分泌経路におけるタンパク質選別は、細胞の区画化と恒常性の維持に不可欠です。シェルを介した選別に加えて、分泌輸送過程におけるキネシン選別における脂質の役割は、未だ答えが出ていない長年の基本的な問題です。本研究では、3D同時多色高解像度リアルタイムイメージングを行い、非常に長いセラミド脂質部分を持つ新しく合成されたグリコシルホスファチジルイノシトール固定化タンパク質がクラスター化し、膜貫通タンパク質が使用するものとは異なる特殊な小胞体出口部位に分類されることを生体内で証明しました。さらに、小胞体膜におけるセラミドの鎖長が、この選別選択性に決定的に重要であることを示しています。本研究は、脂質鎖長に基づいてタンパク質貨物を分泌経路の選択的な輸出部位に分類する初めての直接的な生体内証拠を提供します。
真核細胞では、小胞体（ER）で合成されたタンパク質は、輸送中に分泌経路を通って適切な細胞内目的地へと運ばれる選別を受けます（1）。コートを介した選別に加えて、特定の脂質が特定のタンパク質を特定の膜ドメインにクラスター化することで、選択的な出口点として機能する可能性も長い間推測されてきました（2-5）。しかし、この脂質ベースのメカニズムの可能性を証明する直接的な生体内証拠はまだ不足しています。この基本的な問題を解決するために、私たちは酵母を用いて、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー型タンパク質（GPI-AP）がERからどのように差別的に輸送されるかを研究しました。GPI-APは、脂質結合型細胞表面タンパク質の一種です（6,7）。GPI-APは、糖脂質部分（GPIアンカー）を介して細胞膜の外側のリーフレットに付着した分泌タンパク質です。GPIアンカーは、ER内腔において保存的翻訳後修飾として受け入れられます（8）。 GPI-APは結合後、ゴルジ体（5, 9）を通過してERから細胞膜へ輸送される。GPIアンカーの存在により、GPI-APは膜貫通分泌タンパク質（他の細胞膜タンパク質を含む）とは別に分泌経路に沿って輸送される（5, 9, 10）。酵母細胞では、GPI-APは小胞体で他の分泌タンパク質から分離され、コートタンパク質複合体II（COPII）に包まれた独自の小胞にパッケージングされる（6, 7）。ERからの輸送過程におけるこの分類過程の決定要因は不明であるが、このメカニズムには脂質、特にGPIアンカーの脂質部分の構造リモデリングが必要であると推測されている（5, 8）。酵母では、GPIが結合するとすぐにGPI脂質リモデリングが始まり、多くの場合、セラミドが26炭素長鎖飽和脂肪酸（C26:0）に結合する（11, 12）。 C26セラミドは、現在までに酵母細胞によって産生される主要なセラミドである。ERで合成され、その大部分はCOPII小胞を介してゴルジ体へ輸送される（13）。GPI-APのER輸送には、特に継続的なセラミド合成が必要であり（14, 15）、ゴルジ体におけるセラミドからイノシトールリン酸セラミド（IPC）への変換は、GPIアンカーの合成に依存する（16）。人工膜を用いた生物物理学的研究では、非常に長いアシル鎖を持つセラミドが凝集して、独特の物理的特性を持つ秩序だったドメインを形成できることが示されている（17, 18）。これらのデータから、C26セラミドと、C26セラミドを含むGPI-APが、その物理的特性を利用して、比較的乱雑なER膜脂質環境において、秩序だった領域または領域に凝集するという仮説が導かれる。主に短鎖不飽和グリセロ脂質（C16:1およびC18:1）で構成されています（19, 20）。これらの領域は特定のER出口部位（ERES）に選択的に集中し、そこでセラミドとセラミドベースのGPI-APは、同じ専用のCOPII小胞によってゴルジ体へ共輸送されます（5）。
本研究では、蛍光標識されたタンパク質を同時に観察できる最先端の顕微鏡技術である超解像共焦点リアルタイムイメージング顕微鏡（SCLIM）を使用して、この脂質ベースのメカニズムを直接テストしました。3色3次元（3D）画像は、生細胞で非常に高い解像度と速度を備えています（21、22）。
我々はまずSCLIM技術を適用し、S. cerevisiaeにおいてC26セラミド基を持つ正常なGPI-APがERを出た後に膜貫通分泌タンパク質からどのように選別されるかをさらに解明した。ERの分類を確認するために、生体内でERESに入る新しく合成されたカーゴを直接可視化できる遺伝子システムを用いた(7, 23)。カーゴとして、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識されたC26セラミドベースのGPI-AP Gas1と、近赤外蛍光タンパク質(iRFP)で標識された膜貫通分泌タンパク質Mid2を選択した。これらはいずれも細胞膜を標的とする(24–26)。sec31-1温度感受性変異体では、これら2つのカーゴはガラクトース誘導性プロモーターと恒常的ERESマーカー下で発現している。 sec31-1変異体はCOPIIコート構成タンパク質Sec31の機能に影響を与え、COPIIの発芽およびERからの輸送を阻害するため、極度の温度（37℃）下では、新しく合成されたカーゴがERに蓄積する（23）。低温（24℃）に冷却すると、sec31-1変異体細胞は分泌領域から回復し、蓄積された新しい合成カーゴがERから輸送され始めた。CLIM可視化により、sec31-1変異体細胞では、37℃で5分間培養した後、新しく合成されたGas1-GFPとMid2-iRFPの大部分がまだERに蓄積しており、その後24℃で5分間放出された（図1）。Mid2-iRFPはER膜全体に分布しているのに対し、Gas1-GFPはER膜の不連続領域に集中して集まっているため、両者の分布は全く異なる（図1、A～Cおよび動画S1）。さらに、図1Dに示すように、Gas1-GFPクラスターにはMid2-iRFPが存在しない。これらの結果は、GPI-APと膜貫通タンパク質が早期に異なるER膜領域に分離したことを示唆している。Gas1-GFPクラスターは、mCherryのCOPIIコートタンパク質Sec13で標識された特定のERESに隣接している（図1EおよびF、動画S1）（23）。
