分泌経路におけるタンパク質選別は、細胞の区画化と恒常性の維持に不可欠です。シェルを介した選別に加えて、分泌輸送過程におけるキネシン選別における脂質の役割は、未だ解明されていない長年の基本的な疑問です。本研究では、3D同時多色高解像度リアルタイムイメージングを行い、新たに合成されたグリコシルホスファチジルイノシトール固定化タンパク質（非常に長いセラミド脂質部分を持つ）が、膜貫通タンパク質が使用する部位とは異なる特殊な小胞体ネット出口部位に集積・分類されることをin vivoで証明しました。さらに、小胞体膜におけるセラミドの鎖長がこの選別選択性に重要であることを示しました。本研究は、分泌経路において脂質鎖長に基づいてタンパク質カーゴを選択的な輸出部位に分類する、初の直接的なin vivo証拠を提供するものです。
真核細胞では、小胞体（ER）で合成されたタンパク質は、分泌経路を通る輸送中に選別され、適切な細胞内目的地に届けられます（1）。コートを介した選別に加えて、特定の脂質が特定のタンパク質を特定の膜ドメインに集積させることで、選択的な出口としても機能する可能性があると長い間推測されていました（2-5）。しかし、この可能性のある脂質ベースのメカニズムを証明する直接的な生体内証拠はまだありません。この基本的な問題を解決するために、酵母でグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカータンパク質（GPI-AP）がERからどのように選択的に輸出されるかを研究しました。GPI-APは、脂質で結合したさまざまな細胞表面タンパク質です（6、7）。GPI-APは、糖脂質部分（GPIアンカー）を介して形質膜の外側リーフレットに付着した分泌タンパク質です。これらは、ER内腔で保存的な翻訳後修飾としてGPIアンカーを受け入れます（8）。結合後、GPI-APはゴルジ体（5、9）を通ってERから細胞膜へと移動します。GPIアンカーの存在により、GPI-APは分泌経路に沿って膜貫通分泌タンパク質（他の細胞膜タンパク質を含む）とは別々に輸送されます（5、9、10）。酵母細胞では、GPI-APは小胞体内で他の分泌タンパク質から分離され、その後、コートタンパク質複合体II（COPII）で包まれた独自の小胞にパッケージ化されます（6、7）。ER輸出過程におけるこの分類プロセスの決定要因は不明ですが、このメカニズムには脂質、特にGPIアンカーの脂質部分の構造的リモデリングが必要であると推測されています（5、8）。酵母では、GPI脂質リモデリングはGPIが結合した直後に始まり、多くの場合、セラミドが26炭素長鎖飽和脂肪酸（C26:0）に結合する原因となります（11、12）。 C26セラミドは、これまでのところ酵母細胞によって産生される主要なセラミドです。これはERで合成され、その大部分はCOPII小胞を介してゴルジ装置に輸送されます（13）。GPI-APのERからの輸送には、継続的なセラミド合成が特に必要であり（14、15）、逆に、ゴルジ装置でのセラミドからイノシトールリン酸セラミド（IPC）への変換は、GPIアンカー合成に依存します（16）。人工膜を用いた生物物理学的研究では、非常に長いアシル鎖セラミドが凝集して、独自の物理的特性を持つ秩序だったドメインを形成できることが示されています（17、18）。これらのデータは、C26セラミドとC26セラミドを含むGPI-APが、比較的乱雑なER膜脂質環境において、その物理的特性を利用して秩序だった領域または領域に凝集するという仮説につながります。これは主に短鎖不飽和グリセロ脂質（C16:1およびC18:1）で構成されています（19、20）。これらの領域は特定のER出口部位（ERES）に選択的に集中し、そこでセラミドとセラミドベースのGPI-APが同じ専用のCOPII小胞でゴルジ体へ共輸送されます（5）。
この研究では、蛍光標識タンパク質を同時に観察できる最先端の顕微鏡技術である超解像共焦点リアルタイムイメージング顕微鏡（SCLIM）を使用して、この脂質ベースのメカニズムを直接テストしました。3色3次元（3D）画像は、生細胞内で非常に高い解像度と速度を備えています（21、22）。
我々はまず、SCLIM技術を適用して、S. cerevisiae のERから出た後の膜貫通分泌タンパク質から、C26セラミド基を持つ通常のGPI-APがどのように選別されるかをさらに詳細に調べた。ERの分類を確認するために、新たに合成されたカーゴがERESに入る様子をin vivoで直接可視化できる遺伝子システムを使用した（7、23）。カーゴとして、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識したC26セラミドベースのGPI-AP Gas1と、近赤外蛍光タンパク質（iRFP）で標識した膜貫通分泌タンパク質Mid2を選択した。どちらも形質膜を標的とする（24～26）。sec31-1温度感受性変異体では、これら2つのカーゴはガラクトース誘導性プロモーターと構成的ERESマーカーの下で発現する。極端な温度（37℃）では、sec31-1変異がCOPIIコート成分Sec31の機能に影響を与え、COPIIの発芽とERからの輸送を阻害するため、新たに合成されたカーゴがERに蓄積する（23）。低温（24℃）に冷却すると、sec31-1変異細胞は分泌領域から回復し、蓄積された新しい合成カーゴがERから輸送され始めた。CLIM可視化により、新たに合成されたGas1-GFPとMid2-iRFPのほとんどが、37℃でインキュベートした後、24℃で5分間放出されたsec31-1変異細胞のERに蓄積していることが示された（図1）。Mid2-iRFPはER膜全体に分布し、Gas1-GFPは不連続なER膜領域に集中して集積するため、それらの分布は完全に異なる（図1、A～Cおよび動画S1）。さらに、図1Dに示すように、Gas1-GFPクラスターにはMid2-iRFPが存在しない。これらの結果は、GPI-APと膜貫通タンパク質が早期に異なるER膜領域に分離されたことを示している。Gas1-GFPクラスターは、mCherryのCOPIIコートタンパク質Sec13で標識された特定のERESに隣接している（図1、EおよびF、および動画S1）（23）。
