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硫化水素（H2S）は、人体にさまざまな生理学的および病理学的影響を及ぼします。水硫化ナトリウム（NaHS）は、生物学的実験でH2Sの影響を評価するための薬理学的ツールとして広く使用されています。NaHS溶液からのH2Sの損失はわずか数分で発生しますが、いくつかの動物実験では、NaHS溶液が飲料水中のH2Sの供与化合物として使用されてきました。この研究では、ラット/マウスのボトルで調製した30μMのNaHS濃度の飲料水が、一部の著者が示唆しているように、少なくとも12〜24時間安定しているかどうかを調査しました。飲料水中のNaHS（30μM）溶液を調製し、すぐにラット/マウスの給水ボトルに注ぎます。0、1、2、3、4、5、6、12、24時間で給水ボトルの先端と内部からサンプルを採取し、メチレンブルー法を使用して硫化物含有量を測定しました。さらに、オスとメスのラットに NaHS (30 μM) を 2 週間注射し、最初の 1 週間は 1 日おきに血清硫化物濃度を測定した。給水ボトルの先端から採取したサンプルの NaHS 溶液は不安定で、12 時間後と 24 時間後にそれぞれ 72% と 75% 減少した。給水ボトルの内部から採取したサンプルでは、​​NaHS の減少は 2 時間以内には有意ではなかったが、12 時間後と 24 時間後にはそれぞれ 47% と 72% 減少した。NaHS 注射はオスとメスのラットの血清硫化物レベルに影響を与えなかった。結論として、飲料水から調製した NaHS 溶液は不安定であるため、H2S 供与に使用すべきではない。この投与経路では、動物は不規則で予想よりも少ない量の NaHS に曝露されることになる。
硫化水素（H2S）は1700年以来毒素として使用されてきましたが、内因性バイオシグナル分子としての役割を果たす可能性があることは、1996年に阿部と木村によって説明されました。過去30年間で、さまざまなヒトシステムにおけるH2Sの数多くの機能が解明され、H2S供与分子が特定の疾患の治療または管理に臨床応用できる可能性があるという認識につながりました。最近のレビューについては、Chirinoらによるレビューを参照してください。
水硫化ナトリウム（NaHS）は、多くの細胞培養や動物実験において、H2Sの影響を評価するための薬理学的ツールとして広く使用されています5,6,7,8。しかし、NaHSは溶液中で急速にH2S/HS-に変換され、多硫化物で汚染されやすく、酸化されて揮発しやすいため、理想的なH2S供与体ではありません4,9。多くの生物学的実験では、NaHSを水に溶解し、H2Sの受動的な揮発と損失10,11,12、H2Sの自然酸化11,12,13、および光分解14を引き起こします。元の溶液中の硫化物は、H2Sの揮発により非常に急速に失われます11。開放容器内では、H2Sの半減期（t1/2）は約5分で、その濃度は1分あたり約13％減少します10。 NaHS 溶液から硫化水素が失われるには数分しかかからないものの、動物実験では、飲料水中の硫化水素源として NaHS 溶液を 1～21 週間使用し、12～24 時間ごとに NaHS を含む溶液を交換しました。15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 この方法は、薬剤の投与量は他の種、特にヒトでの使用に基づいて決定されるべきであるため、科学的研究の原則に反します。27
生物医学における前臨床研究は、患者ケアの質や治療成果の向上を目的としています。しかしながら、動物実験の結果のほとんどは、未だヒトへの応用には至っていません28,29,30。この応用がうまくいかない理由の一つは、動物実験における方法論的質への配慮の欠如です30。そこで本研究の目的は、ラット／マウス用給水ボトルで調製した30μM NaHS溶液が、いくつかの研究で主張または示唆されているように、飲料水中で12～24時間安定して保持できるかどうかを調査することでした。
本研究におけるすべての実験は、イランにおける実験動物の飼育および使用に関する公表ガイドライン31に従って実施されました。本研究におけるすべての実験報告は、ARRIVEガイドライン32にも準拠しています。本研究におけるすべての実験手順は、シャヒド・ベヘシュティ医科大学内分泌科学研究所の倫理委員会によって承認されました。
