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硫化水素（H2S）は人体に複数の生理学的および病理学的影響を及ぼします。硫化水素ナトリウム（NaHS）は、生物学的実験でH2Sの影響を評価するための薬理学的ツールとして広く使用されています。NaHS溶液からのH2Sの消失には数分しかかかりませんが、NaHS溶液は、動物実験で飲料水中のH2Sの供与化合物として使用されています。本研究では、ラット/マウスボトルで調製した30 μMのNaHS濃度の飲料水が、一部の著者によって示唆されているように、少なくとも12～24時間安定しているかどうかを調査しました。飲料水にNaHS（30 μM）溶液を調製し、直ちにラット/マウスの給水ボトルに注ぎます。0、1、2、3、4、5、6、12、24時間後に給水ボトルの先端と内部からサンプルを採取し、メチレンブルー法を使用して硫化物含有量を測定しました。さらに、雄雌ラットにNaHS（30 μM）を2週間注射し、最初の1週間は隔日、2週目の終わりに血清硫化物濃度を測定した。水ボトルの先端から採取したサンプル中のNaHS溶液は不安定で、12時間後には72%、24時間後には75%減少した。水ボトル内部から採取したサンプルでは、​​NaHSの減少は2時間以内では有意ではなかったが、12時間後には47%、24時間後には72%減少した。NaHS注射は雄雌ラットの血清硫化物濃度に影響を与えなかった。結論として、飲料水から調製したNaHS溶液は不安定であるため、H2Sの供給には使用すべきではない。この投与経路では、動物は不規則で予想よりも少ない量のNaHSに曝されることになる。
硫化水素（H2S）は1700年以来毒物として使用されてきましたが、内因性バイオシグナル伝達分子としての役割の可能性は、1996年に阿部と木村によって初めて報告されました。過去30年間で、様々なヒトシステムにおけるH2Sの数多くの機能が解明され、H2S供与分子が特定の疾患の治療や管理において臨床応用できる可能性が認識されるようになりました。最近の総説については、Chirinoらの論文を参照してください。
硫化水素ナトリウム（NaHS）は、多くの細胞培養および動物実験でH2Sの効果を評価するための薬理学的ツールとして広く使用されてきました5,6,7,8。しかし、NaHSは溶液中でH2S/HS-に急速に変換され、ポリ硫化物で容易に汚染され、容易に酸化および揮発するため、理想的なH2S供与体ではありません4,9。多くの生物学的実験では、NaHSは水に溶解され、受動揮発とH2Sの損失10,11,12、H2Sの自然酸化11,12,13、および光分解14を引き起こします。元の溶液中の硫化物は、H2Sの揮発により非常に急速に失われます11。開放容器では、H2Sの半減期（t1/2）は約5分で、その濃度は1分あたり約13%減少します10。 NaHS溶液からの硫化水素の消失はわずか数分で起こるものの、一部の動物実験では、NaHS溶液を飲料水中の硫化水素源として1～21週間使用し、12～24時間ごとにNaHS含有溶液を交換している。15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 この方法は、薬物投与量は他の種、特にヒトにおける使用に基づいて決定されるべきであるという科学的研究の原則に合致しない。27
生物医学における前臨床研究は、患者ケアの質や治療結果の改善を目的としています。しかし、ほとんどの動物実験の結果はまだヒトに応用されていません28,29,30。この応用失敗の理由の1つは、動物実験の方法論的品質への注意不足です30。したがって、本研究の目的は、ラット/マウス用ウォーターボトルで調製した30 μM NaHS溶液が、いくつかの研究で主張または示唆されているように、飲料水中で12～24時間安定して維持できるかどうかを調査することでした。
本研究におけるすべての実験は、イランにおける実験動物の飼育および使用に関する公表されたガイドライン31に従って実施されました。また、本研究におけるすべての実験報告は、ARRIVEガイドライン32にも準拠しています。本研究におけるすべての実験手順は、シャヒード・ベヘシュティ医科大学内分泌科学研究所の倫理委員会によって承認されました。