sec31-1細胞は、ガラクトース誘導分泌物、長鎖アシル鎖（C26）セラミドGPI-AP Gas1-GFP（GPI-AP、緑）、膜貫通タンパク質Mid2-iRFP（TMP、青）を発現し、この構築的ERES標識Sec13-mCherry（ERES、マゼンタ）を37℃で30分間インキュベートした後、24℃に移し、5分後にSCLIMで画像化しました。（A～C）は、平面（A）の代表的なマージまたは単一の2D画像、10個のz断面の2D投影画像（B）、またはカーゴとERESマーカーの3D細胞半球画像（C）を示しています。スケールバーは1μm（AおよびB）。スケール単位は0.551μm（C）。 Gas1-GFPは離散的なER領域またはクラスターで検出されたが、Mid2-iRFPはER膜全体に検出され分布していた（C）。（D）グラフは、白い矢印線に沿ったGas1-GFPクラスター内のGas1-GFPとMid2-iRFPの相対蛍光強度を示している（左）。AUは任意単位。（EおよびF）は、商品とERESマークを組み合わせた3D画像を表す。Gas1-GFPクラスターは特定のERESの近くで検出された。スケール単位は0.551μmである。（F）白い実線の矢印は、ERESに関連するGas1-GFPクラスターを示している。中央および右のパネルは、マージされた拡大3D画像と選択されたGas1-GFPクラスターの回転ビューを示している。
Gas1-GFPクラスターと特定のERESとの密接な空間的関係は、Gas1-GFPが選択的なERESに入ることができることを示唆しており、これはMid2-iRFPがERから出る際に使用する選択性とは異なります。この可能性に対処するため、1つまたは2つの貨物のみのERES比率を定量化しました（図2、A～C）。ほとんどのERES（70%）には1種類の貨物のみが含まれていることがわかりました。図2Cの下部の画像は、Gas1-GFPのみ（図1）またはMid2-iRFPのみ（図2）を含むERESの2つの典型的な例を示しています。対照的に、ERESの約20%には、同じ領域で重なり合う2種類の貨物が含まれています。一部のERES（10%）には2種類の貨物が含まれていることがわかりましたが、それらは明らかに異なる領域に分離されていました。したがって、この統計分析は、ERから輸出された後、GPI-AP Gas1-GFPと膜貫通貨物Mid2-iRFPが異なるERESに分割されることを示しています（図2D）。この選別効率は、以前の生化学的分析（6）および形態学的決定（7）と非常によく一致しています。また、ERESに入る隔離されたカーゴの挙動も観察できます（図2Eおよび動画S2）。図2Eは、Gas1-GFP（パネル3）またはMid2-iRFP（パネル4）のごく一部のみが片側からERESに入り、離散的な領域に閉じ込められていることを示しています。図2Eのパネル5は、Gas1-GFPとMid2-iRFPが同じERESで見られることがあるものの、異なる側から入り、異なるCOPII小胞を表している可能性のある別々の領域に集中していることを示しています。また、C26セラミドベースのGPI-AP Gas1の選択的ERESとしての分離と分類が特異的であることも確認しました。これは、別の膜貫通分泌カーゴであるGFPタグ付き形質膜タンパク質Axl2（27）がMid2-iRFPと同様の挙動を示したためです（図S1および動画S3）。新たに合成された Axl2-GFP は Mid2-iRFP と同様に ER 膜を通して分布し (図 S1、A および B)、ほとんどの ERES で Mid2-iRFP と共局在します (図 S1、B ～ D)。図 1.S1C のパネル 1 および 2 は、2 つの膜貫通カーゴが重なる ERES の典型的な 2 つの例を示しています。これらの場合、両方の貨物が一緒に ERES に入ります (図 S1E、パネル 3 および動画 S3)。
ガラクトース誘導性分泌物である Gas1-GFP (GPI-AP、緑) および Mid2-iRFP (TMP、青) と構成的 ERES 標識 Sec13-mCherry (ERES、マゼンタ) を発現する sec31-1 細胞を 37 °C に置いた。 °C で 30 分間インキュベートした後、24 °C に移して分泌ブロックを解除し、20 分間後に SCLIM で画像化する。 (A ～ C) カーゴと ERES でマークされた 10 の z 断面の代表的な 2D 投影画像 (A; スケール バー、1μm) または 3D 細胞半球画像 (B および C; スケール ユニット、0.456μm)。 (B) の下のパネルと (C) のパネルは、ERES (マゼンタ) に存在する物品 [Gas1-GFP (灰色) および Mid2-iRFP (水色)] のみを表示するように処理された画像を表示している。 (C) 開いた矢印: ERES は 1 つの貨物のみを運ぶ (1 ～ 4)。灰色の矢印: ERES は分離された貨物を含む (5)。白い実線の矢印: ERES は共存する貨物を含む。下: 選択された単一の ERES には Gas1-GFP (1) または Mid2-iRFP (2) のみが含まれる。スケールバー、100 nm。(D) (C) で説明した顕微鏡写真の定量化。1 つの貨物 (Gas1-GFP または Mid2-iRFP) のみ、分離された貨物、および重複する貨物を含む ERES の平均割合。3 つの独立した実験で、54 個の細胞で n=432。エラー バー = SD。両側不対 t 検定。*** P = 0.0002。(E) (C) でマークされた隔離された貨物の選択された ERES の 3D 画像。 Gas1-GFP（緑色）（3）またはMid2-iRFP（青色）（4）は、ERES（マゼンタ色）の片側から入り込み、ERES内の狭い領域に留まります。場合によっては、両方のタイプのカーゴが同じERES（5）に同じ側から入り込み、ERES内の隔離された領域に閉じ込められます。スケールバーは100 nmです。