酢酸亜鉛二水和物（CAS：5970-45-6）および無水塩化鉄（CAS：7705-08-0）は、Biochem, Chemopahrama（Cosne-sur-Loire、フランス）から購入しました。水硫化ナトリウム水和物（CAS：207683-19-0）およびN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン（DMPD）（CAS：535-47-0）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。イソフルランはPiramal（ベスレヘム、ペンシルバニア州、米国）から購入しました。塩酸（HCl）はMerck（ダルムシュタット、ドイツ）から購入しました。
飲料水で NaHS (30 μM) 溶液を調製し、それを直ちにラット／マウスの給水ボトルに注ぎ入れます。この濃度は、H2S 源として NaHS を使用した多数の文献に基づいて選択されました。考察セクションを参照してください。NaHS は、さまざまな量の水和水 (すなわち、NaHS•xH2O) を含むことができる水和分子です。製造元によると、本研究で使用した NaHS の割合は 70.7% (すなわち、NaHS•1.3 H2O) であり、この値を計算に考慮し、無水 NaHS の分子量である 56.06 g/mol を使用しました。水和水 (結晶水とも呼ばれる) は、結晶構造を構成する水分子です33。水和物は、無水物と比較して物理的および熱力学的特性が異なります34。
飲料水に NaHS を加える前に、溶媒の pH と温度を測定します。NaHS 溶液をすぐに動物ケージ内のラット/マウス用給水ボトルに注ぎます。サンプルは、0、1、2、3、4、5、6、12、24 時間後にボトルの先端と内側から採取し、硫化物含有量を測定しました。硫化物濃度は各サンプリングの直後に測定しました。チューブの細孔サイズが小さいと H2S の蒸発が最小限に抑えられるという研究結果があるため、チューブの先端からサンプルを採取しました15,19。この問題はボトル内の溶液にも当てはまるようです。ただし、蒸発速度が速く自動酸化していた給水ボトルの首の部分の溶液の場合はそうではありませんでした。実際、動物は最初にこの水を飲みました。
本研究では、雄および雌の Wistar ラットを使用した。ラットはポリプロピレン製ケージ（ケージあたり 2～3 匹）で、標準環境（温度 21～26 °C、湿度 32～40%）、12 時間明期（午前 7 時～午後 7 時）および 12 時間暗期（午後 7 時～午前 7 時）で飼育された。ラットには水道水を自由に摂取させ、標準飼料（Khorak Dam Pars Company、テヘラン、イラン）を与えた。月齢（6 か月）を合わせた雌（n=10、体重: 190～230 g）および雄（n=10、体重: 320～370 g）の Wistar ラットを無作為にコントロール群と NaHS（30 μM）投与群に分けた（各群 n=5）。サンプルサイズを決定するために、過去の経験と検出力分析を組み合わせた KISS（Keep It Simple, Stupid）アプローチを使用した。まず、3 匹のラットでパイロット スタディを実施し、血清総硫化物濃度の平均値と標準偏差 (8.1 ± 0.81 μM) を測定した。次に、80% の検出力を考慮し、両側 5% の有意水準を想定 して、実験動物のサンプル サイズを計算するために Festing によって提案された定義済み値 35 を使用して、標準化効果サイズ 2.02 に対応する予備サンプル サイズ (以前の文献に基づいて n = 5) を決定した。この値に SD (2.02 × 0.81) を乗じた後、予測される検出可能効果サイズ (1.6 μM) は 20% となり、許容範囲内であった。つまり、n = 5/群は、グループ間の平均 20% の変化を検出するのに十分であることを意味する。ラットは、Excel ソフトウェア 36 のランダム機能を使用して、コントロール グループと NaSH 処理グループにランダムに分けられた (補足図 1)。