酢酸亜鉛二水和物（CAS: 5970-45-6）および無水塩化第二鉄（CAS: 7705-08-0）は、Biochem, Chemopahrama（フランス、コスヌ＝シュル＝ロワール）から購入した。硫化水素ナトリウム水和物（CAS: 207683-19-0）およびN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン（DMPD）（CAS: 535-47-0）は、Sigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。イソフルランは、Piramal（米国ペンシルベニア州ベスレヘム）から購入した。塩酸（HCl）は、Merck（ドイツ、ダルムシュタット）から購入した。
飲料水に NaHS (30 μM) の溶液を調製し、すぐにラット/マウスの給水ボトルに注ぎます。この濃度は、H2S 源として NaHS を使用した多数の論文に基づいて選択されました。考察のセクションを参照してください。NaHS は、さまざまな量の水和水 (つまり、NaHS•xH2O) を含むことができる水和分子です。製造元によると、本研究で使用した NaHS の割合は 70.7% (つまり、NaHS•1.3 H2O) であり、この値を計算に考慮し、無水 NaHS の分子量である 56.06 g/mol の分子量を使用しました。水和水 (結晶水とも呼ばれる) は、結晶構造を構成する水分子です 33。水和物は、無水物と比較して、物理的および熱力学的に異なる特性を持っています 34。
飲料水に NaHS を加える前に、溶媒の pH と温度を測定します。NaHS 溶液を動物ケージ内のラット/マウス用給水ボトルにすぐに注ぎます。硫化物含有量を測定するために、0、1、2、3、4、5、6、12、24 時間後に給水ボトルの先端と内部からサンプルを採取しました。硫化物の測定は、各サンプリングの直後に行いました。いくつかの研究で、給水チューブの孔径が小さいと H2S の蒸発を最小限に抑えられることが示されているため、チューブの先端からサンプルを採取しました 15,19。この問題はボトル内の溶液にも当てはまるようです。しかし、これは給水ボトルの首の溶液には当てはまりませんでした。首の溶液は蒸発速度が速く、自己酸化していました。実際、動物はこの水を最初に飲みました。
本研究では、雄と雌のWistarラットを用いた。ラットはポリプロピレン製のケージ（1ケージあたり2～3匹）に入れ、標準条件（温度21～26℃、湿度32～40%）で、12時間明期（午前7時～午後7時）と12時間暗期（午後7時～午前7時）の条件下で飼育した。ラットには水道水を自由に摂取させ、標準飼料（Khorak Dam Pars Company、イラン、テヘラン）を与えた。年齢を合わせた（6ヶ月齢）雌（n=10、体重：190～230g）と雄（n=10、体重：320～370g）のWistarラットを、無作為にコントロール群とNaHS（30μM）処理群（各群n=5）に分けた。サンプルサイズを決定するために、過去の経験と検出力分析を組み合わせたKISS（Keep It Simple, Stupid）アプローチを採用した35。まず、3匹のラットで予備研究を行い、血清総硫化物濃度の平均値と標準偏差（8.1 ± 0.81 μM）を測定した。次に、検出力80%、両側有意水準5%を仮定して、実験動物のサンプルサイズを計算するためにFestingが提案した定義値35を用いて標準化効果量2.02に対応する予備サンプルサイズ（先行研究に基づくn = 5）を決定した。この値をSD（2.02 × 0.81）で乗算すると、予測される検出可能な効果量（1.6 μM）は20%となり、これは許容範囲内である。つまり、n = 5/グループでグループ間の平均変化20%を検出するのに十分である。ラットはExcelソフトウェア36の乱数機能を用いて、コントロール群とNaSH処理群にランダムに分けられた（補足図1）。盲検化は結果レベルで行われ、生化学的測定を行う研究者はグループ割り当てを知らされていなかった。
