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バンランゲン顆粒は、腸内細菌叢を調節し、腸管短鎖脂肪酸由来GLP-1産生を回復させることにより、マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム誘発性慢性再発性大腸炎を軽減する。
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21北京大学深圳病院薬学部、中国深圳市; 2深圳大学健康科学センター薬学部、中国深圳市; 3貴州医科大学民族医学および伝統中国医学開発応用工学技術研究センター、貴州医科大学薬学重点実験室、中国貴陽市; 4北京大学深圳病院消化器科、中国深圳市; 5貴州医科大学薬学部、薬用植物機能応用国家重点実験室、中国貴陽市; 6 北京大学深圳病院臨床検査医学科、中国深圳 [email protected] Shen Xiangchun、貴州医科大学薬学部、中国貴州省、550004、電子メール [email protected] 目的: GLP-1 ベースの療法は、炎症性腸疾患の新しい治療オプションです。Ban-Lan-Gen (BLG) 顆粒は、さまざまな炎症性疾患の治療において潜在的な抗炎症活性を示すことが知られている抗ウイルス TCM 製剤です。しかし、大腸炎に対するその抗炎症効果とその作用機序はまだ不明です。方法: マウスにデキストラン硫酸ナトリウム (DSS) 誘発慢性再発性大腸炎を確立します。疾患活動性指数、損傷の組織学的マーカー、および炎症性サイトカインレベルを実施して、BLG の保護効果を評価しました。BLG の腸内細菌叢および腸への影響は、血清 GLP-1 レベルおよび結腸 Gcg によって特徴付けられました。 SCFA 由来の GLP-1 産生。結果: BLG 治療により、体重減少、DAI、結腸短縮、結腸組織損傷、および結腸組織中の TNF-α、IL-1β、IL-6 などの炎症性サイトカインレベルが有意に減少しました。さらに、BLG 治療により、結腸炎マウスの結腸 Gcg、GPR41、GRP43 発現、血清 GLP-1 レベルが有意に回復し、Akkermansia や Prevotellaceae_UCG-001 などの SCFA 産生細菌が増加し、Eubacterium_xylanophilum_group、Ruminococcaceae_UCG-014、Intestinimonas、Oscillibacter などの細菌の存在量が減少します。さらに、BLG治療は、大腸炎マウスの糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）レベルを著しく増加させる。同時に、in vitro実験では、BLG投与マウスの糞便抽出物が、マウス小腸上皮細胞のGLP-1分泌を大幅に刺激することも示された。結論：これらの知見は、BLGが抗大腸炎効果を有することを示唆している。BLGは、少なくとも部分的には腸内細菌叢を調節し、腸管SCFA由来GLP-1産生を回復させることにより、慢性再発性大腸炎の治療薬として開発される可能性がある。キーワード：大腸炎、板藍根顆粒、腸内細菌叢、短鎖脂肪酸、GLP-1
潰瘍性大腸炎（UC）は、再発性下痢、腹痛、体重減少、粘液膿性血便を特徴とする、大腸および直腸の慢性炎症性疾患です。1 近年、欧米型ライフスタイルの普及に伴い、中国を含むこれまで発生率が低かった国々でUCの有病率が増加しています。2 この増加は公衆衛生上の大きな問題であり、患者の就労能力や生活の質に深刻な影響を及ぼしています。注目すべきは、UCの病因は依然としてほとんど解明されていないものの、遺伝、環境要因、腸内細菌叢、免疫系がUCの発症に関与していることが一般的に認められていることです。3 現在でもUCの根治法はなく、治療の目標は、臨床症状のコントロール、寛解の誘導と維持、粘膜治癒の促進、再発の減少です。従来の治療法には、アミノサリチル酸塩、コルチコステロイド、免疫抑制剤、生物学的製剤などがあります。しかし、これらの薬剤は、様々な副作用がある。4 最近、多くの症例研究により、伝統中国医学（TCM）が低毒性で潰瘍性大腸炎（UC）の症状緩和に大きな可能性を示していることが明らかになり、新しいTCM療法の開発はUCの有望な治療戦略であることが示唆されている。5-7