雌雄の NaHS 群は、飲料水で調製した 30 μM NaHS 溶液を 2 週間投与されました。新鮮な溶液は 24 時間ごとに供給され、その間体重が測定されました。血液サンプルは、第 1 週および第 2 週の終わりに 1 日おきに、イソフルラン麻酔下ですべてのラットの尾端から採取されました。血液サンプルは 3000 g で 10 分間遠心分離され、血清が分離され、血清尿素、クレアチニン (Cr)、および総硫化物の測定のために -80°C で保存されました。血清尿素は酵素ウレアーゼ法で、血清クレアチニンは市販のキット (Man Company、テヘラン、イラン) および自動分析装置 (Selectra E、シリアル番号 0-2124、オランダ) を使用して光度測定 Jaffe 法で測定されました。尿素および Cr の試験内および試験間変動係数は 2.5% 未満でした。
メチレンブルー（MB）法は、NaHSを含む飲料水および血清中の総硫化物を測定するために使用されます。MB法は、バルク溶液および生物学的サンプル中の硫化物を測定する最も一般的に使用されている方法です11,37。MB法は、総硫化物プールの推定38や、水相中のH2S、HS-、およびS2の形態の無機硫化物を測定するために使用できます39。この方法では、硫黄は酢酸亜鉛の存在下で硫化亜鉛（ZnS）として沈殿します11,38。酢酸亜鉛沈殿は、硫化物を他の発色団から分離するために最も広く使用されている方法です11。ZnSは、強酸性条件下でHCl11を使用して再溶解しました。硫化物はDMPDと化学量論比1:2で塩化第二鉄（Fe3+）触媒（酸化剤として作用）により反応し、色素MBを生成します。この色素は分光光度計で670 nmで検出されます40,41。MB法の検出限界は約1μMです11。
本研究では、各サンプル（溶液または血清）100 μLをチューブに加え、酢酸亜鉛（蒸留水中1% w/v）200 μL、DMPD（7.2 M HCl中20 mM）100 μL、およびFeCl3（1.2 M HCl中30 mM）133 μLを添加した。混合物を37°C、暗所で30分間インキュベートした。溶液を10,000 gで10分間遠心分離し、マイクロプレートリーダー（BioTek、MQX2000R2、Winooski、VT、USA）を使用して上清の吸光度を670 nmで読み取った。硫化物濃度は、ddH2O中のNaHS（0～100 μM）の検量線を使用して決定した（補足図2）。測定に使用したすべての溶液は新しく調製した。硫化物測定における試験内変動係数および試験間変動係数はそれぞれ2.8%および3.4​​%でした。また、チオ硫酸ナトリウム含有飲料水および血清サンプルから回収された総硫化物を、強化サンプル法42を用いて測定しました。チオ硫酸ナトリウム含有飲料水および血清サンプルの回収率は、それぞれ91 ± 1.1% (n = 6) および93 ± 2.4% (n = 6) でした。
統計解析は、GraphPad Prism ソフトウェア バージョン 8.0.2 for Windows (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ、www.graphpad.com) を使用して実施しました。対応のある t 検定を使用して、NaHS 添加前後の飲料水の温度と pH を比較しました。NaHS 含有溶液中の H2S の損失は、ベースラインの吸収からの減少率として計算され、損失が統計的に有意であるかどうかを評価するために、一元配置反復測定 ANOVA に続いて Dunnett の多重比較検定を実施しました。体重、血清尿素、血清クレアチニン、および血清総硫化物の経時変化は、異なる性別のコントロール ラットと NaHS 処理ラットの間で、二元配置混合 (between-within) ANOVA に続いて Bonferroni の事後検定を使用して比較しました。両側 P 値 < 0.05 は統計的に有意であると判断されました。