NaHS群の雌雄両方に、飲料水で調製した30 μM NaHS溶液を2週間投与した。新鮮な溶液を24時間ごとに供給し、その間に体重を測定した。血液サンプルは、1週目と2週目の終わりに、イソフルラン麻酔下で全てのラットの尾の先端から隔日で採取した。血液サンプルを3000 gで10分間遠心分離し、血清を分離して-80°Cで保存し、その後、血清尿素、クレアチニン（Cr）、および総硫化物を測定した。血清尿素は酵素ウレアーゼ法で測定し、血清クレアチニンは市販のキット（Man Company、イラン、テヘラン）と自動分析装置（Selectra E、シリアル番号0-2124、オランダ）を使用して光度計ヤッフェ法で測定した。尿素とCrの測定内および測定間変動係数は2.5%未満であった。
メチレンブルー（MB）法は、NaHSを含む飲料水および血清中の総硫化物を測定するために使用され、MBはバルク溶液および生物学的サンプル中の硫化物を測定する最も一般的に使用されている方法です11,37。MB法は、総硫化物プールを推定するために使用でき38、水相中のH2S、HS-、およびS2の形で無機硫化物を測定できます39。この方法では、硫酸亜鉛の存在下で硫黄が硫化亜鉛（ZnS）として沈殿します11,38。硫酸亜鉛沈殿は、硫化物を他の発色団から分離するために最も広く使用されている方法です11。ZnSは、強酸性条件下でHClを使用して再溶解されました11。硫化物は、塩化第二鉄（Fe3+は酸化剤として作用する）によって触媒される反応で、DMPDと1:2の化学量論比で反応し、色素MBを生成する。この色素MBは、670 nmで分光光度法により検出される40,41。MB法の検出限界は約1 μMである11。
本研究では、各サンプル（溶液または血清）100 μLをチューブに加え、次に酢酸亜鉛（蒸留水中の1% w/v）200 μL、DMPD（7.2 M HCl中の20 mM）100 μL、およびFeCl3（1.2 M HCl中の30 mM）133 μLを加えた。混合物を37℃で暗所で30分間インキュベートした。溶液を10,000 gで10分間遠心分離し、上清の吸光度をマイクロプレートリーダー（BioTek、MQX2000R2、Winooski、VT、USA）を使用して670 nmで測定した。硫化物濃度は、ddH2O中のNaHS（0～100 μM）の検量線を使用して決定した（補足図2）。測定に使用したすべての溶液は新鮮に調製した。硫化物測定の測定内変動係数と測定間変動係数は、それぞれ2.8%と3.4%でした。また、強化サンプル法42を用いて、チオ硫酸ナトリウムを含む飲料水と血清サンプルから回収された総硫化物も測定しました。チオ硫酸ナトリウムを含む飲料水と血清サンプルの回収率は、それぞれ91±1.1%（n=6）と93±2.4%（n=6）でした。
統計解析は、Windows 用 GraphPad Prism ソフトウェア バージョン 8.0.2 (GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、www.graphpad.com) を使用して実施した。NaHS 添加前後の飲料水の温度と pH を比較するために、対応のある t 検定を使用した。NaHS 含有溶液中の H2S の減少は、ベースラインの取り込みからの減少率として計算し、その減少が統計的に有意であるかどうかを評価するために、一元配置反復測定 ANOVA とそれに続く Dunnett の多重比較検定を実施した。体重、血清尿素、血清クレアチニン、および総血清硫化物の経時変化は、異なる性別の対照群と NaHS 処理群のラット間で、二元配置混合 (群間-群内) ANOVA とそれに続く Bonferroni 事後検定を使用して比較した。両側 P 値 < 0.05 を統計的に有意とみなした。
飲料水の pH は、NaHS 添加前は 7.60 ± 0.01、NaHS 添加後は 7.71 ± 0.03 であった (n = 13、p = 0.0029)。飲料水の温度は 26.5 ± 0.2 であり、NaHS 添加後は 26.2 ± 0.2 に低下した (n = 13、p = 0.0128)。飲料水に 30 μM NaHS 溶液を調製し、水筒に保存する。NaHS 溶液は不安定であり、その濃度は時間とともに低下する。水筒の首からサンプリングすると、最初の 1 時間以内に有意な減少 (68.0%) が観察され、溶液中の NaHS 含有量は、12 時間後と 24 時間後にそれぞれ 72% と 75% 減少した。水筒から採取したサンプルでは、​​NaHS の減少は 2 時間までは有意ではなかったが、12 時間後と 24 時間後にはそれぞれ 47% と 72% 減少した。これらのデータは、飲料水で調製した30μM溶液中のNaHSの割合が、サンプリング場所に関係なく、24時間後には初期値の約4分の1に減少したことを示している（図1）。
