞の数が増加したことが示されました。しかし、対照群と比較して、1mMのIPA濃度では細胞生存率は低下しましたが、細胞壊死率は変化しませんでした（図2A、B）。次に、LX-2細胞でアポトーシスを誘導するのに最適な濃度を見つけるために、10μM、100μM、1mMのIPAを24時間試験しました（図2A-Eおよび補足図3A-B）。興味深いことに、IPA 10 μM および 100 μM ではアポトーシス率 (%) が低下しましたが、IPA 1 mM では対照と比較して後期アポトーシスとアポトーシス率 (%) が増加したため、さらなる実験に選択されました (図 2A～D)。
IPAはLX-2細胞のアポトーシスを誘導する。アネキシンVおよび7-AADの二重染色法を用いて、フローサイトメトリーによりアポトーシス率と細胞形態を定量化した。BA細胞を10μM、100μM、1mMのIPAで24時間、またはF-H TGF-β1（5ng/ml）と1mMのIPAを無血清培地で24時間インキュベートした。A：生細胞（アネキシンV -/ 7AAD-）；B：壊死細胞（アネキシンV -/ 7AAD+）；C、F：初期（アネキシンV +/ 7AAD-）；D、G：後期（アネキシンV+/7AAD.+）；E、H：アポトーシス率における初期および後期アポトーシス細胞の総数の割合（％）。データは平均±SDとして表され、n = 3回の独立した実験である。統計的比較は、一元配置分散分析とBonferroni事後検定を用いて行われた。*p < 0.05; ****p < 0.0001
以前に示したように、5 ng/ml TGF-β1は古典的マーカー遺伝子の発現を増加させることで造血幹細胞の活性化を誘導することができる[15]。LX-2細胞を5 ng/ml TGF-β1と1 mM IPAの併用で処理した（図2E–H）。TGF-β1処理ではアポトーシス率に変化は見られなかったが、IPA併用処理ではTGF-β1処理と比較して後期アポトーシスおよびアポトーシス率（%）が増加した（図2E–H）。これらの結果は、1 mM IPAがTGF-β1誘導とは独立してLX-2細胞のアポトーシスを促進できることを示している。
さらに、LX-2細胞におけるIPAのミトコンドリア呼吸への影響について検討しました。その結果、1 mM IPAは対照群と比較して、酸素消費速度（OCR）パラメータ（非ミトコンドリア呼吸、基礎呼吸および最大呼吸、プロトンリーク、ATP産生）を低下させました（図3A、B）。一方、生体エネルギー健康指数（BHI）には変化が見られませんでした。
IPAはLX-2細胞のミトコンドリア呼吸を低下させる。ミトコンドリア呼吸曲線（OCR）は、ミトコンドリア呼吸パラメータ（非ミトコンドリア呼吸、基礎呼吸、最大呼吸、プロトンリーク、ATP生成、SRC、BHI）として示される。細胞AおよびBは、それぞれ10 μM、100 μM、1 mM IPAで24時間インキュベートした。細胞CおよびDは、それぞれTGF-β1（5 ng/ml）および1 mM IPAで無血清培地で24時間インキュベートした。すべての測定値は、CyQuantキットを用いてDNA含有量に対して標準化した。BHI：生体エネルギー健康指数、SRC：呼吸予備能、OCR：酸素消費率。データは平均±標準偏差（SD）、n = 5の独立した実験として示される。統計的比較は一元配置分散分析とボンフェローニ事後検定を用いて行われた。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001
TGF-β1活性化LX-2細胞におけるIPAの生体エネルギープロファイルへの効果をより包括的に理解するため、OCR法を用いてミトコンドリアの酸化的リン酸化を解析した（図3C、D）。その結果、TGF-β1投与群は対照群と比較して、最大呼吸数、呼吸予備能（SRC）、およびBHIを低下させることが示された（図3C、D）。さらに、併用投与群は基礎呼吸数、プロトンリーク、およびATP産生を減少させたが、SRCおよびBHIはTGF-β1投与群と比較して有意に高かった（図3C、D）。