sec31-1細胞は、ガラクトース誘導分泌物、長鎖アシル鎖（C26）セラミドGPI-AP Gas1-GFP（GPI-AP、緑）および膜貫通タンパク質Mid2-iRFP（TMP、青）を発現し、この構成的ERES標識Sec13-mCherry（ERES、マゼンタ）を37°Cで30分間インキュベートした後、24°Cに移し、5分後にSCLIMで画像化した。（A～C）は、平面の代表的な合成または単一の2D画像（A）、10個のz断面の2D投影画像（B）、またはカーゴおよびERESマーカーの3D細胞半球画像（C）を示している。スケールバーは1μm（AおよびB）。スケール単位は0.551μm（C）。 Gas1-GFPはERの個別の領域またはクラスターで検出されたのに対し、Mid2-iRFPはER膜全体に分布して検出されました（C）。（D）グラフは、Gas1-GFPクラスター内のGas1-GFPとMid2-iRFPの相対的な蛍光強度を白い矢印の線に沿って示しています（左）。AUは任意単位です。（EとF）は、商品とERESマークを組み合わせた3D画像を表しています。Gas1-GFPクラスターは特定のERESの近くで検出されました。スケールの単位は0.551μmです。（F）白い実線の矢印は、ERESに関連するGas1-GFPクラスターを示しています。中央と右のパネルは、選択したGas1-GFPクラスターの合成された拡大3D画像と回転ビューを示しています。
Gas1-GFP クラスターと特定の ERES との密接な空間関係は、Gas1-GFP が選択的な ERES に入ることができることを示し、これは Mid2-iRFP が ER を離れる際に使用する選択性とは異なります。この可能性に対処するために、1 つまたは 2 つの貨物についてのみ ERES 比率を定量化しました (図 2、A ～ C)。ほとんどの ERES (70%) には 1 種類の貨物のみが含まれていることがわかりました。図 2C の下の画像は、Gas1-GFP のみ (図 1)、または Mid2-iRFP のみ (図 2) を含む ERES の 2 つの典型的な例を示しています。対照的に、ERES の約 20% には、同じ領域に重なり合う 2 つの貨物が含まれています。一部の ERES (10%) には 2 種類の貨物が含まれていましたが、それらは明らかに異なる領域に分離されていました。したがって、この統計分析は、ER が輸出された後、GPI-AP Gas1-GFP と膜貫通貨物 Mid2-iRFP が異なる ERES に分割されることを示しています (図 2D)。この選別効率は、これまでの生化学分析 (6) および形態学的決定 (7) と非常に一致しています。 また、隔離された貨物が ERES に入る際の挙動も観察できます (図 2E および動画 S2)。 図 2E は、Gas1-GFP (パネル 3) または Mid2-iRFP (パネル 4) のごく一部だけが片側から ERES に入り、個別の領域に限定されていることを示しています。 図 2E のパネル 5 は、Gas1-GFP と Mid2-iRFP が同じ ERES に存在することがあるものの、異なる側から入り、異なる COPII 小胞を表す可能性のある別々の領域に集中していることを示しています。 また、C26 セラミドベースの GPI-AP Gas1 が選択的 ERES として分離および分類されたことは、別の膜貫通分泌貨物である GFP タグ付き細胞膜タンパク質 Axl2 (27 ) が Mid2-iRFP と同様の挙動を示していることからも、特異的であることが確認されました (写真 S1 および動画 S3)。新たに合成されたAxl2-GFPは、Mid2-iRFPと同様にER膜を介して分布し（図S1、AおよびB）、ほとんどのERESにおいてMid2-iRFPと共局在する（図S1、B～D）。図1のパネル1および2。S1Cは、2つの膜貫通型輸送体が重なり合うERESの典型的な例を2つ示している。これらの場合、両方の輸送体が一緒にERESに入る（図S1E、パネル3および動画S3）。
ガラクトース誘導性分泌物である Gas1-GFP (GPI-AP、緑) と Mid2-iRFP (TMP、青)、および恒常的 ERES 標識 Sec13-mCherry (ERES、マゼンタ) を発現している sec31-1 細胞を 37 °C で 30 分間インキュベートした後、24 °C に移して分泌ブロックを解除し、20 分後に SCLIM でイメージングしました。 (A ～ C) カーゴと ERES でマークされた 10 個の z セクションの代表的な 2D 投影イメージ (A、スケールバー、1 μm) または 3D 細胞半球イメージ (B および C、スケール単位、0.456 μm)。 (B) の下のパネルと (C) のパネルは、ERES (マゼンタ) [Gas1-GFP (灰色) と Mid2-iRFP (水色)] に存在する貨物のみを表示するように処理された画像を示しています。 (C) 開いた矢印：ERESは1つの貨物（1～4）のみを運びます。灰色の矢印：ERESは分離された貨物（5）を含みます。白い実線の矢印：ERESは共存する貨物を含みます。下：選択された単一のERESはGas1-GFP（1）またはMid2-iRFP（2）のみを含みます。スケールバー、100 nm。(D) (C)で説明した顕微鏡写真の定量化。1つの貨物（Gas1-GFPまたはMid2-iRFP）のみを含むERES、分離された貨物、および重複する貨物の平均割合。3回の独立した実験において、54個の細胞中n=432。エラーバー=SD。両側独立t検定。*** P = 0.0002。(E) (C)でマークされた隔離された貨物の選択されたERESの3D画像。 Gas1-GFP（緑）（3）またはMid2-iRFP（青）（4）は、ERES（マゼンタ）の片側から入り込み、ERES内の狭い領域に閉じ込められます。場合によっては、両方の種類の貨物が同じ側から同じERES（5）に入り込み、ERES内の孤立した領域に閉じ込められることがあります。スケールバーは100 nmです。