次に、ER膜に存在する長鎖アシルセラミド（C26）が、Gas1の選択的ERESへの特異的なクラスター化と選別を促進するという仮説を検証した。この目的のために、2つの内因性セラミド合成酵素Lag1とLac1をGhLag1（ワタのLag1ホモログ）に置き換えた改変酵母株GhLag1を使用した。その結果、細胞膜セラミドが野生型よりも短い酵母株が得られた（図3A）（28）。質量分析（MS）分析により、野生型株では全セラミドの95%が非常に長い（C26）鎖セラミドであるのに対し、GhLag1ではセラミドの85%が非常に長い（C18およびC16）鎖セラミドであることが明らかになった。これまでのところ、GhLag1膜で検出された主なセラミドはC18およびC16セラミドですが、MS分析では、GhLag1株で発現したGas1-GFPのGPIアンカーが野生型脂質と同等のC26セラミドを含んでいることも確認されました。品質は同じです（図3A）（26）。したがって、これは、セラミドリモデリング酵素Cwh43がC26セラミドに対して非常に選択的であることを意味します。図26に示すように、GhLag1株では少量のC26セラミドからGPIアンカーを優先的に組み込みます。S2（29）。しかしながら、GhLag1の細胞膜は基本的にC18-C16セラミドのみを含み、Gas1-GFPは依然としてC26セラミドを含んでいます。この事実により、この株はERにおける膜セラミドのアシル鎖長のクラスと選別という仮説的役割の問題を具体的に解決するための理想的なツールとなります。次に、従来の蛍光顕微鏡を用いて、温度感受性変異アレルsec31-1を持つGhLag1におけるC26 Gas1-GFPのクラスター蓄積能を調べた。この株では、ER膜セラミドには長い(C18-C16)鎖のみが存在する（図3）。sec31-1では、Gas1-GFPの大部分がクラスターに集中していたが、長い(C18-C16)セラミドER膜を持つsec31-1 GhLag1では、Gas1-GFPは主にクラスター化せず、ER膜全体に分布していた。正確には、C26セラミドに基づくクラスター形成は特定のERESと密接に関連しているため（図1）、次に、このプロセスがER輸出タンパク質機構の機能にも関与しているかどうかを調べた。 GPI-APは、ER輸出に特殊なCOPIIシステムを使用し、これはGPIアンカーのグリカン部分のTed1による構造リモデリングによって積極的に制御されます（30、31）。組換えGPI-グリカンは、膜貫通カーゴ受容体p24複合体によって認識され、次に主要なCOPIIカーゴ結合サブユニットSec24の特定のアイソフォームであるLst1を選択的にリクルートし、GPI-APに富むCOPII小胞を形成します（31-33）。そこで、これらの単一タンパク質（p24複合体の構成要素Emp24、GPI-グリカンリモデリング酵素Ted1、および特定のCOPIIサブユニットLst1）の欠失とsec31-1変異株を組み合わせた二重変異体を構築し、Gas1クラスターGFPを形成できるかどうかを研究しました（図3）。 sec31-1emp24Δ および sec31-1ted1Δ では、Gas1-GFP は主にクラスター化されておらず、sec31-1 GhLag1 で以前に見られたように ER 膜全体に分布していることが観察されたが、sec31-1lst1Δ では Gas1-GFP は sec31-1 と同様であった。これらの結果は、ER 膜に C26 セラミドが存在することに加えて、Gas1-GFP のクラスター化には p24 複合体への結合も必要であり、特定の Lst1 リクルートメントは必要ないことを示している。次に、ER 膜のセラミドの鎖長が Gas1-GFP の p24 への結合を調節できる可能性を検討した。しかし、膜に C18-C16 セラミドが存在すると、p24 複合体によって再構築された GPI グリカン (図 S3 および S4、A および B) や GPI-AP への結合、GPI-AP の輸出能力に影響がないことがわかった。 COPIIサブタイプLst1をリクルートします（図S4C）。したがって、C26セラミド依存性のクラスタリングは、異なるER輸出タンパク質機構とのタンパク質相互作用を必要としませんが、脂質の長さによって駆動される代替の選別機構を支持します。次に、ER膜内のセラミドアシル鎖の長さが、Gas1-GFPを選択的ERESとして効果的に分類するために重要であるかどうかを分析しました。短鎖セラミドを持つGhLag1株のGas1はERを出て形質膜に入るため（図S5）、選別がセラミドアシル鎖の長さによって駆動される場合、GhLag1株のGas1は方向転換され、同じ膜を持つERES製品と交差すると考えられます。
(A) GhLag1 の細胞膜には主に短い C18-C16 セラミドが含まれていますが、Gas1-GFP の GPI アンカーは野生型細胞と同じ C26 IPC を持っています。上図: 質量分析法 (MS) による野生型 (Wt) および GhLag1p 株の細胞膜中のセラミドのアシル鎖長分析。データは全セラミドの割合を示しています。3 回の独立した実験の平均。エラー バー = SD。両側不対 t 検定。**** P ＜0.0001。下図: 野生型および GhLag1p 株で発現した Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI アンカーに存在する IPC のアシル鎖長の MS 分析。データは全 IPC シグナルの割合を示しています。5 回の独立した実験の平均。エラー バー = SD。両側不対 t 検定。ns、重要でない。P = 0.9134。 (B) ガラクトース誘導性 Gas1-GFP を発現する sec31-1、sec31-1 GhLag1、sec31-1emp24Δ、sec31-1ted1Δ および sec31-1lst1Δ 細胞の蛍光顕微鏡写真。細胞を 37°C で 30 分間インキュベートし、24°C に移した後、通常の蛍光顕微鏡観察を行った。白い矢印: ER Gas1-GFP クラスター。開いた矢印: クラスター化されていない Gas1-GFP は ER 膜全体に分布しており、ER の特徴的な核リング染色を示している。スケールバー、5μm。(C) (B) で説明した顕微鏡写真の定量化。点状の Gas1-GFP 構造を持つ細胞の平均割合。3 つの独立した実験で、n≥300 個の細胞。エラーバー = SD。両側不対 t 検定。**** P ＜0.0001。