飲料水のpHは、NaHS添加前は7.60 ± 0.01で、添加後は7.71 ± 0.03でした（n = 13、p = 0.0029）。飲料水の温度は26.5 ± 0.2で、NaHS添加後は26.2 ± 0.2に低下しました（n = 13、p = 0.0128）。飲料水で30μM NaHS溶液を調製し、ウォーターボトルに保存します。NaHS溶液は不安定で、濃度が時間の経過とともに低下します。ウォーターボトルの首からサンプルを採取したところ、最初の1時間以内に有意な減少（68.0%）が観察され、溶液中のNaHS含有量は12時間後と24時間後にそれぞれ72%と75%減少しました。ウォーターボトルから採取したサンプルでは、​​NaHSの減少は2時間までは有意ではありませんでしたが、12時間後と24時間後にはそれぞれ47%と72%減少しました。これらのデータは、飲料水中に調製された 30 μM 溶液中の NaHS の割合が、採取場所に関係なく、24 時間後には初期値の約 4 分の 1 に減少したことを示しています (図 1)。
ラット／マウス用給水ボトルにおけるNaHS溶液（30 μM）の飲料水の安定性。溶液調製後、給水ボトルの先端と内部からサンプルを採取した。データは平均値±SD（n = 6/群）として示す。*および#は、0時点と比較したP < 0.05。給水ボトルの写真は、先端（開口部付き）とボトル本体を示している。先端の容量は約740 μLである。
調製直後の30μM溶液中のNaHS濃度は30.3 ± 0.4μM（範囲：28.7～31.9μM、n = 12）であった。しかし、24時間後にはNaHS濃度はより低い値（平均：3.0 ± 0.6μM）に低下した。図2に示すように、ラットが曝露されたNaHS濃度は試験期間中一定ではなかった。
雌ラットの体重は経時的に有意に増加した（対照群では205.2 ± 5.2 gから213.8 ± 7.0 g、NaHS投与群では204.0 ± 8.6 gから211.8 ± 7.5 g）。しかし、NaHS投与は体重に影響を与えなかった（図3）。雄ラットの体重は経時的に有意に増加した（対照群では338.6 ± 8.3 gから352.4 ± 6.0 g、NaHS投与群では352.4 ± 5.9 gから363.2 ± 4.3 g）。しかし、NaHS投与は体重に影響を与えなかった（図3）。
NaHS（30 μM）投与後の雌雄ラットの体重変化。データは平均値±標準誤差（SEM）として示し、二元配置混合（群内群間）分散分析とBonferroni事後検定を用いて比較した。各群とも雌雄各5匹。
血清尿素濃度およびクレアチンリン酸濃度は、試験期間を通して対照群とNaSH投与群で同等であった。さらに、NaSH投与は血清尿素濃度およびクレアチンクロム濃度に影響を与えなかった（表1）。
血清総硫化物濃度のベースラインは、対照群とNaHS投与群の雄ラット（8.1 ± 0.5 μM vs. 9.3 ± 0.2 μM）および雌ラット（9.1 ± 1.0 μM vs. 6.1 ± 1.1 μM）で同等であった。14日間のNaHS投与は、雄ラットおよび雌ラットのいずれにおいても血清総硫化物濃度に影響を与えなかった（図4）。
NaHS（30μM）投与後の雄および雌ラットの血清中総硫化物濃度の変化。データは平均値±標準誤差（SEM）として示し、二元配置混合（群内内）分散分析とBonferroni事後検定を用いて比較した。各群とも雌雄ともにn = 5。
本研究の主な結論は、NaHSを含む飲料水は不安定であるということです。ラット／マウス用給水ボトルの先端と内部から採取した24時間後でも、初期の総硫化物濃度の約4分の1しか検出されません。さらに、NaHS溶液中のH2Sの損失により、ラットは不安定なNaHS濃度に曝露されましたが、飲料水へのNaHSの添加は体重、血清尿素、クレアチンクロム、血清総硫化物に影響を与えませんでした。
この研究では、飲料水で調製した 30 μM NaHS 溶液からの H2S 損失率は 1 時間あたり約 3% でした。緩衝溶液 (10 mM PBS、pH 7.4 中の 100 μM 硫化ナトリウム) では、硫化物濃度は 8 時間にわたって時間の経過とともに 7% 減少することが報告されています11。私たちは以前、飲料水中の 54 μM NaHS 溶液からの硫化物損失率は 1 時間あたり約 2.3% (調製後最初の 12 時間で 4%/時間、最後の 12 時間は 1.4%/時間) であると報告して、NaHS の腹腔内投与を擁護しました8。以前の研究43 では、主に揮発と酸化により、NaHS 溶液から H2S が一定に失われていることがわかりました。気泡を追加しない場合でも、ストック溶液中の硫化物は H2S の揮発によって急速に失われます11。研究によると、約 30～60 秒かかる希釈プロセス中に、約 5～10% の H2S が蒸発により失われます6。 