次に、ER膜に存在する長いアシル鎖セラミド（C26）が、Gas1を選択的なERESに特異的にクラスター化および選別するという仮説を検証しました。このために、2つの内因性セラミド合成酵素Lag1とLac1をGhLag1（綿のLag1ホモログ）に置き換えた改変酵母株GhLag1を使用しました。その結果、野生型よりも細胞膜セラミドが短い酵母株ができました（図3A）（28）。質量分析（MS）分析により、野生型株では全セラミドの95％が非常に長い（C26）鎖セラミドであるのに対し、GhLag1では、セラミドの85％が非常に長い（C18およびC16）ことが示されました。）では、セラミドのわずか2％が非常に長い（C26）鎖セラミドです。これまでGhLag1膜で検出された主なセラミドはC18とC16セラミドでしたが、MS分析により、GhLag1株で発現したGas1-GFPのGPIアンカーには、野生型脂質に匹敵するC26セラミドが含まれていることも確認されました。品質は同じです（図3A）（26）。したがって、これは、セラミドリモデリング酵素Cwh43がC26セラミドに対して非常に選択的であることを意味します。図26に示すように、GhLag1株の少量のC26セラミドからGPIアンカーを優先的に組み込みます。S2（29）。それにもかかわらず、GhLag1の細胞膜には基本的にC18-C16セラミドのみが含まれますが、Gas1-GFPには依然としてC26セラミドが含まれています。この事実は、この株をERの膜セラミドのアシル鎖長の問題を具体的に解決するための理想的なツールにします。クラスとソーティングの仮説的な役割。そこで、まず、sec31-1の温度感受性変異体アレルを持つGhLag1において、C26 Gas1-GFPがクラスター状に集積する能力を、ER膜セラミドに長鎖（C18-C16）のみが存在する通常の蛍光顕微鏡下で調べました（図3）。その結果、sec31-1ではほとんどのGas1-GFPがクラスター状に集中しているのに対し、ER膜に長鎖（C18-C16）のセラミドを持つsec31-1 GhLag1ではGas1-GFPは主にクラスター状に集積せず、ER膜全体に分布していることが分かりました。より正確には、C26セラミドを基盤としたクラスター形成は特異的なERESと密接に関連していることから（図1）、次に、このプロセスがER輸出タンパク質機構の機能にも関与しているかどうかを調査しました。 GPI-APはER輸出に特別なCOPIIシステムを用いており、これはTed1によるGPIアンカーのグリカン部分の構造リモデリングによって能動的に制御されている（30, 31）。組み換えGPI-グリカンは膜貫通カーゴ受容体p24複合体によって認識され、今度は主要COPIIカーゴ結合サブユニットSec24の特異的アイソフォームであるLst1を選択的にリクルートし、GPI-APに富むCOPII小胞の形成が必要となる（31-33）。そこで我々は、sec31-1変異株に対してこれらの単一タンパク質（p24複合体構成要素Emp24、GPI-グリカンリモデリング酵素Ted1、および特異的COPIIサブユニットLst1）の欠失を組み合わせた二重変異体を構築し、Gas1クラスターGFPを形成できるかどうかを検討した（図3）。 sec31-1emp24Δとsec31-1ted1Δでは、Gas1-GFPは主にクラスター化されておらず、sec31-1 GhLag1で以前に見られたものと同様にER膜全体に分布しているのに対し、sec31-1lst1Δでは、Gas1-GFPはsec31-1と同様であることが観察された。これらの結果は、ER膜におけるC26セラミドの存在に加えて、Gas1-GFPのクラスター化にはp24複合体への結合も必要であり、特定のLst1リクルートメントは必要ないことを示しています。次に、ER膜におけるセラミドの鎖長がGas1-GFPのp24への結合を制御できる可能性を検討しました。しかし、膜におけるC18-C16セラミドの存在は、p24複合体によって再構築されるGPI-グリカン（図S3とS4、AとB）やGPI-APへの結合およびGPI-APの輸出能力には影響を及ぼさないことがわかった。 COPIIサブタイプLst1をリクルートする（図S4C）。したがって、C26セラミド依存性クラスタリングは、異なるER輸出タンパク質機構とのタンパク質相互作用を必要とせず、脂質長によって駆動される代替的な選別機構を支持する。次に、ER膜におけるセラミドアシル鎖長が、Gas1-GFPを選択的ERESとして効果的に分類するために重要であるかどうかを解析した。短鎖セラミドを有するGhLag1株のGas1はERを出て細胞膜に入るため（図S5）、選別がセラミドアシル鎖の長さによって駆動されるならば、GhLag1株のGas1は方向転換して同じ膜を持つERES製品と交配できると考えられる。
(A) GhLag1 の細胞膜には主に短い C18-C16 セラミドが含まれていますが、Gas1-GFP の GPI アンカーは野生型細胞と同じ C26 IPC を保持しています。上図: 野生型 (Wt) および GhLag1p 株の細胞膜におけるセラミドのアシル鎖長を質量分析 (MS) で分析した結果。データは総セラミドの割合を示しています。3 回の独立した実験の平均。エラー バー = SD。両側独立 t 検定。**** P ＜0.0001。下図: 野生型および GhLag1p 株で発現した Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI アンカーに存在する IPC のアシル鎖長の MS 分析。データは総 IPC シグナルの割合を示しています。5 回の独立した実験の平均。エラー バー = SD。両側独立 t 検定。ns、重要ではありません。P = 0.9134。 (B) ガラクトース誘導性 Gas1-GFP を発現する sec31-1、sec31-1 GhLag1、sec31-1emp24Δ、sec31-1ted1Δ、sec31-1lst1Δ 細胞の蛍光顕微鏡写真。37°C で 30 分間インキュベートし、24°C 以降に渡して通常の蛍光顕微鏡検査を実施します。白い矢印: ER Gas1-GFP クラスター。開いた矢印: クラスター化されていない Gas1-GFP は ER 膜全体に分布しており、ER 特有の核リング染色を示しています。スケールバー、5 μm。(C) (B) で説明した顕微鏡写真の定量化。点状の Gas1-GFP 構造を持つ細胞の平均パーセンテージ。3 回の独立した実験で、n≥300 細胞。エラーバー = SD。両側無対 t 検定。**** P ＜0.0001。