ラット/マウス用ボトル内の飲料水中のNaHS溶液（30 μM）の安定性。溶液調製後、ボトルの先端と内部からサンプルを採取した。データは平均値±標準偏差（n = 6/グループ）で示されている。*および#は、0時点と比較してP < 0.05であることを示す。ボトルの写真は、先端（開口部あり）とボトル本体を示している。先端の容量は約740 μLである。
調製直後の30 μM溶液中のNaHS濃度は30.3 ± 0.4 μM（範囲：28.7～31.9 μM、n = 12）であった。しかし、24時間後にはNaHS濃度はより低い値（平均：3.0 ± 0.6 μM）に低下した。図2に示すように、ラットが曝露されたNaHS濃度は、研究期間中一定ではなかった。
雌ラットの体重は時間の経過とともに有意に増加した（対照群では205.2 ± 5.2 gから213.8 ± 7.0 g、NaHS処理群では204.0 ± 8.6 gから211.8 ± 7.5 g）。しかし、NaHS処理は体重に影響を与えなかった（図3）。雄ラットの体重は時間の経過とともに有意に増加した（対照群では338.6 ± 8.3 gから352.4 ± 6.0 g、NaHS処理群では352.4 ± 5.9 gから363.2 ± 4.3 g）。しかし、NaHS処理は体重に影響を与えなかった（図3）。
NaHS（30 μM）投与後の雌雄ラットの体重変化。データは平均値±標準誤差（SEM）で示し、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置混合（群内・群間）分散分析で比較した。各群、各性別につきn=5。
血清尿素およびクレアチンリン酸濃度は、対照群とNaSH投与群のラット間で、試験期間を通して同程度であった。さらに、NaSH投与は血清尿素およびクレアチンクロム濃度に影響を与えなかった（表1）。
ベースラインの血清総硫化物濃度は、対照群とNaHS投与群の雄ラット（8.1 ± 0.5 μM vs. 9.3 ± 0.2 μM）および雌ラット（9.1 ± 1.0 μM vs. 6.1 ± 1.1 μM）で同程度であった。14日間のNaHS投与は、雄ラットおよび雌ラットのいずれにおいても血清総硫化物濃度に影響を与えなかった（図4）。
NaHS（30 μM）投与後の雄および雌ラットの血清総硫化物濃度の変化。データは平均値±標準誤差で示し、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置混合（群内-群内）分散分析で比較した。各性別、n = 5/群。
本研究の主な結論は、NaHSを含む飲料水は不安定であるということである。ラット／マウス用給水ボトルの先端部および内部から採取したサンプルでは、​​24時間後には初期の総硫化物含有量の約4分の1しか検出されなかった。さらに、NaHS溶液中のH2Sの減少により、ラットは不安定なNaHS濃度に曝されたが、飲料水へのNaHSの添加は、体重、血清尿素およびクレアチンクロム、または血清総硫化物濃度に影響を与えなかった。
この研究では、飲料水で調製した 30 μM NaHS 溶液からの H2S の損失率は、1 時間あたり約 3% でした。緩衝溶液 (10 mM PBS、pH 7.4 中の 100 μM 硫化ナトリウム) では、硫化物濃度は 8 時間で時間とともに 7% 減少することが報告されています 11。私たちは以前、飲料水中の 54 μM NaHS 溶液からの硫化物の損失率が、1 時間あたり約 2.3% (調製後最初の 12 時間で 4%/時間、最後の 12 時間で 1.4%/時間) であったことを報告し、NaHS の腹腔内投与を擁護しました 8。以前の研究 43 では、NaHS 溶液からの H2S の一定の損失が、主に揮発と酸化によるものであることがわかりました。