研究者は、溶液からの H2S の蒸発を防ぐために、溶液を穏やかに撹拌する12、保存溶液をプラスチックフィルムで覆う6、H2S の蒸発速度は空気と液体の界面に依存するため、溶液が空気にさらされる時間を最小限に抑えるなど、いくつかの対策を講じてきました。13 H2S の自然酸化は、主に遷移金属イオン、特に水中の不純物である鉄(III)によって発生します。13 H2S の酸化により、ポリスルフィド (共有結合でつながった硫黄原子) が形成されます11。酸化を防ぐため、H2Sを含む溶液は脱酸素溶媒中で調製し44,45、その後、アルゴンまたは窒素で20～30分間パージして脱酸素を確実に行う11,12,37,44,45,46。ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）は、好気性溶液中のHS-の自動酸化を防ぐ金属キレート剤（10–4 M）である。DTPAが存在しない場合、HS-の自動酸化率は25℃で約3時間で約50%に達する37,47。さらに、1e-硫化物の酸化は紫外線によって触媒されるため、溶液は氷上で光から保護して保管する必要がある11。
図5に示すように、NaHSは水に溶解するとNa+とHS-6に解離します。この解離は反応のpK1によって決まり、pK1は温度に依存します。pK1 = 3.122 + 1132/T（Tは5～30℃の範囲でケルビン（K）で測定されます）、K = °C + 273.1548です。HS-はpK2が高い（pK2 = 19）ため、pH < 96.49ではS2-は生成されないか、ごく微量しか生成されません。一方、HS-は塩基として作用し、H2O分子からH+を受け取ります。一方、H2Oは酸として作用し、H2SとOH-に変換されます。
NaHS溶液（30 µM）中の溶解H2Sガスの生成。aq：水溶液、g：ガス、l：液体。すべての計算は、水のpH = 7.0、水温 = 20 °Cと仮定しています。BioRender.comで作成。
NaHS溶液が不安定であるという証拠があるにもかかわらず、いくつかの動物実験では、飲料水中のNaHS溶液をH2S供与化合物として使用し、1週間から21週間の介入期間を設けています15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。これらの実験中、NaHS溶液は12時間、15時間、17時間、18時間、24時間、25時間ごと、または24時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間ごとに交換されました。私たちの結果は、NaHS溶液からのH2Sの損失によりラットが不安定な薬物濃度にさらされ、ラットの飲料水中のNaHS含有量が12時間または24時間にわたって大きく変動したことを示しました（図2参照）。これらの研究のうち 2 件では、水中の H2S レベルは 24 時間にわたって安定していた 22 か、12 時間で H2S 損失は 2～3% にとどまった 15 と報告されていますが、裏付けデータや測定詳細は提供されていません。2 件の研究では、水筒の直径が小さいと H2S の蒸発が最小限に抑えられることが示されています 15,19。しかし、私たちの結果は、これによって水筒からの H2S 損失が 12～24 時間ではなく 2 時間遅れるだけである可能性があることを示しました。両研究とも、飲料水中の NaHS レベルは変化しなかったと仮定していると指摘しています。したがって、空気による H2S の酸化は有意ではありませんでした 19,20。驚くべきことに、この主観的な方法は、時間の経過に伴う濃度の変化を測定するのではなく、水中の NaHS の安定性を評価します。