この問題を直接解決するために、我々はsec31-1温度感受性変異アレルを持つGhLag1におけるGas1-GFPとMid2-iRFPのSCLIM可視化を行った（図4および動画S4）。 ERを37°Cで保持し、続いて24°Cで放出した後、新しく合成されたGas1-GFPのほとんどは、従来の顕微鏡で観察されたようにクラスター化してER膜全体に分布していませんでした（図4、AおよびB）。 さらに、ERESの大部分（67％）には、その中に共存する2種類のカーゴが含まれています（図4D）。 図4Cのパネル1および2は、Gas1-GFPとMid2-GFPが重なり合うERESの2つの典型的な例を示しています。 さらに、両方の貨物は同じERESにリクルートされました（図4E、パネル3および動画S4）。したがって、私たちの結果は、ER 膜内のセラミド アシル鎖の長さが ER タンパク質の凝集と分類の重要な決定要因であることを示しています。
Sec31-1 GhLag1細胞は、ガラクトース誘導分泌物であるGas1-GFP（GPI-AP、緑）とMid2-iRFP（TMP、青）および恒常的なERES標識Sec13-mCherry（ERES、マゼンタ）を発現しています。37°Cでインキュベートし、30分間インキュベートした後、24°Cに下げて分泌物を放出させ、20分後にSCLIMで画像化します。（A～C）カーゴとERESでマークされた10個のZ断面の代表的な2D投影画像（A、スケールバー、1μm）または3D細胞半球画像（BおよびC、スケール単位、0.45μm）。（B）の下のパネルと（C）のパネルは、ERES（マゼンタ）に存在する貨物（Gas1-GFP（灰色）とMid2-iRFP（水色））のみを表示するように処理された画像を示しています。 (C) 白塗り矢印：ERES、財の重複。白抜き矢印：ERESには1つの財のみが含まれる。下段：選択されたERESには、(C)でマークされた重複財（1と2）がある。スケールバー、100 nm。(D) (C)で説明した顕微鏡写真の定量化。sec31-1およびsec31-1 GhLag1ユニットには、1つのカーゴ（Gas1-GFPまたはMid2-iRFP）のみが含まれており、孤立したカーゴと重複するカーゴのERESの平均割合が示されている。3つの独立した実験において、54個の細胞（sec31-1）でn = 432、47個の細胞（sec31-1 GhLag1）でn = 430。エラーバー = SD。両側無対t検定。*** P = 0.0002（sec31-1）、** P = 0.0031（sec31-1 GhLag1）。 (E) (C) でマークされた重なり合う貨物 (3) を含む選択されたERESの3D画像。Gas1-GFP (緑) とMid2-iRFP (青) はERES (マゼンタ) に同じ側から接近し、同じERES制限領域に留まります。スケールバーは100 nmです。
本研究は、脂質ベースのタンパク質貨物が分泌経路において選択的な輸送部位に分類されることを生体内で直接的に証明し、分類選択性におけるアシル鎖長の重要性を明らかにしました。強力かつ最先端の顕微鏡技術であるSCLIMを用いて、酵母において新たに合成されたGas1-GFP（非常に長いアシル鎖（C26）セラミド脂質部分を有する主要な細胞膜GPI-AP）の存在を示しました。個々のERにクラスター化された領域は特定のERESと関連しており、膜貫通型分泌タンパク質はER膜全体に分布しています（図1）。さらに、これら2種類の貨物はそれぞれ異なるERESに選択的に流入します（図2）。細胞膜中のセラミドのアシル鎖長はC26からC18-C16に短縮され、Gas1-GFPクラスターは個別のER領域に破壊され、Gas1-GFPは同じERESを介して膜貫通タンパク質とともにERから出るように再経路設定されます（図3および図3）。4）。
GPI-AP は ER から出るために特殊なタンパク質メカニズムを使用しますが、C26 セラミド依存性の分離は、ERES の特殊化につながる可能性のある差別的タンパク質相互作用に依存しないことが分かりました (図 S4 および S5)。代わりに、私たちの研究結果は、脂質ベースのタンパク質クラスター化とそれに続く他のカーゴの排除によって駆動される代替分類メカニズムを支持しています。私たちの観察では、特定の ERES に関連する Gas1-GFP 領域またはクラスターには、膜貫通分泌タンパク質 Mid2-iRFP が欠けていることが示されています。これは、C26 セラミド依存性 GPI-AP クラスターが関連する ERES への進入を促進し、同時に膜貫通分泌タンパク質を排除することを示しています。分泌物はこの特定の ERES に入ります (図 1 および 2)。対照的に、ER 膜に C18-C16 セラミドが存在しても、GPI-AP は領域またはクラスターを形成せず、そのため、同じ ERES への膜貫通分泌タンパク質を排除または置き換えません (図 3 および 4)。したがって、C26 セラミドは特定の ERES にリンクされたタンパク質のクラスタリングを促進することで分離と分類を促進すると考えられます。