Seahorseソフトウェアに付属の「細胞エネルギー表現型テスト」も実行しました（補足図4A〜D）。補足図3Bに示すように、TGF-β1処理後、OCRとECARの代謝ポテンシャルは両方とも減少しましたが、併用およびIPA処理グループと対照群とを比較して差は見られませんでした。さらに、併用およびIPA処理後、対照群と比較してOCRの基礎レベルとストレスレベルの両方が減少しました（補足図4C）。興味深いことに、併用療法でも同様のパターンが観察され、TGF-β1処理と比較してECARの基礎レベルとストレスレベルに変化は見られませんでした（補足図4C）。HSCでは、TGF-β1処理への曝露後にミトコンドリアの酸化的リン酸化の減少と併用治療によるSCRとBHIの回復能力は、代謝ポテンシャル（OCRとECAR）を変化させませんでした。これらの結果を総合すると、IPA は HSC の生体エネルギーを低下させる可能性があることが示され、IPA は HSC 表現型を不活性化へとシフトさせる低いエネルギープロファイルを誘発する可能性があることが示唆されます (補足図 4D)。
IPA のミトコンドリア動態に対する効果を、ミトコンドリアの形態とネットワーク接続の 3 次元定量化、および MTR 染色を使用して調査しました (図 4 および補足図 5)。図 4 は、対照群と比較して、TGF-β1 処理によって平均表面積、分岐数、総分岐長、分岐接合部数 (図 4A および B) が減少し、ミトコンドリアの割合が球形から中間形態に変化した (図 4C) ことを示しています。IPA 処理のみが、対照群と比較して、平均ミトコンドリア容積を減少させ、ミトコンドリアの割合が球形から中間形態に変化しました (図 4A)。対照的に、球形度、平均分岐長、およびミトコンドリア膜電位依存性 MTR によって評価したミトコンドリア活性 (図 4A および E) は変化せず、これらのパラメーターはグループ間で差がありませんでした。これらの結果を総合すると、TGF-β1 および IPA 処理は、生きた LX-2 細胞のミトコンドリアの形状とサイズ、およびネットワークの複雑さを調整する可能性があることが示唆されます。
IPA は LX-2 細胞のミトコンドリアのダイナミクスとミトコンドリア DNA の存在量を変化させます。A. 無血清培地で 24 時間、TGF-β1 (5 ng/ml) および 1 mM IPA とともに培養した生きた LX-2 細胞の代表的な共焦点画像。Mitotracker™ Red CMXRos で染色したミトコンドリア ネットワークと、DAPI で青く染色した核を示しています。すべてのデータには、グループあたり少なくとも 15 枚の画像が含まれています。サンプル タイプごとに 10 枚の Z スタック画像を取得しました。各 Z 軸シーケンスには、それぞれの厚さ 9.86 μm のスライスが 30 枚含まれています。スケール バー: 10 μm。B. 画像に適応しきい値を適用して識別された代表的なオブジェクト (ミトコンドリアのみ)。各グループのすべての細胞に対して、ミトコンドリアの形態学的ネットワーク接続の定量分析と比較を実行しました。 0に近い値は球状、1に近い値は糸状を示します。D ミトコンドリアDNA（mtDNA）含量は、「材料と方法」に記載のとおり測定しました。E Mitotracker™ Red CMXRos解析は、「材料と方法」に記載のとおりフローサイトメトリー（30,000イベント）で実施しました。データは平均±SDとして示され、n = 3の独立した実験です。統計的比較は、一元配置分散分析とBonferroniの事後検定を用いて実施しました。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
次に、ミトコンドリア数の指標としてLX-2細胞中のmtDNA含量を解析した。対照群と比較して、TGF-β1投与群ではmtDNA含量が増加した（図4D）。TGF-β1投与群と比較して、併用投与群ではmtDNA含量が減少したことから（図4D）、IPAはmtDNA含量を減少させ、ミトコンドリア数とミトコンドリア呼吸を低下させる可能性が示唆された（図3C）。さらに、IPAは併用投与においてmtDNA含量を減少させたが、MTRを介したミトコンドリア活性には影響を与えなかった（図4A～C）。