NaHS 溶液中の H2S の損失は、pH と温度に関連しています。私たちの研究で述べたように、NaHS を水に溶解するとアルカリ性溶液が形成されます50。NaHS が水に溶解すると、溶存 H2S ガスの生成は pH 値に依存します6。溶液の pH が低いほど、H2S ガス分子として存在する NaHS の割合が多くなり、水溶液から失われる硫化物が多くなります11。これらの研究では、NaHS の溶媒として使用される飲料水の pH は報告されていません。ほとんどの国で採用されている WHO の勧告によると、飲料水の pH は 6.5～8.551 の範囲である必要があります。この pH 範囲では、H2S の自然酸化速度が約 10 倍に増加します13。この pH 範囲で NaHS を水に溶解すると、溶存 H2S ガス濃度は 1～22.5 μM になります。これは、NaHS を溶解する前に水の pH をモニタリングすることの重要性を強調しています。さらに、上記の研究で報告されている温度範囲（18～26℃）では、溶液中の溶存H2Sガス濃度が約10%変化する可能性があります。これは、温度変化によってpK1が変化し、pK1の小さな変化が溶存H2Sガス濃度に大きな影響を与える可能性があるためです48。さらに、一部の研究は長期間（5ヶ月間）にわたって実施されており22、その間に大きな温度変動が予想されるため、この問題はさらに深刻化しています。
1 件の研究21 を除くすべての研究で、飲料水に 30 μM の NaHS 溶液が使用されています。使用された用量 (つまり 30 μM) について説明するために、何人かの著者は、水相の NaHS はまったく同じ濃度の H2S ガスを生成し、H2S の生理学的範囲は 10～100 μM なので、この用量は生理学的範囲内であると指摘しました15,16。他の著者は、30 μM の NaHS は血漿の H2S レベルを生理学的範囲、つまり 5～300 μM に維持できると説明しています19,20。私たちは、いくつかの研究で H2S の影響を調べるために使用された、水中の NaHS 濃度 30 μM (pH = 7.0、T = 20 °C) を検討します。溶解した H2S ガスの濃度は 14.7 μM であると計算でき、これは初期の NaHS 濃度の約 50% です。この値は、同じ条件下で他の著者によって計算された値とほぼ同じです13,48。
本研究では、NaHS投与は体重に変化を及ぼさなかった。この結果は、雄マウス22,23および雄ラット18を対象とした他の研究結果と一致している。しかし、2つの研究では、腎摘出ラットにおいてNaSH投与が体重減少を回復させたと報告されている24,26のに対し、他の研究ではNaSH投与が体重に及ぼす影響は報告されていない15,16,17,19,20,21,25。さらに、本研究ではNaSH投与が血清尿素およびクレアチンクロム濃度に影響を与えなかった。これは、別の報告25の結果と一致している。
この研究では、飲料水に2週間NaHSを添加しても、オスとメスのラットの血清中の総硫化物濃度には影響がなかったことがわかった。この知見はSenら（16）の結果と一致している。飲料水に30μM NaHSを8週間添加した治療は、対照群ラットの血漿中の硫化物濃度に影響を与えなかったが、彼らはこの介入により、腎摘出マウスの血漿中のH2S濃度の低下が回復したと報告している。Liら（22）はまた、飲料水に30μM NaHSを5ヶ月間添加した治療により、老齢マウスの血漿中の遊離硫化物濃度が約26%上昇したと報告している。他の研究では、飲料水にNaHSを添加した後の循環硫化物濃度の変化は報告されていない。
7件の研究でシグマNaHS15,16,19,20,21,22,23 の使用が報告されていますが、水和水に関する詳細は示されていません。また、5件の研究ではその調製方法に使用したNaHSの供給源について言及されていませんでした17,18,24,25,26。NaHSは水和分子であり、その水和水の含有量は変化する可能性があり、特定のモル濃度の溶液を調製するために必要なNaHSの量に影響を与えます。例えば、本研究におけるNaHSの含有量はNaHS・1.3 H2Oでした。したがって、これらの研究における実際のNaHS濃度は、報告されている濃度よりも低い可能性があります。