この問題を直接解決するために、sec31-1温度感受性変異アレルを持つGhLag1でGas1-GFPとMid2-iRFPのSCLIM可視化を行った（図4および動画S4）。ERを37℃に保持し、その後24℃に解放した後、従来の顕微鏡で観察したところ、新しく合成されたGas1-GFPのほとんどは凝集せず、ER膜全体に分布していた（図4、AおよびB）。さらに、ERESの大部分（67%）には、2種類のカーゴが共存している（図4D）。図4Cのパネル1と2は、Gas1-GFPとMid2-GFPが重なり合ったERESの2つの典型的な例を示している。さらに、両方のカーゴが同じERESにリクルートされた（図4E、パネル3および動画S4）。したがって、我々の結果は、ER膜におけるセラミドアシル鎖の長さが、ERタンパク質の凝集および分類の重要な決定因子であることを示している。
ガラクトース誘導分泌物、Gas1-GFP（GPI-AP、緑）およびMid2-iRFP（TMP、青）を発現するSec31-1 GhLag1細胞、および構成的にERES標識されたSec13-mCherry（ERES、マゼンタ）を発現する細胞を37°Cでインキュベートする。30分間インキュベートした後、24°Cに下げて分泌物を放出し、20分後にSCLIMで画像化する。（A～C）カーゴとERESでマークされた10個のz断面の代表的な2D投影画像（A、スケールバー、1μm）または3D細胞半球画像（BおよびC、スケール単位、0.45μm）。（B）の下のパネルと（C）のパネルは、ERES（マゼンタ）に存在する物品のみを表示するように処理された画像を表示している［Gas1-GFP（灰色）およびMid2-iRFP（水色）］。 (C) 白い塗りつぶし矢印: ERES、商品が重なっている。開いた矢印: ERES には 1 つのアイテムのみが含まれている。下段: 選択された ERES には、(C) でマークされた重複商品 (1 と 2) がある。スケールバー、100 nm。(D) (C) で説明した顕微鏡写真の定量化。sec31-1 および sec31-1 GhLag1 ユニットには、1 つのカーゴ (Gas1-GFP または Mid2-iRFP) のみが含まれており、孤立したカーゴと重複するカーゴの ERES の平均割合。3 つの独立した実験で、n = 432 (54 個の細胞 (sec31-1)) および n = 430 (47 個の細胞 (sec31-1 GhLag1))。エラー バー = SD。両側不対 t 検定。*** P = 0.0002 (sec31-1) および ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)。 （E）選択されたERESの3D画像。（C）にマークされた重複するカーゴ（3）を含む。Gas1-GFP（緑）とMid2-iRFP（青）は同じ側からERES（マゼンタ）に接近し、同じERES制限領域内に留まる。スケールバー、100 nm。
この研究は、脂質ベースのタンパク質カーゴが分泌経路で選択的輸出部位に分類されるという直接的な生体内証拠を提供し、分類選択性におけるアシル鎖長の重要性を明らかにします。強力で最先端の顕微鏡技術であるSCLIMを使用して、酵母で新たに合成されたGas1-GFP（非常に長いアシル鎖（C26）セラミド脂質部分を持つ主要な形質膜GPI-AP）を実証しました。離散的なERにクラスター化された領域は特定のERESに関連していますが、膜貫通分泌タンパク質はER膜全体に分布しています（図1）。さらに、これら2種類の物品は異なるERESに選択的に入ります（図2）。膜内の細胞セラミドのアシル鎖長はC26からC18-C16に短縮され、Gas1-GFPクラスターは離散的なER領域に破壊され、Gas1-GFPは膜貫通タンパク質とともに同じERESを介してERから出るように経路変更される（図3および図3）。4）。
GPI-APはERから出る際に特殊なタンパク質機構を利用しますが、C26セラミド依存性分離はERES特化につながる可能性のある異なるタンパク質相互作用に依存しないことが分かりました（図S4およびS5）。代わりに、我々の発見は、脂質ベースのタンパク質クラスター形成とそれに続く他のカーゴの排除によって駆動される別の分類機構を支持しています。我々の観察によると、特定のERESに関連するGas1-GFP領域またはクラスターには膜貫通分泌タンパク質Mid2-iRFPが存在しないことが示されており、これはC26セラミド依存性GPI-APクラスターが関連するERESへの進入を促進し、同時に膜貫通分泌タンパク質を排除することを示しています。分泌物はこの特定のERESに入ります（図1および2）。対照的に、ER膜にC18-C16セラミドが存在してもGPI-APは領域またはクラスターを形成しないため、同じERESへの膜貫通分泌タンパク質の排除や置換は起こりません（図3および4）。したがって、C26セラミドは特定のERESに結合したタンパク質のクラスター化を促進することによって、分離と分類を促進すると考えられます。