気泡の添加がなくても、原液中の硫化物は H2S の揮発により急速に失われます 11。研究によると、約 30 ～ 60 秒かかる希釈プロセス中に、H2S の約 5 ～ 10% が蒸発により失われることがわかっています 6。溶液からの H2S の蒸発を防ぐために、研究者は、溶液を穏やかに撹拌する 12、原液をプラスチック フィルムで覆う 6、H2S の蒸発速度が空気と液体の界面に依存するため、溶液の空気への露出を最小限に抑える 13 など、いくつかの対策を講じてきました。H2S の自然酸化は、主に遷移金属イオン、特に水中の不純物である三価鉄イオンによって起こります 13。H2S の酸化により、ポリ硫化物 (共有結合で結合した硫黄原子) が形成されます 11。酸化を避けるため、H2S を含む溶液は脱酸素溶媒で調製され、その後、脱酸素を確実にするために 20 ～ 30 分間アルゴンまたは窒素でパージされます。11,12,37,44,45,46 ジエチレントリアミンペンタ酢酸 (DTPA) は、好気性溶液中の HS- の自動酸化を防ぐ金属キレート剤 (10 ～ 4 M) です。DTPA がない場合、HS- の自動酸化速度は 25°C で約 3 時間で約 50% です。37,47 さらに、1e-硫化物の酸化は紫外線によって触媒されるため、溶液は氷上で保存し、光から保護する必要があります。11
図 5 に示すように、NaHS は水に溶解すると Na+ と HS-6 に解離します。この解離は反応の pK1 によって決まり、これは温度に依存します。pK1 = 3.122 + 1132/T、ここで T は 5 ～ 30 °C の範囲で、ケルビン (K) で測定され、K = °C + 273.1548 です。HS- は pK2 が高い (pK2 = 19) ため、pH < 96.49 では S2- は生成されないか、ごく少量しか生成されません。対照的に、HS- は塩基として働き、H2O 分子から H+ を受け取り、H2O は酸として働き、H2S と OH- に変換されます。
NaHS溶液（30 µM）中における溶解H2Sガスの生成。aq：水溶液、g：ガス、l：液体。すべての計算は、水のpH=7.0、水温=20℃を前提としています。BioRender.comで作成。
NaHS溶液が不安定であるという証拠があるにもかかわらず、いくつかの動物実験では、H2S供与化合物として飲料水中のNaHS溶液が使用され、介入期間は1週間から21週間に及んだ（表2）。これらの実験では、NaHS溶液は12時間、15時間、17時間、18時間、24時間、25時間ごと、または24時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間ごとに交換された。我々の結果は、NaHS溶液からのH2Sの損失によりラットが不安定な薬物濃度に曝され、ラットの飲料水中のNaHS含有量が12時間または24時間にわたって大きく変動することを示した（図2参照）。これらの研究のうち2つは、水中のH2S濃度が24時間以上安定していたこと22、または12時間でH2Sの損失が2～3%しか観察されなかったこと15を報告しているが、裏付けとなるデータや測定の詳細を提供していない。2つの研究では、水筒の直径が小さいとH2Sの蒸発を最小限に抑えられることが示されている15,19。しかし、我々の結果では、これは水筒からのH2Sの損失を12～24時間ではなく2時間遅らせるだけかもしれないことが示された。両方の研究は、水の色の変化が観察されなかったため、飲料水中のNaHS濃度は変化しなかったと想定していること、したがって空気によるH2Sの酸化は重要ではなかったことを指摘している19,20。驚くべきことに、この主観的な方法は、時間の経過に伴う濃度の変化を測定するのではなく、水中のNaHSの安定性を評価するものである。