この C26 セラミド依存性の特定の ER 領域へのクラスター形成をどのように達成するのでしょうか。膜セラミドが横方向に分離する傾向により、GPI-AP と C26 セラミドは、より短く不飽和のグリセロ脂質を含む ER 膜のより不規則な脂質環境で、小さく瞬時に秩序だった脂質を形成します。高品質のクラスター (17、18)。これらの小さな一時的なクラスターは、p24 複合体に結合した後、さらに融合して、より大きく安定したクラスターになります (34)。これに一致して、C26 Gas1-GFP は、より大きな目に見えるクラスターを形成するために p24 複合体と相互作用する必要があることを示しました (図 3)。p24 複合体は、酵母の 4 つの異なる p24 膜貫通タンパク質から構成されるヘテロ接合性オリゴマーです (35)。これは多価結合を提供し、小さな GPI-AP クラスターの架橋につながり、より大きく安定したクラスター (34) を生成します。 GPI-APのタンパク質エクトドメイン間の相互作用も、哺乳類の極性上皮細胞におけるゴルジ体輸送中に示されているように、凝集に寄与している可能性がある（36）。しかし、C18-C16セラミドがER膜に存在する場合、p24複合体がGas1-GFPに結合しても、大きな独立したクラスターは形成されない。この基礎となるメカニズムは、長アシル鎖セラミド（C24）と短アシル鎖セラミド（C18-C16）の両方が相分離を引き起こす可能性があるが、長アシル鎖セラミド（C24）のみが高い曲率と膜の曲げを促進して膜の形状を変えることができることが示されている。これは相互参照を通じて起こる（17、37、38）。 Emp24のヒトホモログであるTMED2の膜貫通ヘリックスは、細胞質小葉中のC18セラミドをベースとしたスフィンゴミエリンと選択的に相互作用することが示されている（39）。分子動力学（MD）シミュレーションを用いた結果、C18およびC26セラミドの両方がEmp24膜貫通ヘリックスの細胞質小葉の周囲に蓄積し、それらは同様の選好性を示すことがわかった（図S6）。これは、Emp24の膜貫通ヘリックスが膜中の脂質の非対称な分布につながる可能性があることを示唆しており、哺乳類細胞に基づく最近の結果である。同様のMDシミュレーションでは、エーテル脂質の存在も示されている（40）。したがって、ER26の2つの小葉中のC26セラミドは局所的に濃縮されていると推測される。内腔小葉中のGPI-APが多価p24に直接結合し、細胞質小葉中のp24周囲にC26セラミドが蓄積すると、フィンガーを介して付随するタンパク質凝集と膜湾曲が促進される（41）。その結果、GPI-APはERESに隣接する個別の領域に分離し、ER膜の高度に湾曲した領域にも有利となる（42）。このメカニズムは、以前の報告で裏付けられている（43, 44）。オリゴレクチン、病原体、または抗体が細胞膜上のセラミド系スフィンゴ糖脂質（GSL）に多価結合すると、大規模なGSL凝集が引き起こされ、相分離が促進され、膜の変形と内部化が引き起こされる（44）。岩渕ら（43）は、長い（C24）アシル鎖が存在する場合、短い（C16）アシル鎖では存在しないが、GSLラクトシルセラミドに結合した多価リガンドが大きなクラスターの形成と膜陥入を誘導し、結合した好中球のリーフレット上の細胞質Lyn媒介シグナル伝達がアシル鎖によって噛み合わされていることを見出した。
哺乳類の極性上皮細胞では、抗ゴルジ体ネットワーク（TGN）の頂端細胞膜レベルへの集中が、GPI-APの分離と選別を制御している（10、45）。この凝集はGPI-APオリゴマー化によって引き起こされる（36）が、酵母に見られるセラミド鎖の長さにも依存している可能性がある。哺乳類のGPI-APはエーテル脂質ベースのアンカーを持ち、その化学構造は非常に長いアシル鎖セラミドとは大きく異なるが、最近の研究では、両方の脂質が進化的に類似した物理的および化学的特性と機能を有することが明らかになった（40）。したがって、哺乳類細胞のエーテル脂質部分は、酵母のC26セラミドに類似している可能性があり、その役割は膜内の長鎖セラミドと会合してGPI-APの凝集と選別を促進することである。この可能性はまだ直接検証する必要があるものの、これまでの知見は、長鎖アシルセラミドのゴルジ体への輸送は細胞質輸送タンパク質ではなく、酵母と同様にGPIアンカーの合成に依存していることを示唆している。したがって、進化的に保存された機構により、非常に長鎖アシルセラミドとGPI-AP（13、16、20、46、47）を同一の輸送小胞で選択的に共輸送することが可能と考えられる。
酵母および哺乳類の極性上皮細胞系では、GPI-APの凝集と他の細胞膜タンパク質からの分離は、細胞表面に到達する前にすべて起こります。Paladinoら（48）は、哺乳類の極性上皮細胞のTGNにおいて、GPI-APのクラスター化はGPI-APを頂端細胞膜に選択的に分類するために必要であるだけでなく、GPI-APのクラスター化組織化とその生物学的活性も制御することを発見しました。細胞表面。酵母では、この研究は、ER上のC26セラミド依存性GPI-APクラスターが、細胞膜上のGPI-APのクラスター化と機能的活性を制御できることを示しました（24、49）。このモデルと一致して、GhLag1細胞はGPI阻害剤や細胞壁の完全性に影響を与える薬剤にアレルギー性を示し（28）、酵母細胞の接合時に投影される先端セラミドの機能的なGas1-GFPクラスター（49）の必要性は、G​​​​ hLag1細胞の生理学的影響の可能性を示唆しています。GPI-APエラー。しかしながら、脂質の長さに基づく選別法によって細胞表面の機能的組織化がERからプログラムされているかどうかをさらに検証することが、今後の研究課題となるでしょう。
本研究で使用したサッカロミセス・セレビシエ株を表S1に示す。生細胞イメージング用のSCLIMのMMY1583株とMMY1635株は、W303をバックグラウンドに構築された。蛍光タンパク質タグ付きSec13-mCherryを発現するこれらの株は、pFA6aプラスミドをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースの方法を使用して構築された（23）。GAL1プロモーターの制御下で蛍光タンパク質で標識されたMid2-iRFPを発現する株は、次のように構築された。pKTiRFP-KANベクター（E. O'Shea氏提供、Addgeneプラスミド番号64687; http://n2t.net/addgene: 64687; 研究資源識別子（RRID）：Addgene_64687）からiRFP-KanMx配列をPCR増幅し、内因性Mid2のC末端に挿入した。 Mid2-iRFPゲノム配列を増幅し、GAL1プロモーターにクローニングした後、組み込みプラスミドpRS306のNot I-Sac I部位に組み込みました。得られたプラスミドpRGS7をPst Iで線状化し、URA3遺伝子座に組み込みました。