この C26 セラミド依存的なクラスター形成を特定の ER 領域でどのように実現するのか? 膜セラミドが横方向に分離する傾向により、GPI-AP と C26 セラミドが、より短く不飽和なグリセロ脂質を含む ER 膜のより不規則な脂質環境で、小さく瞬時に秩序だった脂質を形成する可能性がある。 品質クラスター (17、18)。 これらの小さな一時的なクラスターは、p24 複合体に結合した後、さらに融合してより大きく安定したクラスターになる (34)。 これと一致して、C26 Gas1-GFP が p24 複合体と相互作用してより大きな目に見えるクラスターを形成する必要があることを示した (図 3)。 p24 複合体は、酵母の 4 つの異なる p24 膜貫通タンパク質から構成されるヘテロ接合オリゴマー (35) であり、多価結合を提供し、小さな GPI-AP クラスターの架橋につながり、それによってより大きな安定したクラスターを生成する (34)。 GPI-APのタンパク質エクトドメイン間の相互作用も、哺乳類極性上皮細胞におけるゴルジ輸送中に示されているように、凝集に寄与する可能性がある（36）。しかし、ER膜にC18-C16セラミドが存在する場合、p24複合体がGas1-GFPに結合すると、大きな分離クラスターは形成されない。根本的なメカニズムは、長鎖アシルセラミドの特定の物理的および化学的特性に依存する可能性がある。人工膜の生物物理学的研究によると、長鎖（C24）および短鎖（C18-C16）アシル鎖セラミドの両方が相分離を引き起こす可能性があるが、長鎖アシル鎖セラミド（C24）のみが、高い曲率とフィルムの曲げを促進してフィルムを再形成することができる。相互参照を介して（17、37、38）。 Emp24 のヒト相同体である TMED2 の膜貫通ヘリックスは、細胞質小葉内の C18 セラミドベースのスフィンゴミエリンと選択的に相互作用することが示されている (39)。分子動力学 (MD) シミュレーションを使用して、C18 セラミドと C26 セラミドの両方が Emp24 膜貫通ヘリックスの細胞質小葉の周囲に蓄積し、同様の嗜好性を示すことがわかりました (図 S6)。注目すべきは、これは Emp24 の膜貫通ヘリックスが膜内の脂質の非対称分布につながる可能性があることを示していることです。これは、哺乳類細胞に基づく最近の結果です。同様の MD シミュレーションは、エーテル脂質の存在も示しています (40)。したがって、ER26 の 2 つの小葉内の C26 セラミドが局所的に濃縮されていると推測されます。管腔小葉内の GPI-AP が多価の p24 に直接結合し、細胞質小葉内の p24 の周囲に C26 セラミドが蓄積すると、付随するタンパク質凝集が促進され、フィンガーを介して膜の湾曲が生成され (41)、GPI-AP が ERES に隣接する離散的な領域に分離され、ER 膜の高度に湾曲した領域も促進される (42)。以前の報告は、提案されたメカニズムを支持している (43、44)。オリゴレクチン、病原体、または抗体が形質膜上のセラミドベースの糖脂質 (GSL) に多価結合すると、大きな GSL 凝集が引き起こされ、相分離が促進され、膜の変形と内部化が引き起こされる (44)。岩渕ら（43）は、GSLラクトシルセラミドに結合した多価リガンドが、長い（C24）アシル鎖が存在する場合には短い（C16）アシル鎖が存在する場合には存在しないことを発見し、結合した好中球では、小葉上の細胞質Lynを介したシグナル伝達がアシル鎖によってインターディジテーションされることがわかった。
哺乳類の極性上皮細胞では、頂端形質膜レベルへの抗ゴルジネットワーク（TGN）の濃度がGPI-APの分離と選別を制御します（10、45）。この凝集はGPI-APのオリゴマー化によって促進されます（36）が、酵母に見られるセラミド鎖長にも依存する可能性があります。哺乳類のGPI-APはエーテル脂質ベースのアンカーを持ち、その化学構造は非常に長いアシル鎖セラミドとは大きく異なりますが、最近の研究では、両方の脂質が進化的に類似した物理的および化学的特性と機能を持っていることがわかりました（40）。したがって、哺乳類細胞のエーテル脂質部分は酵母のC26セラミドに類似している可能性があり、その役割は膜内の長鎖セラミドと結合してGPI-APの凝集と選別を促進することです。この可能性は直接検証する必要があるものの、これまでの研究結果は、長鎖アシルセラミドのゴルジ体への輸送は細胞質輸送タンパク質によって行われるのではなく、酵母のようにGPIアンカーの合成に依存していることを示唆している。したがって、進化的に保存されたメカニズムは、非常に長いアシル鎖セラミドとGPI-AP（13、16、20、46、47）を同じ輸送小胞内で選択的に共輸送できると考えられる。
酵母および哺乳類極性上皮細胞系では、GPI-APの凝集および他の形質膜タンパク質からの分離はすべて細胞表面に到達する前に起こる。Paladinoら（48）は、哺乳類極性上皮細胞のTGN上では、GPI-APのクラスター形成は、GPI-APを頂端形質膜に選択的に分類するために必要なだけでなく、GPI-APのクラスター形成組織とその生物学的活性も制御することを発見した。細胞表面。酵母では、この研究により、ER上のC26セラミド依存性GPI-APクラスターが形質膜上のGPI-APのクラスター形成と機能的活性を制御できることが示された（24、49）。このモデルと一致して、GhLag1細胞はGPI阻害剤または細胞壁の完全性に影響を与える薬剤にアレルギー反応を示し（28）、酵母細胞の接合時に投影される先端セラミドの機能的なGas1-GFPクラスター（49）の必要性は、GPAエラーを示しています。しかし、細胞表面の機能的な組織が脂質の長さに基づく選別方法によってERからプログラムされているかどうかをさらにテストすることは、今後の研究の対象となります。
本研究で使用した Saccharomyces cerevisiae 株は表 S1 に記載されています。生細胞イメージング用の SCLIM の MMY1583 株と MMY1635 株は、W303 株を背景として構築されました。蛍光タンパク質タグ付き Sec13-mCherry を発現するこれらの株は、pFA6a プラスミドをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) ベースの方法を使用して構築されました (23)。GAL1 プロモーターの制御下で蛍光タンパク質で標識された Mid2-iRFP を発現する株は、次のように構築されました。pKTiRFP-KAN ベクター (E. O'Shea 氏からの提供、Addgene プラスミド番号 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; 研究リソース識別子 (RRID): Addgene_64687) から iRFP-KanMx 配列を PCR 増幅し、内因性 Mid2 の C 末端に挿入しました。 Mid2-iRFPゲノム配列を増幅し、GAL1プロモーターにクローニングした後、それをインテグレーションプラスミドpRS306のNot I-Sac I部位に組み込んだ。得られたプラスミドpRGS7をPst Iで線状化し、URA3遺伝子座に組み込んだ。