LX-2細胞において、線維化、アポトーシス、生存、ミトコンドリア動態に関連する遺伝子のmRNAレベルとIPAとの関連性を調べた（図5A～D）。対照群と比較して、TGF-β1投与群では、I型コラーゲンα2鎖（COL1A2）、α平滑筋アクチン（αSMA）、マトリックスメタロプロテアーゼ2（MMP2）、組織メタロプロテアーゼ阻害因子1（TIMP1）、ダイナミン1様遺伝子（DRP1）などの遺伝子発現が増加しており、線維化と活性化の増加が示唆された。さらに、対照群と比較して、TGF-β1投与は、核プレグナンX受容体（PXR）、カスパーゼ8（CASP8）、MAPKAPK3、B細胞α阻害因子、核因子κ遺伝子軽鎖ペプチド増強因子（NFκB1A）、および核因子κBキナーゼサブユニットβ阻害因子（IKBKB）のmRNAレベルを低下させた（図5A～D）。TGF-β1投与と比較して、TGF-β1とIPAの併用投与はCOL1A2およびMMP2の発現を低下させたが、PXR、TIMP1、B細胞リンパ腫2（BCL-2）、CASP8、NFκB1A、NFκB1-β、およびIKBKBのmRNAレベルを上昇させた。 IPA処理により、MMP2、Bcl-2関連タンパク質X（BAX）、AKT1、視神経萎縮タンパク質1（OPA1）、ミトコンドリア融合タンパク質2（MFN2）の発現が対照群と比較して有意に減少した一方で、CASP8、NFκB1A、NFκB1B、IKBKBの発現は増加した。しかし、カスパーゼ3（CASP3）、アポトーシスペプチダーゼ活性化因子1（APAF1）、ミトコンドリア融合タンパク質1（MFN1）、分裂タンパク質1（FIS1）の発現には差は認められなかった。これらの結果を総合すると、IPA処理は線維化、アポトーシス、生存、およびミトコンドリアの動態に関連する遺伝子の発現を調節することを示唆している。本データは、IPA処理がLX-2細胞の線維化を軽減すると同時に、表現型を不活性化へとシフトさせることで生存を促進することを示唆している。
IPAはLX-2細胞において、線維芽細胞、アポトーシス、生存率、およびミトコンドリアダイナミクス遺伝子の発現を調節する。ヒストグラムは、LX-2細胞を無血清培地中でTGF-β1およびIPAを用いて24時間誘導した後、内因性コントロール（RPLP0またはPPIA）と比較したmRNA発現を示す。Aは線維芽細胞、Bはアポトーシス細胞、Cは生存細胞、Dはミトコンドリアダイナミクス遺伝子の発現を示す。データは平均値±標準偏差（SD）として示され、n = 3の独立した実験に基づく。統計的比較は、一元配置分散分析およびBonferroniの事後検定を用いて行った。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001
次に、フローサイトメトリーにより細胞サイズ（FSC-H）および細胞質複雑性（SSC-H）の変化を評価し（図6A、B）、IPA処理後の細胞形態の変化を透過型電子顕微鏡（TEM）および位相差顕微鏡（補足図6A-B）により評価した。 予想通り、TGF-β1処理群の細胞は対照群と比較してサイズが増加し（図6A、B）、粗面小胞体（ER*）およびファゴリソソーム（P）の典型的な拡大を示し、造血幹細胞（HSC）の活性化を示唆した（補足図6A）。 しかし、TGF-β1処理群と比較して、TGF-β1とIPAの併用処理群では細胞サイズ、細胞質複雑性（図6A、B）、およびER*含量は減少した（補足図6A）。さらに、IPA処理群は、対照群と比較して、細胞サイズ、細胞質複雑性（図6A、B）、PおよびER*含量（補足図6A）を減少させた。さらに、IPA処理24時間後、対照群と比較してアポトーシス細胞含量が増加した（白矢印、補足図6B）。これらの結果を総合すると、1 mM IPAは造血幹細胞（HSC）のアポトーシスを刺激し、TGF-β1によって誘導される細胞形態学的パラメータの変化を逆転させることで、細胞サイズと複雑性を制御し、これが造血幹細胞の不活性化に関連する可能性があることが示唆される。