Gas1-GFP融合遺伝子は、セントロメア（CEN）プラスミド中のGAL1プロモーターの制御下で発現され、その構築は以下のように行われる。Gas1-GFP配列は、pRS416-GAS1-GFPプラスミド（24）（L. Popolo氏提供）からPCRにより増幅され、CENプラスミドpBEVY-GL LEU2（C. Miller氏提供）のXma I–Xho I部位にクローニングされた。得られたプラスミドはpRGS6と命名された。Axl2-GFP融合遺伝子もpBEVY-GL LEU2ベクターのGAL1プロモーターの制御下で発現され、その構築は以下の通りである。 Axl2-GFP配列はpRS304-p2HSE-Axl2-GFPプラスミド（23）からPCR増幅し、pBEVY-GL LEU2ベクターのBam HI-Pst I部位にクローニングした。得られたプラスミドはpRGS12と命名された。本研究で使用したオリゴヌクレオチドの配列は表S2に示されている。
この菌株は、0.2% アデニンおよび 2% グルコース [YP-デキストロース (YPD)]、2% ラフィノース [YP-ラフィノース] を豊富に含む酵母エキスタンパク質 p (YP) 培地 (1 % 酵母エキスおよび 2% タンパク質 ept) で補充されました。 (YPR)] または 2% ガラクトース [YP-ガラクトース (YPG)] を炭素源として含むか、または合成最少培地 (0.15% 酵母窒素ベースおよび 0.5% 硫酸アンモニウム) で栄養に必要な適切なアミノ酸と塩基を補充し、2% グルコース (合成グルコース最少培地) または 2% ガラクトース (合成ガラクトース最少培地) を炭素源として含みました。
リアルタイムイメージングのために、GAL1プロモーター下でコンストラクトを発現する温度感受性sec31-1変異細胞をYPR培地で24℃で一晩培養し、対数増殖中期まで培養した。YPG培地で24℃、1時間誘導した後、細胞をSG培地で37℃、30分間インキュベートし、その後24℃に移して分泌ブロックを解除した。コンカナバリンAを用いて細胞をスライドガラス上に固定し、SCLIMでイメージングした。 SCLIMは、オリンパスIX-71倒立蛍光顕微鏡とUPlanSApo 100×1.4開口数オイルレンズ（オリンパス）、高速・高信号対雑音比の回転ディスク共焦点スキャナ（横河電機）、カスタム分光計、カスタム冷却システムを組み合わせたシステムです。システムのイメージインテンシファイア（浜松ホトニクス）は、最終倍率266.7倍の拡大レンズシステムと電子を増倍する電荷結合素子カメラ（浜松ホトニクス）を提供できます（21）。画像取得は、カスタムソフトウェア（横河電機）によって行われます。3D画像については、カスタムメイドの圧電アクチュエータを使用して対物レンズを垂直に振動させ、100nm間隔で光学部品をスタックに収集しました。Zスタック画像は3Dボクセルデータに変換され、回転ディスク共焦点顕微鏡で使用される理論的な点広がり関数を使用して、Volocityソフトウェア（PerkinElmer）によるデコンボリューション処理が行われます。 Volocityソフトウェアを用いてコロケーション解析のための閾値を自動設定し、貨物を含むERESを測定しました。ラインスキャン解析はMetaMorphソフトウェア（Molecular Devices社）を用いて実施しました。
統計的有意性を判断するには、GraphPad Prismソフトウェアを使用してください。両側スチューデントt検定および通常の一元配置分散分析（ANOVA）検定では、群間差はP <0.05（*）に有意な影響を与えるとみなされます。
Gas1-GFPの蛍光顕微鏡観察では、対数増殖期の細胞をYPDで一晩培養し、遠心分離により回収した。その後、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、氷上で少なくとも15分間インキュベートした後、前述のCheck (24)と同様に顕微鏡下で観察を行った。画像取得には、対物レンズ、L5（GFP）フィルター、Hamamatsuカメラ、Application Suite X（LAS X）ソフトウェアを搭載したLeica DMi8顕微鏡（HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS）を使用した。
サンプルはSDSサンプルバッファーを用いて65℃で10分間変性させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で分離した。免疫ブロッティング解析には、各レーンに10 μlのサンプルをロードした。一次抗体：ウサギポリクローナル抗Gas1抗体（1:3000希釈）、ウサギポリクローナル抗Emp24抗体（1:500希釈）、ウサギポリクローナル抗GFP抗体（H. Riezman氏より提供）（1:3000希釈）を使用した。マウスモノクローナル抗Pgk1抗体（J. de la Cruz氏より提供）（1:5000希釈）を使用した。二次抗体：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG（IgG）抗体（Pierce社製）（1:3000希釈）を使用した。 HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体（Pierce社製）を1:3000の希釈率で使用した。免疫応答領域は、SuperSignal West Pico試薬（Thermo Fisher Scientific社製）を用いた化学発光法で観察した。