Gas1-GFP融合遺伝子は、セントロメア（CEN）プラスミドのGAL1プロモーターの制御下で発現され、その構築は以下のとおりである。Gas1-GFP配列は、pRS416-GAS1-GFPプラスミド（24）（L. Popolo氏からの提供）からPCRにより増幅され、CENプラスミドpBEVY-GL LEU2（C. Miller氏からの提供；Addgeneプラスミド番号51225；http://n2t.net/addgene: 51225；RRID: Addgene_51225）のXma I–Xho I部位にクローニングされた。得られたプラスミドはpRGS6と名付けられた。Axl2-GFP融合遺伝子もpBEVY-GL LEU2ベクターのGAL1プロモーターの制御下で発現され、その構築は以下のとおりである。 Axl2-GFP配列は、pRS304-p2HSE-Axl2-GFPプラスミド（23）からPCRにより増幅され、pBEVY-GL LEU2ベクターのBam HI-Pst I部位にクローニングされた。得られたプラスミドはpRGS12と命名された。本研究で使用したオリゴヌクレオチドの配列は表S2に記載されている。
この菌株には、炭素源として 0.2% アデニンと 2% グルコース [YP-デキストロース (YPD)]、2% ラフィノース [YP-ラフィノース] リッチ酵母エキスタンパク質 p (YP) 培地 (1% 酵母エキスと 2% タンパク質 ept) (YPR)] または 2% ガラクトース [YP-ガラクトース (YPG)] が添加されたか、または栄養に必要な適切なアミノ酸と塩基を補給するために合成最小培地 (0.15% 酵母窒素ベースと 0.5% 硫酸アンモニウム) で、炭素源として 2% グルコース (合成グルコース最小培地) または 2% ガラクトース (合成ガラクトース最小培地) が含まれていた。
リアルタイムイメージングのために、GAL1プロモーター制御下で構築物を発現する温度感受性sec31-1変異細胞を、YPR培地で24℃で一晩培養し、対数増殖中期まで増殖させた。24℃のYPG培地で1時間誘導した後、細胞をSG培地で37℃で30分間インキュベートし、その後24℃に移して分泌阻害を解除した。コンカナバリンAを用いて細胞をスライドガラス上に固定し、SCLIMでイメージングを行った。 SCLIMは、オリンパスIX-71倒立蛍光顕微鏡とUPlanSApo 100×1.4開口数油浸レンズ（オリンパス）、高速かつ高信号対雑音比の回転ディスク共焦点スキャナ（横河電機）、カスタム分光器、カスタム冷却システムを組み合わせたものです。システムのイメージインテンシファイア（浜松ホトニクス）は、最終倍率×266.7の拡大レンズシステムと電子を増倍する電荷結合素子カメラ（浜松ホトニクス）を提供できます（21）。画像取得はカスタムソフトウェア（横河電機）で行います。3D画像については、カスタムメイドの圧電アクチュエータを使用して対物レンズを垂直方向に振動させ、100 nm間隔で光学部品をスタックに収集しました。Zスタック画像は3Dボクセルデータに変換され、回転ディスク共焦点顕微鏡で使用される理論的な点像分布関数を使用してVolocityソフトウェア（PerkinElmer）でデコンボリューション処理を行います。 Volocityソフトウェアを用いて共局在解析のための閾値を自動的に設定することにより、カーゴを含むERESを測定した。ラインスキャン解析はMetaMorphソフトウェア（Molecular Devices社製）を用いて行った。
統計的有意性の判定にはGraphPad Prismソフトウェアを使用します。両側t検定および通常の1要因分散分析（ANOVA）では、群間の差がP <0.05の場合に有意な影響があるとみなされます（*）。
Gas1-GFPの蛍光顕微鏡観察では、対数増殖期の細胞をYPD培地で一晩培養し、遠心分離によって回収し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、氷上で少なくとも15分間インキュベートした後、以前に記載したCheck (24)に従って顕微鏡下で観察を行った。画像取得には、対物レンズ、L5 (GFP)フィルター、浜松ホトニクス製カメラ、およびApplication Suite X (LAS X)ソフトウェアを搭載したLeica DMi8顕微鏡(HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS)を使用した。
サンプルは、65℃で10分間SDSサンプルバッファーで変性させ、その後SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で分離した。イムノブロッティング分析では、1レーンあたり10μlのサンプルをロードした。一次抗体：ウサギポリクローナル抗Gas1を1:3000希釈、ウサギポリクローナル抗Emp24を1:500希釈、ウサギポリクローナル抗GFP（H. Riezman氏からの提供）を1:3000希釈で使用した。マウスモノクローナル抗Pgk1抗体は1:5000希釈で使用した（J. de la Cruz氏からの提供）。二次抗体：西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG（IgG）を1:3000希釈で使用した（Pierce社）。 HRP標識ヤギ抗マウスIgGを1:3000の希釈率で使用した（Pierce社製）。免疫応答領域は、SuperSignal West Pico試薬（Thermo Fisher Scientific社製）の化学発光法によって観察した。