IPAはLX-2細胞において細胞サイズと細胞質複雑性を変化させます。フローサイトメトリー解析の代表的な画像です。解析にはLX-2細胞特有のゲーティング戦略を用いました。SSC-A/FSC-Aは細胞集団の定義、FSC-H/FSC-Aはダブレットの識別、SSC-H/FSC-Hは細胞サイズと複雑性の解析に使用しました。細胞はTGF-β1（5 ng/ml）および1 mM IPAを含む無血清培地中で24時間インキュベートしました。LX-2細胞は、細胞サイズと細胞質複雑性の解析のために、左下象限（SSC-H-/FSC-H-）、左上象限（SSC-H+/FSC-H-）、右下象限（SSC-H-/FSC-H+）、右上象限（SSC-H+/FSC-H+）に分配されました。 B. 細胞形態は、FSC-H（前方散乱光、細胞サイズ）およびSSC-H（側方散乱光、細胞質複雑性）を用いたフローサイトメトリー（30,000イベント）で解析した。データは平均±SDとして示し、n = 3の独立した実験に基づく。統計的比較は、一元配置分散分析およびBonferroniの事後検定を用いて行った。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001
IPAなどの腸内代謝物は、腸内細菌叢に新たな標的が発見される可能性を示唆しており、研究のホットな話題となっている。そのため、ヒトの肝線維症と関連付けられている代謝物であるIPA [15] が、動物モデルにおいて潜在的な抗線維化化合物であることが示されていることは興味深い [13, 14]。本研究では、2型糖尿病（T2D）を患っていない肥満者において、血清IPAと全肝トランスクリプトミクスおよびDNAメチル化との関連を初めて示し、アポトーシス、マイトファジー、寿命、そして肝臓恒常性を制御する候補遺伝子AKT1の可能性を示唆する。本研究のもう一つの新規性は、LX-2細胞においてIPA治療とアポトーシス、細胞形態、ミトコンドリアの生体エネルギーおよびダイナミクスとの相互作用を実証した点である。これは、HSC表現型を不活性化へとシフトさせる低エネルギースペクトルを示唆しており、IPAが肝線維症改善の潜在的候補となることを示している。
循環血清IPAに関連する肝臓遺伝子群において、アポトーシス、マイトファジー、そして長寿が最も重要な標準的経路であることが分かりました。ミトコンドリア品質管理（MQC）システムの破綻は、ミトコンドリア機能不全、マイトファジー、そしてアポトーシスを引き起こし、ひいてはMASLDの発生を促進する可能性があります[33, 34]。したがって、IPAは肝臓におけるアポトーシス、マイトファジー、そして長寿を介して、細胞動態とミトコンドリアの完全性の維持に関与している可能性があると推測できます。私たちのデータは、3つのアッセイでYKT6とAKT1という2つの遺伝子が共通していることを示しました。YKT6は細胞膜融合プロセスに関与するSNAREタンパク質であることは注目に値します。 YKT6はオートファジーおよびマイトファジーにおいて、オートファゴソーム上のSTX17およびSNAP29と開始複合体を形成し、オートファゴソームとリソソームの融合を促進する役割を果たしている[35]。さらに、YKT6の機能喪失はマイトファジーの障害につながる[36]一方、YKT6の発現亢進は肝細胞癌（HCC）の進行と関連し、細胞生存率の上昇を示す[37]。一方、AKT1は最も重要な相互作用遺伝子であり、PI3K/AKTシグナル伝達経路、細胞周期、細胞移動、増殖、接着斑、ミトコンドリア機能、コラーゲン分泌など、肝疾患において重要な役割を果たしている[38–40]。活性化されたPI3K/AKTシグナル伝達経路は、細胞外マトリックス（ECM）の産生を担う造血幹細胞（HSC）を活性化することができ、その制御不全は肝線維症の発生および進行に寄与する可能性がある[40]。さらに、AKTはp53依存性細胞アポトーシスを阻害する重要な細胞生存因子の一つであり、AKT活性化は肝細胞アポトーシスの阻害と関連している可能性がある[41, 42]。得られた結果は、IPAが肝細胞におけるアポトーシスへの移行か生存かの決定に影響を与えることで、肝ミトコンドリア関連アポトーシスに関与している可能性を示唆している。これらの効果は、肝臓の恒常性維持に重要なAKTおよび/またはYKT6候補遺伝子によって制御されている可能性がある。