NaHS溶液中のH2Sの損失はpHと温度に関係しています。私たちの研究で述べたように、NaHSを水に溶解するとアルカリ性溶液が形成されます50。NaHSを水に溶解すると、溶解したH2Sガスの生成はpH値に依存します6。溶液のpHが低いほど、H2Sガス分子として存在するNaHSの割合が高くなり、水溶液からより多くの硫化物が失われます11。これらの研究はいずれも、NaHSの溶媒として使用される飲料水のpHを報告していません。ほとんどの国で採用されているWHOの勧告によると、飲料水のpHは6.5～8.5の範囲であるべきです51。このpH範囲では、H2Sの自然酸化速度は約10倍に増加します13。このpH範囲でNaHSを水に溶解すると、溶解したH2Sガス濃度は1～22.5μMとなり、NaHSを溶解する前に水のpHを監視することの重要性が強調されます。さらに、上記の研究で報告されている温度範囲（18～26℃）では、溶液中の溶存H2Sガスの濃度が約10％変化することになります。これは、温度変化によってpK1が変化し、pK1のわずかな変化でも溶存H2Sガスの濃度に大きな影響を与える可能性があるためです48。また、一部の研究の期間が長い（5ヶ月）22ため、その間に大きな温度変動が予想され、この問題が悪化します。
1つの研究21を除いてすべての研究で、飲料水中に30 μMのNaHS溶液が使用されました。使用された用量（つまり30 μM）を説明するために、一部の著者は、水相中のNaHSがまったく同じ濃度のH2Sガスを生成し、H2Sの生理的範囲は10～100 μMであるため、この用量は生理的範囲内であると指摘しました15,16。他の著者は、30 μMのNaHSは血漿H2Sレベルを生理的範囲、つまり5～300 μM19,20内に維持できると説明しました。私たちは、H2Sの影響を研究するためにいくつかの研究で使用された、水中の30 μMのNaHS濃度（pH = 7.0、T = 20 °C）を検討します。溶解したH2Sガスの濃度は14.7 μMであり、これは初期NaHS濃度の約50%であると計算できます。この値は、同じ条件下で他の著者によって計算された値と似ています13,48。
本研究では、NaHS投与により体重に変化は見られませんでした。この結果は、雄マウス22,23および雄ラット18における他の研究結果と一致しています。しかし、2つの研究では、NaSHが腎摘出ラットの減少した体重を回復させたことが報告されています24,26が、他の研究ではNaSH投与が体重に及ぼす影響は報告されていません15,16,17,19,20,21,25。さらに、本研究では、NaSH投与は血清尿素およびクレアチンクロム濃度に影響を与えませんでしたが、これは別の報告25の結果と一致しています。
この研究では、2 週間の飲用水への NaHS の添加は雄と雌のラットの血清総硫化物濃度に影響を与えないことがわかった。この結果は Sen ら (16) の結果と一致している。Sen らは、飲用水に 30 μM NaHS を 8 週間投与しても対照ラットの血漿硫化物濃度には影響がなかったが、この介入により腎摘出マウスの血漿中の H2S 濃度の低下が回復したと報告している。Li ら (22) も、飲用水に 30 μM NaHS を 5 か月投与すると高齢マウスの血漿遊離硫化物濃度が約 26% 増加したと報告している。他の研究では、飲用水に NaHS を添加した後の循環硫化物の変化は報告されていない。
7つの研究ではSigma NaHS15,16,19,20,21,22,23を使用したと報告しているが、水和水に関する詳細な情報は提供しておらず、5つの研究では調製方法に使用したNaHSの供給源について言及していない17,18,24,25,26。NaHSは水和分子であり、その水和水含有量は変化する可能性があり、特定のモル濃度の溶液を調製するために必要なNaHSの量に影響する。たとえば、本研究におけるNaHS含有量はNaHS•1.3 H2Oであった。したがって、これらの研究における実際のNaHS濃度は報告されている値よりも低い可能性がある。