（31）に記載されているように、濃縮されたER画分に対して自然免疫沈降実験を行った。簡単に言うと、酵母細胞をTNEバッファー［50 mMトリス-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよびプロテアーゼ阻害剤混合物］で600 nm（OD600）で100の吸光度で2回洗浄した。ガラスビーズで破砕し、遠心分離によって細胞破片とガラスビーズを除去した。上清を4℃で17,000 gで15分間遠心分離した。沈殿物をTNEに再懸濁し、ジギタリスサポニンを最終濃度1%になるように添加した。懸濁液を4℃で1時間回転させながらインキュベートし、その後、4℃で13,000 gで60分間遠心分離して不溶性成分を除去した。Gas1-GFP免疫沈降の場合、まずサンプルを空のアガロースビーズ（ChromoTek）とともに4℃で1時間プレインキュベートし、次にGFP-Trap_A（ChromoTek）とともに4℃で3時間インキュベートした。免疫沈降したビーズを0.2%ジゴキシゲニンを含むTNEで5回洗浄し、SDSサンプルバッファーで溶出し、SDS-PAGEで分離し、イムノブロッティングで分析した。
（31）に記載されているように、濃縮ER画分に対して架橋測定を行った。簡単に説明すると、濃縮ER画分を0.5 mMジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（Pierce、Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL、USA；20℃、20分）とインキュベートした。架橋反応はグリシン（最終濃度50 mM、5分、20℃）を添加することで停止させた。
前述の通り（50）、野生型株および GhLag1 株のセラミドの MS 分析を行った。簡単に言うと、細胞を YPD 培地で 30 °C で対数増殖期（ 3 ～ 4 OD600 単位/ml）まで培養し、25 × 10⁷ 個の細胞を回収した。トリクロロ酢酸で代謝を停止させた。抽出溶媒［エタノール、水、エーテル、ピリジン、および 4.2 N アンモニウム水（15:15:5:1:0.018 v/v）］と 1.2 nmol の内部標準 C17 セラミド（860517、Avanti polar lipid 品質）を使用した。モノメチルアミン試薬［メタノール、水、n-ブタノール、およびメチルアミン溶液（4:3:1:5 v/v）］を使用して抽出物を弱アルカリ加水分解し、その後、水飽和 n-ブタノールを使用して脱塩した。最後に、抽出物をポジティブモード溶媒［クロロホルム/メタノール/水（2:7:1）+ 5 mM 酢酸アンモニウム］に再懸濁し、質量分析計に注入した。スフィンゴ脂質分子の同定と定量には、多重反応モニタリング（MRM）を行った。TSQ Vantage 3次四重極質量分析計（Thermo Fisher Scientific）には、脂質分析用のロボット式ナノフローイオン源 Nanomate HD（Advion Biosciences、ニューヨーク州イサカ）が搭載されている。衝突エネルギーは、各セラミドカテゴリーに合わせて最適化されている。MSデータはポジティブモードで取得した。各生物学的複製について、脂質シグナルは3回の独立した測定の中央値である。
（31）に記載されているように、Gas1-GFPを発現する細胞（800×107）を自然免疫沈降に供した。精製されたGas1-GFPをSDS-PAGEで分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。PVDFをアミドブラックで染色することにより、タンパク質を可視化した。Gas1-GFPバンドをPVDFから切り出し、メタノールで5回、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）グレードの水で1回洗浄した。膜片を500μlの0.3 M NaOAc（pH 4.0）緩衝液と500μlの新たに溶解した1 M亜硝酸ナトリウム混合物とともに37℃で3時間インキュベートすることにより、脂質画分がGas1-GFPから放出され、グルコサミンとイノシトールの間のイノシンリン酸セラミドが溶解した（51）。その後、メンブレンストリップをLC-MSグレードの水で4回洗浄し、室温で乾燥させ、分析まで-80℃の窒素雰囲気下で保存した。コントロールとして、各実験でPVDFメンブレンのブランクサンプルを使用した。Gas1-GFPから抽出した脂質は、記載されているようにMSで分析した（50）。簡単に言うと、GPI脂質を含むPVDFストリップを75μlのネガティブモールド溶媒[クロロホルム/メタノール（1:2）+ 5 mM酢酸アンモニウム]に再懸濁し、エレクトロスプレーイオン化（ESI）-MRM/MSスフィンゴ脂質種の分析（TSQ Vantage）に通した。この場合、MSデータはネガティブイオンモードで取得した。
前述のように、GPIアンカーの脂質部分は[3H]-イノシトール標識GPI-AP（16）から分離されました。脂質は、溶媒系（クロロホルム-メタノール-0.25% KCl 55:45:10）を用いた薄層クロマトグラフィーで分離され、FLA-7000（富士フイルム）で可視化されました。
Gas1-GFPを発現する細胞（600×10⁷）をTNEバッファーで2回洗浄し、ガラスビーズで破砕した後、遠心分離して細胞破片とガラスビーズを除去した。上清を4℃で1時間、17,000 gで遠心分離した。沈殿物をTNEで洗浄し、0.2%ジギタリスサポニンを含むTNE中で1 U PI-PLC（Invitrogen）とともに37℃で1時間インキュベートした。酵素処理後、膜を4℃で1時間、17,000 gで遠心分離して除去した。Gas1-GFPを免疫沈降させるため、上清をGFP-Trap_A（ChromoTek）とともに4℃で一晩インキュベートした。SDS-PAGEで分離した精製Gas1-GFPをクマシーブリリアントブルーで染色した。 Gas1-GFP染色バンドを水道管周囲の灰色部分から切り出し、ヨードアセトアミドによるアルキル化とジチオスレイトールによる還元後、ゲル内トリプシン消化を行った。トリプシン消化ペプチドとGPIグリカンを含むペプチドを抽出し乾燥させた。乾燥させたペプチドを20μlの水に溶解した。その一部をLCに注入した（8μl）。