我々の研究結果は、1 mM IPAがTGF-β1処理とは無関係にLX-2細胞でアポトーシスを誘導し、ミトコンドリア呼吸を減少させたことを示した。アポトーシスが線維症の解決と造血幹細胞（HSC）活性化の主要な経路であり、肝線維症の可逆的な生理学的反応における重要なイベントでもあることは注目に値する[4, 43]。さらに、併用治療後のLX-2細胞でのBHIの回復は、ミトコンドリアの生体エネルギー調節におけるIPAの潜在的な役割について新たな知見を提供した。休止期および非活動状態では、造血細胞は通常、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を利用してATPを産生し、代謝活性は低い。一方、HSCの活性化は、解糖状態に入るためのエネルギー需要を補うために、ミトコンドリア呼吸および生合成を促進する[44]。 IPAが代謝能およびECARに影響を与えなかったという事実は、解糖経路の優先順位が低いことを示唆しています。同様に、別の研究では、1 mM IPAが心筋細胞、ヒト肝細胞株（Huh7）、およびヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）においてミトコンドリア呼吸鎖活性を調節できることが示されました。しかし、心筋細胞における解糖系への影響は認められなかったことから、IPAは他の細胞種の生体エネルギーに影響を与える可能性が示唆されています[45]。したがって、1 mM IPAはmtDNAの量を変化させることなく、線維形成遺伝子の発現、細胞形態、およびミトコンドリアの生体エネルギーを著しく低下させることができるため、軽度の化学的分離剤として作用する可能性があると推測されます[46]。ミトコンドリア脱共役剤は、培養誘導性線維化および造血幹細胞活性化を阻害し[47]、脱共役タンパク質（UCP）やアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ANT）などの特定のタンパク質によって制御または誘導されるミトコンドリアATP産生を減少させる。細胞の種類によっては、この現象は細胞をアポトーシスから保護したり、アポトーシスを促進したりする可能性がある[46]。しかし、造血幹細胞不活性化におけるミトコンドリア脱共役剤としてのIPAの役割を解明するには、さらなる研究が必要である。
次に、ミトコンドリア呼吸の変化が生きたLX-2細胞のミトコンドリア形態に反映されるかどうかを調べた。興味深いことに、TGF-β1処理はミトコンドリアの割合を球状から中間型に変化させ、ミトコンドリアの分岐の減少と、ミトコンドリア分裂の重要な因子であるDRP1の発現増加をもたらした[48]。さらに、ミトコンドリアの断片化は全体的なネットワークの複雑さと関連しており、融合から分裂への移行は造血幹細胞（HSC）の活性化に重要であり、ミトコンドリア分裂の阻害はHSCのアポトーシスにつながる[49]。したがって、我々の結果は、TGF-β1処理が、活性化造血幹細胞（HSC）に関連するミトコンドリア分裂でより一般的に見られる分岐の減少を伴い、ミトコンドリアネットワークの複雑さの低下を引き起こす可能性があることを示している。さらに、我々のデータは、IPAがミトコンドリアの割合を球形から中間形へと変化させ、それによってOPA1およびMFN2の発現を低下させることを示した。研究によると、OPA1のダウンレギュレーションはミトコンドリア膜電位の低下を引き起こし、細胞アポトーシスを誘発する可能性があることが示されている[50]。MFN2はミトコンドリアの融合とアポトーシスを媒介することが知られている[51]。得られた結果は、TGF-β1および／またはIPAによるLX-2細胞の誘導が、ミトコンドリアの形状とサイズ、ならびに活性化状態とネットワークの複雑さを調節することを示唆している。
我々の研究結果は、TGFβ-1とIPAの併用療法が、アポトーシスを回避する細胞において、線維化、アポトーシス、および生存関連遺伝子のmRNA発現を調節することにより、mtDNAおよび細胞形態パラメータを低下させる可能性があることを示唆している。実際、IPAはAKT1やCOL1A2、MMP2といった重要な線維化遺伝子のmRNA発現を低下させたが、アポトーシスに関連するCASP8の発現は上昇させた。我々の研究結果は、IPA処理後、BAXの発現が低下し、TIMP1ファミリーサブユニット、BCL-2、NF-κBのmRNA発現が上昇することを示しており、IPAがアポトーシスを回避する造血幹細胞（HSC）において生存シグナルを刺激する可能性があることを示唆している。