「このような短寿命の化合物が、なぜこれほど長く効果が持続するのだろうか？」Pozgay ら 21 は、マウスの大腸炎に対する NaHS の効果を評価する際にこの疑問を投げかけた。彼らは、今後の研究でこの疑問に答えられることを期待しており、NaHS 溶液には、NaHS の効果を媒介する H2S とジスルフィドに加えて、より安定なポリ硫化物が含まれている可能性があると推測している 21。別の可能性としては、溶液中に残っている非常に低濃度の NaHS も有益な効果をもたらす可能性がある。実際、Olson らは、血液中のマイクロモル濃度の H2S は生理的ではなく、ナノモル濃度の範囲であるか、まったく存在しないべきであるという証拠を提示した 13。H2S は、多くのタンパク質の機能、安定性、および局在に影響を与える可逆的な翻訳後修飾であるタンパク質硫酸化を介して作用する可能性がある 52,53,54。実際、生理的条件下では、多くの肝臓タンパク質の約 10% ～ 25% が硫酸化されている 53。両方の研究はNaHS19,23の急速な分解を認めているが、驚くべきことに「飲料水中のNaHS濃度は毎日交換することで制御した」と述べている。23 ある研究では誤って「NaHSは標準的なH2S供与体であり、臨床現場ではH2S自体を置き換えるために一般的に使用されている」と述べている。18
上記の議論から、NaHS は揮発、酸化、光分解によって溶液から失われることがわかったので、溶液からの H2S の損失を減らすためのいくつかの提案がなされた。まず、H2S の蒸発は気液界面 13 と溶液の pH 11 に依存するため、蒸発損失を最小限に抑えるには、前述のように水筒の首をできるだけ小さくし 15,19、水の pH を許容上限 (すなわち 6.5～8.551) に調整して蒸発損失を最小限に抑える 11。次に、H2S の自然酸化は、飲料水中の酸素の影響と遷移金属イオンの存在により発生する 13 ので、アルゴンまたは窒素による飲料水の脱酸素 44,45 および金属キレート剤の使用 37,47 により硫化物の酸化を減らすことができる。3番目に、H2S の光分解を防ぐために、水筒をアルミホイルで包むことができる。この方法は、ストレプトゾトシン55などの光感受性物質にも適用されます。最後に、無機硫化物塩（NaHS、Na2S、およびCaS）は、以前に報告されたように飲料水に溶解するのではなく、経口投与することができます56,57,58。研究では、ラットに経口投与された放射性硫化ナトリウムはよく吸収され、ほぼすべての組織に分布することが示されています59。現在までに、ほとんどの研究では無機硫化物塩を腹腔内に投与していますが、この経路は臨床現場ではほとんど使用されていません60。一方、経口投与はヒトにおいて最も一般的で好ましい投与経路です61。したがって、げっ歯類におけるH2S供与体の影響を経口投与によって評価することを推奨します。
限界として、水溶液および血清中の硫化物をMB法で測定したことが挙げられます。硫化物の測定法には、ヨウ素滴定法、分光光度法、電気化学法（電位差測定法、電流測定法、クーロメトリー法、電流測定法）、クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）などがあり、その中でもMB分光光度法が最も一般的に用いられています62。生物試料中のH2Sを測定するMB法の限界は、酸性条件下で実施されるため、生物源から硫黄が抽出され、遊離H2Sではなく、すべての硫黄含有化合物を測定することです63 64。しかし、米国公衆衛生協会によれば、MB法は水中の硫化物を測定する標準法です65。したがって、この限界はNaHSを含む溶液の不安定性に関する我々の主要な結果には影響しません。さらに、本研究では、NaHSを含む水および血清試料中の硫化物測定の回収率はそれぞれ91%および93%でした。これらの値は、以前に報告された範囲（77～92）66と一致しており、許容可能な分析精度を示しています42。前臨床研究で雄のみの動物研究に過度に依存することを避けるため、また可能な限り雄と雌の両方のラットを含めるため、国立衛生研究所（NIH）のガイドライン67に従って雄と雌の両方のラットを使用したことは注目に値します68。この点は、他の研究者によっても強調されています69,70,71。
結論として、本研究の結果は、飲料水から調製したNaHS溶液は不安定であるため、H2Sの生成には使用できないことを示している。この投与経路では、動物は不安定で予想よりも低い濃度のNaHSに曝されることになる。したがって、本研究の結果はヒトには適用できない可能性がある。
本研究で使用および／または分析されたデータセットは、合理的な要請があれば、責任著者から入手可能です。
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