（31）に記載の通り、濃縮ER画分を用いて自然免疫沈降実験を行った。簡単に説明すると、酵母細胞をTNE緩衝液（50 mMトリス-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよびプロテアーゼ阻害剤混合物）で、吸光度600 nm（OD600）、吸光度100で2回洗浄した。ガラスビーズで破砕した後、遠心分離により細胞片とガラスビーズを除去した。上清を17,000 g、4℃で15分間遠心分離した。ペレットをTNEに再懸濁し、ジギタリスサポニンを最終濃度1%になるように添加した。懸濁液を4℃で1時間ローテーターでインキュベートした後、4℃、13,000 gで60分間遠心分離し、不溶性成分を除去した。Gas1-GFP免疫沈降法では、まずサンプルを空のアガロースビーズ（ChromoTek社製）と4℃で1時間プレインキュベートし、次にGFP-Trap_A（ChromoTek社製）と4℃で3時間インキュベートした。免疫沈降したビーズは0.2%ジゴキシゲニンを含むTNEで5回洗浄し、SDSサンプルバッファーで溶出後、SDS-PAGEで分離し、免疫ブロッティングで解析した。
（31）に記載の通り、濃縮ER画分を用いて架橋反応の測定を行った。簡潔に述べると、濃縮ER画分を0.5 mMジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（Pierce、Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL、米国；20℃、20分間）でインキュベートした。架橋反応はグリシン添加（最終濃度50 mM、5分間、20℃）により停止した。
以前報告したように（50）、野生型およびGhLag1株のセラミドの質量分析を行った。簡単に説明すると、細胞をYPDで30℃で指数関数増殖期（3～4 OD600単位/ml）まで増殖させ、25×107個の細胞を収穫した。代謝はトリクロロ酢酸でクエンチした。抽出溶媒［エタノール、水、エーテル、ピリジン、4.2N水酸化アンモニウム（15:15:5:1:0.018 v/v）］と1.2 nmolの内部標準C17セラミド（860517、Avanti社製極性脂質）を使用した。モノメチルアミン試薬［メタノール、水、n-ブタノール、メチルアミン溶液（4:3:1:5 v/v）］を使用して抽出物を弱アルカリ加水分解し、水飽和n-ブタノールで脱塩した。最後に、抽出物をポジティブモード溶媒（クロロホルム/メタノール/水（2:7:1）+ 5 mM酢酸アンモニウム）に再懸濁し、質量分析計に注入しました。スフィンゴ脂質分子の同定と定量のため、マルチリアクションモニタリング（MRM）を実施しました。TSQ Vantage三次四重極質量分析計（Thermo Fisher Scientific）には、脂質分析用のロボット式ナノフローイオン源Nanomate HD（Advion Biosciences、ニューヨーク州イサカ）が搭載されています。衝突エネルギーはセラミドのカテゴリーごとに最適化されています。MSデータはポジティブモードで取得しました。各生物学的反復における脂質シグナルは、3回の独立した測定の中央値です。
(31)で説明したように、Gas1-GFPを発現している細胞（800×107）を自然免疫沈降にかけた。精製されたGas1-GFPをSDS-PAGEで分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。タンパク質は、PVDFをアミドブラックで染色して可視化した。Gas1-GFPバンドをPVDFから切り取り、メタノールで5回、液体クロマトグラフィー-MS（LC-MS）グレードの水で1回洗浄した。膜ストリップを500μlの0.3 M NaOAc（pH 4.0）緩衝液と500μlの新しく溶解した1 M亜硝酸ナトリウム混合物で37°Cで3時間インキュベートすると、Gas1-GFPから脂質画分が放出され、グルコサミンとイノシトールの間にイノシンリン酸セラミドが溶解した（51）。その後、膜ストリップをLC-MSグレードの水で4回洗浄し、室温で乾燥させ、分析まで-80℃の窒素雰囲気下で保管した。対照として、各実験でPVDF膜のブランクサンプルを使用した。Gas1-GFPから抽出された脂質は、文献(50)に記載のようにMS分析を行った。つまり、GPI脂質を含むPVDFストリップを75μlのネガティブモールド溶媒[クロロホルム/メタノール（1:2）+ 5 mM酢酸アンモニウム]に再懸濁し、スフィンゴ脂質種のエレクトロスプレーイオン化（ESI）-MRM/MS分析（TSQ Vantage）にかけた。この場合、MSデータはネガティブイオンモードで得られた。
前述の通り、GPIアンカーの脂質部分は[3H]-イノシトール標識GPI-AP（16）から分離した。脂質は、溶媒系（クロロホルム：メタノール：0.25% KCl = 55:45:10）を用いた薄層クロマトグラフィーによって分離し、FLA-7000（富士フイルム）を用いて可視化した。
Gas1-GFPを発現している細胞（600×107個）をTNE緩衝液で2回洗浄し、ガラスビーズで破砕した後、遠心分離して細胞残渣とガラスビーズを除去した。上清を17,000 gで1時間、4°Cで遠心分離した。ペレットをTNEで洗浄し、0.2%ジギタリスサポニンを含むTNE中で1U PI-PLC（Invitrogen）とともに37°Cで1時間インキュベートした。酵素処理後、膜を17,000 gで1時間遠心分離して除去した。Gas1-GFPを免疫沈降するために、上清をGFP-Trap_A（ChromoTek）とともに4°Cで一晩インキュベートした。SDS-PAGEで分離した精製Gas1-GFPをクマシーブリリアントブルーで染色した。 Gas1-GFP染色バンドを水道管周囲の灰色部分から切り出し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、ジチオトレイトールで還元した後、トリプシンでゲル内消化を行った。トリプシン消化によりペプチドおよびGPI糖鎖を含むペプチドを抽出し、乾燥させた。乾燥ペプチドを20μlの水に溶解し、その一部（8μl）をLCに注入した。オクタデシルシラン（ODS）カラム（Develosil 300ODS-HG-5、内径150 mm×1.0 mm、野村化学工業、愛知県、日本）を用いて、特定のグラジエント条件下でペプチドを分離した。移動相は、溶媒A（0.08%ギ酸）および溶媒B（80%アセトニトリル中0.15%ギ酸）である。 Accela HPLC システム (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ボストン) を使用して、5 分間 50 μl min-1 の流速で 55 分以内に溶媒 A をカラムに流し、その後溶媒 B の濃度を 40% に増加しました。 (米国)。溶出液は連続的に ESI イオン源に導入され、トリプシンペプチドおよび GPI グリカンを含むペプチドが LTQ Orbitrap XL (ハイブリッド線形イオントラップ-オービトラップ質量分析計、Thermo Fisher Scientific) で分析されました。MS セットアップでは、キャピラリーソースの電圧を 4.5 kV に設定し、トランスファーキャピラリーの温度を 300°C に維持しました。キャピラリー電圧とチューブレンズ電圧は、それぞれ 15 V と 50 V に設定されます。 MS データは、質量範囲 300/m/z、質量/電荷比 (m/z) 3000 で、正イオン モード (分解能 60,000、質量精度 10 ppm) で取得されました。MS/MS データは、LTQ Orbitrap XL のイオン トラップを通じて取得されました (データが依存する最初の 3 桁は、衝突誘起解離 (CID) です)。
MDシミュレーションは、GROMACS（52）ソフトウェアとMARTINI 2力場（53-55）を用いて行った。次に、CHARMM GUI Membrane Builder（56, 57）を用いて、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）とCer C18、またはDOPCとCer C26を含む二重膜を構築した。Cer C26のトポロジーと座標は、DXCEからスフィンゴシンテールから余分なビーズを除去することによって導出された。下記のプロセスを用いて二重膜のバランスをとって実行し、システムの最後の座標を用いてEmp24を含むシステムを構築した。酵母Emp24の膜貫通ドメイン（残基173～193）は、ビジュアルMD（VMD）ツール分子構造（58）を用いてαヘリックスとして構築した。次に、重なり合う脂質を除去した後、CHARMM GUIを用いてタンパク質を粗く顆粒化し、二重膜に挿入した。最終的な系には、1202個のDOPCと302個のCer C26、または1197個のDOPCと295個のCer C18およびEmp24が含まれます。系を0.150Mの濃度にイオン化します。2種類の二重層組成について、4回の独立した反復実験を行いました。
脂質二重層はCHARMM GUIプロセスを用いてバランス調整されます。このプロセスでは、405,000ステップの最小化とバランス調整が行われます。このプロセスでは、位置制約が徐々に減少または解消され、時間ステップは0.005 psから0.02 psに増加します。平衡化後、時間ステップ0.02 psで6 µsが生成されます。Emp24を挿入した後、同じCHARMM GUIプロセスを用いてシステムを最小化およびバランス調整し、本番環境で8秒間実行します。
すべてのシステムにおいて、バランス調整プロセス中は Berendsen バロスタット (59) によって圧力が制御され、製造プロセス中は Parrinello-Rahman バロスタット (60) によって圧力が制御されます。すべてのケースで、平均圧力は 1 bar で、半等方性圧力カップリング方式が使用されます。バランスおよび製造プロセスでは、速度再較正機能付きサーモスタット (61) を使用して、タンパク質、脂質、溶媒粒子の温度をそれぞれカップリングします。操作全体を通して、目標温度は 310K です。非結合相互作用は、0.005 バッファ許容値を持つ Verlet スキームを使用してペアリング リストを生成することによって計算されます。クーロン項は、反応場と 1.1 nm のカットオフ距離を使用して計算されます。ファンデルワールス項は、カットオフ距離 1.1 nm のカットオフ スキームを使用し、電位ドリフトには Verlet カットオフ スキームが使用されます (62)。
VMDを用いて、DOPCリン酸ビーズまたはセラミドAM1ビーズとタンパク質間のカットオフ波長を0.7 nmとし、タンパク質と相互作用する脂質の数を計算する。以下の式に従って、(63)のようにDE係数を計算する。DE係数 = (タンパク質中の総脂質量 0.7) タンパク質中の総脂質量 0.7 (総脂質中のセラミド量)
報告値は平均値として算出され、エラーバーは標準誤差（SE）の独立した4つのコピーです。DE因子の統計的有意性はt検定（[(平均DE-因子-1)/標準誤差]）によって計算されます。P値は片側分布から計算されます。
GROMACSツールを用いて、Emp24を含むシステムのトレースの最後の250nsにおける2D横方向密度マップを計算した。セラミドの濃縮/枯渇マップを得るために、Cerの密度マップをCerとDOPCのマップの合計で割り、さらに体内のCer濃度で割った。カラーマップのスケールは同一である。
この記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1をご覧ください。
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ソフィア・ロドリゲス＝ガヤルド、黒川和雄、スサナ・サビド＝ボゾ、アレハンドロ・コルテス・ゴメス（アレハンドロ・コルテス＝ゴメス）、池田敦子（池田敦子）、ヴァレリア・ゾーニ（ヴァレリア・ゾーニ）、アウシリアドラ・アギレラ＝ロメロ、アナ・マリア・ペレス＝リネロ、セルヒオ・ロペス（セルヒオ・ロペス）、和賀美保（和賀美穂）、ミサコ・アルマン（ミサコ・アルマン）、ミヤコ・リマン（ミヤコ・リマン）、プラウ・アキラ、ステファノ・ファニー、中野昭彦、マヌエル・ムニス
3D 高解像度リアルタイムイメージングにより、選択的出力部位におけるタンパク質選別にセラミド鎖の長さが重要であることが明らかになりました。
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©2020 米国科学進歩協会。無断転載を禁じます。 AAAS は、HINARI、AGORA、OARE、CHORUS、CLOCKSS、CrossRef、COUNTER のパートナーです。サイエンスアドバンス ISSN 2375-2548。