「なぜこれほど短寿命の化合物が、これほど長く持続する効果を持つのか？」Pozgayら21は、マウスにおけるNaHSの大腸炎への影響を評価する際に、この疑問を提起しました。彼らは、今後の研究でこの疑問に答えられることを期待しており、NaHS溶液には、NaHSの効果を媒介するH2Sとジスルフィドに加えて、より安定したポリスルフィドが含まれている可能性があると推測しています21。また、溶液中に残留するNaHSの濃度が非常に低い場合も、有益な効果をもたらす可能性があると示唆しています。実際、Olsonらは、血中H2S濃度がマイクロモルレベルであることは生理学的ではなく、ナノモルレベル、あるいは全く存在しないべきであるという証拠を示しています13。H2Sは、多くのタンパク質の機能、安定性、および局在に影響を与える可逆的な翻訳後修飾であるタンパク質硫酸化を介して作用する可能性があります52,53,54。実際、生理条件下では、多くの肝臓タンパク質の約10%から25%が硫酸化されています53。どちらの研究もNaHSの急速な分解を認めていますが19,23、驚くべきことに「飲料水中のNaHSの濃度を毎日交換することで制御した」と述べています23。ある研究では、「NaHSは標準的なH2S供与体であり、臨床現場ではH2S自体を置き換えるために一般的に使用されています」と誤って述べられています18。
上述の議論から、NaHS は揮発、酸化、光分解によって溶液から失われることが示されているため、溶液からの H2S の損失を減らすためのいくつかの提案がなされている。第 1 に、H2S の蒸発は、ガス - 液体界面 13 と溶液の pH 11 に依存する。したがって、蒸発損失を最小限に抑えるには、前述のように 15,19 水ボトルの首をできるだけ小さくし、水の pH を許容可能な上限 (つまり、6.5～8.551) に調整して蒸発損失を最小限に抑えることができる 11。第 2 に、H2S の自然酸化は、酸素の影響と飲料水中の遷移金属イオンの存在により発生する 13 ため、アルゴンまたは窒素による飲料水の脱酸素処理 44,45 と金属キレート剤の使用 37,47 によって硫化物の酸化を減らすことができる。第 3 に、H2S の光分解を防ぐために、水ボトルをアルミホイルで包むことができる。この方法は、ストレプトゾトシンなどの光感受性物質にも適用されます55。最後に、無機硫化物塩（NaHS、Na2S、CaS）は、以前の報告56,57,58のように飲料水に溶かすのではなく、経口投与することができます。研究では、ラットに経口投与された放射性硫化ナトリウムはよく吸収され、事実上すべての組織に分布することが示されている59。現在までのほとんどの研究では、無機硫化物塩を腹腔内投与していますが、この投与経路は臨床の場ではほとんど使用されていません60。一方、ヒトでは経口投与が最も一般的で好ましい投与経路です61。したがって、げっ歯類に対するH2S供与体の影響を評価するには、経口投与を推奨します。
限界としては、我々はMB法を用いて水溶液と血清中の硫化物を測定したという点が挙げられる。硫化物を測定する方法には、ヨウ素滴定、分光光度法、電気化学的方法（電位差測定法、電流測定法、電量法、電流測定法）、クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）などがあり、その中で最も一般的に使用されている方法はMB分光光度法である62。生物試料中のH2Sを測定するMB法の限界は、酸性条件下で実施されるため生物源から硫黄が抽出され、すべての硫黄含有化合物を測定し、遊離H2Sを測定しないことである63。しかし、米国公衆衛生協会によれば、MB法は水中の硫化物を測定する標準的な方法である65。したがって、この限界はNaHSを含む溶液の不安定性に関する主要な結果に影響を与えない。さらに、本研究では、NaHSを含む水と血清試料中の硫化物測定値の回収率はそれぞれ91％と93％であった。これらの値は、これまで報告された範囲（77～92）66と一致しており、許容できる分析精度42を示しています。なお、前臨床研究において雄のみの動物実験への過度の依存を避け、可能な限り雄と雌の両方のラットを含めるよう、国立衛生研究所（NIH）のガイドライン67に従い、雄と雌の両方のラットを使用したことは注目に値します68。この点は、他の研究者によっても強調されています69,70,71。
結論として、本研究の結果は、飲料水から調製したNaHS溶液は不安定であるため、H2Sの生成には使用できないことを示しています。この投与経路では、動物は不安定で予想よりも低いNaHS濃度に曝露されるため、本研究の知見はヒトには当てはまらない可能性があります。
本研究で使用および/または分析されたデータセットは、対応する著者からの合理的な要求に応じて入手可能です。
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