これらの分子は活性化造血幹細胞において生存促進シグナルとして作用する可能性があり、抗アポトーシスタンパク質（Bcl-2など）の発現増加、アポトーシス促進性BAXの発現減少、およびTIMPとNF-κBの複雑な相互作用と関連している可能性がある[5, 7]。IPAはPXRを介して効果を発揮し、TGF-β1とIPAの併用療法によりPXR mRNAの発現レベルが上昇し、HSC活性化の抑制が示された。活性化PXRシグナル伝達は、in vivoおよびin vitroの両方でHSC活性化を阻害することが知られている[52, 53]。我々の結果は、IPAがアポトーシスを促進し、線維化とミトコンドリア代謝を減らし、生存シグナルを増強することで、活性化HSCの除去に関与している可能性を示している。これらは活性化HSC表現型を不活性化HSC表現型に変換する典型的なプロセスである。 IPAのアポトーシスにおける潜在的なメカニズムと役割に関するもう一つの考えられる説明は、IPAが主にマイトファジー（内因性経路）と外因性TNFシグナル伝達経路（表1）を介して機能不全のミトコンドリアを除去するというものである。TNFシグナル伝達経路はNF-κB生存シグナル伝達経路（補足図7）に直接リンクしている。興味深いことに、IPA関連遺伝子は、アポトーシス経路においてアポトーシス促進および生存促進シグナルを誘導することができる[54]ことから、IPAはこれらの遺伝子と相互作用することでアポトーシス経路または生存を誘導する可能性があることが示唆される。しかし、IPAが造血幹細胞活性化中にどのようにアポトーシスまたは生存を誘導するのか、そしてそのメカニズム経路は依然として不明である。
IPAは、腸内細菌叢を介して食物中のトリプトファンから生成される微生物代謝物です。研究により、IPAは腸内環境において抗炎症作用、抗酸化作用、およびエピジェネティック制御作用を有することが示されています。[55] また、IPAは腸管バリア機能を調節し、酸化ストレスを軽減することが示されており、これが局所的な生理学的効果に寄与している可能性があります。[56] 実際、IPAは循環血を介して標的臓器に輸送されます。IPAはトリプトファン、セロトニン、インドール誘導体と主要な代謝物構造が類似しているため、代謝作用を発揮し、競合的な代謝経路を引き起こします。[52] IPAは、酵素または受容体の結合部位をめぐってトリプトファン由来の代謝物と競合し、正常な代謝経路を阻害する可能性があります。このことから、IPAの治療域をより深く理解するためには、薬物動態および薬力学に関するさらなる研究が必要です。[57]これが造血幹細胞（HSC）でも起こり得るかどうかはまだ分かっていません。
本研究にはいくつかの限界があることを認識しています。IPAに関連する関連性を具体的に検討するために、2型糖尿病（T2DM）の患者を除外しました。これにより、2型糖尿病と進行性肝疾患を患う患者への本研究の広範な適用性が制限されることを承知しています。ヒト血清中のIPAの生理的濃度は1～10μMですが[11, 20]、最も高い非毒性濃度[15]と最も高いアポトーシス率に基づいて、壊死細胞集団の割合に差がない1mM IPAという濃度が選択されました。本研究では生理学的レベルを超えるIPAを使用しましたが、IPAの有効用量に関して現在コンセンサスはありません[52]。我々の研究結果は重要ですが、IPAのより広範な代謝運命は依然として活発な研究分野です。さらに、血清IPAレベルと肝臓転写産物のDNAメチル化との関連性に関する我々の知見は、造血幹細胞（HSC）だけでなく肝臓組織からも得られたものである。我々は、IPAが造血幹細胞（HSC）の活性化と関連していること、そしてHSCが肝線維症の進行に関与する主要な細胞であることをトランスクリプトーム解析から以前に得た知見に基づいて、ヒトLX-2細胞を使用することを選択した[15]。肝臓は複数の細胞型で構成されているため、IPAの役割と他の肝細胞型との相互作用を研究するには、カスパーゼ活性化とDNA断片化を組み合わせた肝細胞-HSC-免疫細胞共培養システムなどの他の細胞モデルや、タンパク質レベルを含む作用機序を検討する必要がある。