オクタデシルシラン（ODS）カラム（Develosil 300ODS-HG-5、内径150mm×1.0mm、野村化学、愛知県）を用いて、特定のグラジエント条件下でペプチドを分離した。移動相は溶媒A（0.08%ギ酸）と溶媒B（80%アセトニトリル中の0.15%ギ酸）である。 Accela HPLC システム (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ボストン) を使用して、50 μl min-1 の流速で 5 分間、55 分以内に溶媒 A でカラムを溶出し、その後、溶媒 B の濃度を 40% に増加させた。溶出液は ESI イオン源に連続的に導入され、トリプシン消化ペプチドと GPI グリカンを含むペプチドは LTQ Orbitrap XL (ハイブリッド リニア イオン トラップ - オービトラップ質量分析計、Thermo Fisher Scientific) で分析された。MS 設定では、キャピラリー イオン源の電圧は 4.5 kV に設定され、トランスファー キャピラリーの温度は 300 °C に維持された。キャピラリー電圧とチューブ レンズ電圧はそれぞれ 15 V と 50 V に設定された。 MSデータは、質量範囲300/m/z（質量電荷比（m/z）3000）で、正イオンモード（分解能60,000、質量精度10ppm）で取得しました。MS/MSデータは、LTQ Orbitrap XLのイオントラップを介して取得されます（データが依存する最初の3桁は、衝突誘起解離（CID）です）。
MD シミュレーションは GROMACS (52) ソフトウェアと MARTINI 2 力場 (53-55) を使用して実行されました。次に、CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) を使用して、ジオレオイルホスファチジルコリン (DOPC) と Cer C18 または DOPC と Cer C26 を含む二重層を構築しました。Cer C26 のトポロジーと座標は、スフィンゴシンテールから余分なビーズを取り除くことによって DXCE から得られます。以下の手順を使用して二重層のバランスを取り、実行し、システムの最後の座標を使用して Emp24 を含むシステムを構築します。酵母 Emp24 の膜貫通ドメイン (173 ～ 193 番目の残基) は、Visual MD (VMD) ツール分子構造 (58) を使用して α ヘリックスとして構築されました。次に、重なり合う脂質を除去した後、タンパク質を粗大顆粒化し、CHARMM GUI を使用して二重層に挿入しました。最終的なシステムは、1202個のDOPCと302個のCer C26、または1197個のDOPCと295個のCer C18およびEmp24から構成される。システムを0.150Mの濃度にイオン化する。2種類の二重層組成について、4つの独立した複製実験を行った。
脂質二重層はCHARMM GUIプロセスを使用してバランス調整されます。このプロセスでは、405,000ステップを最小化してからバランス調整し、位置制約を徐々に減らして削除し、時間ステップを0.005 psから0.02 psに増やします。平衡化後、0.02 psの時間ステップで6 µsが生成されます。Emp24を挿入した後、同じCHARMM GUIプロセスを使用してシステムを最小化およびバランス調整し、その後、本番環境で8秒間実行します。
すべてのシステムにおいて、バランス調整プロセス中は圧力はベレンゼンバロスタット（59）によって制御され、製造プロセス中は圧力はパリネロ・ラーマンバロスタット（60）によって制御されます。すべての場合において、平均圧力は 1 bar であり、半等方性圧力結合方式が使用されます。バランス調整および製造プロセスでは、速度再校正機能を備えたサーモスタット（61）を使用して、タンパク質、脂質、および溶媒粒子の温度をそれぞれ結合します。全操作中、目標温度は 310K です。非結合相互作用は、0.005 のバッファー許容値を持つ Verlet 方式を使用してペアリングリストを生成することによって計算されます。クーロン項は、反応場と 1.1 nm のカットオフ距離を使用して計算されます。ファンデルワールス項は、1.1 nm のカットオフ距離を持つカットオフ方式を使用し、電位ドリフトには Verlet カットオフ方式が使用されます（62）。
VMD を使用すると、DOPC リン酸ビーズまたはセラミド AM1 ビーズとタンパク質の間のカットオフ波長は 0.7 nm となり、タンパク質と相互作用する脂質の数を計算します。次の式に従って、(63) のように枯渇-濃縮 (DE) 係数を計算します。DE 係数 = (タンパク質中の総脂質の量 0.7) / (タンパク質中の総脂質の量 0.7) / (総脂質中の Cer の量)
報告値は平均値として得られ、誤差範囲は標準誤差（SE）の4つの独立したコピーです。DE因子の統計的有意性はt検定[(平均DE因子-1)/SE]によって計算されます。片側分布からP値を計算してください。
GROMACSツールを用いて、トレースの最後の250ナノ秒におけるEmp24を含むシステムの2次元横方向密度マップを計算した。セラミドの濃縮/枯渇マップを得るために、Cerの密度マップをCerとDOPCのマップの合計で割り、さらに体内のCer濃度で割った。同じカラーマップスケールを使用した。
本記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 を参照してください。
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3D高解像度リアルタイムイメージングにより、選択的な出力部位におけるタンパク質選別において、セラミド鎖長が重要であることが明らかになった。
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©2020 米国科学進歩協会。無断転載を禁じます。 AAAS は、HINARI、AGORA、OARE、CHORUS、CLOCKSS、CrossRef、COUNTER のパートナーです。サイエンスアドバンス ISSN 2375-2548。