板藍根顆粒（BLG）は、板藍根の水抽出物から作られた伝統的な漢方薬製剤です。8 BLGは抗ウイルス効果に加えて、様々な炎症性疾患の治療において抗炎症作用を示す可能性があります。9,10 さらに、板藍根の水抽出物からグルコシノレート（R,S-ゴイトリン、プロゴイトリン、エピプロルビン、グルコシド）やヌクレオシド（ヒポキサンチン、アデノシン、ウリジン、グアノシン）、インジゴやインジルビンなどのインジゴアルカロイドが単離・同定されています。11,12 これまでの研究では、アデノシン、ウリジン、インジルビンが様々な動物モデル大腸炎において強力な抗大腸炎効果を示すことが十分に立証されています。13-17 しかし、大腸炎におけるBLGの有効性を評価するためのエビデンスに基づいた研究は行われていません。本研究では、BLGの保護効果を調査しました。 C57BL/6マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性慢性再発性大腸炎を研究し、BLGの経口投与がマウスにおけるDSS誘発性慢性再発性大腸炎を著しく軽減することを発見した。炎症とその調節メカニズムは、腸内細菌叢の調節と腸由来グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）産生の回復に関連している。
BLG顆粒（無糖、NMPA承認番号Z11020357、北京同仁堂科技発展有限公司、中国北京市、ロット番号：20110966）は薬局で購入した。DSS（分子量：36,000～50,000ダルトン）はMP Biologicals（米国サンタアナ）から購入した。スルファサラジン（SASP）（純度98%以上）、ヘマトキシリンおよびエオシンはSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。マウスTNF-α、IL-1βおよびIL-6ルミネックスELISAアッセイキットはR&D Systems（米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。酢酸、プロピオン酸、および酪酸はAladdin Industries（中国上海市）から購入した。2-エチル酪酸はMerck KGaAから購入した。 （ドイツ、ダルムシュタット）
生後6～8週齢の雄C57BL/6マウス（体重18～22g）を北京ウェタヘ実験動物技術有限公司（中国、北京）から購入し、22±2℃、12時間明暗サイクルの環境で飼育した。マウスには、新しい環境に順応させるため、1週間、標準的なげっ歯類用飼料と自由に飲める水を与えた。その後、マウスを無作為に4つのグループに分けた：対照群、DSSモデル群、SASP投与群（200mg/kg、経口）、BLG投与群（1g/kg、経口）。図1Aに示すように、我々の以前の研究に従って、実験的慢性再発性大腸炎は、1.8% DSSを5日間投与し、その後蒸留水を7日間投与するサイクルを3回繰り返すことでマウスに誘発した。18 SASP投与群とBLG投与群のマウスには、それぞれSASPとBLGを投与し、1日目から毎日投与した。 0.予備実験に基づき、BLGの投与量は1g/kgに設定した。一方、SASPの投与量は文献4に基づき200mg/kgに設定した。対照群とDSSモデル群は、実験を通して同じ量の水を摂取した。
図1 BLGはマウスのDSS誘発慢性再発性大腸炎を改善する。(A) 慢性再発性大腸炎の実験デザインと治療、(B) 体重変化、(C) 疾患活動性指数(DAI)スコア、(D) 結腸長、(E) 結腸の代表的な画像、(F) H&E染色結腸(倍率×100)、(G) 組織学的スコア。データは平均±SEM(n=6)として示されている。##p < 0.01または###p < 0.001は対照(Con)群との比較、*p < 0.05または**p < 0.01または***p < 0.001はDSS群との比較。
体重、便の硬さ、直腸出血は毎日記録した。疾患活動性指数（DAI）は、前述のように体重、便の硬さ、直腸出血のスコアを組み合わせて決定した。19 実験の最後に、すべてのマウスを安楽死させ、血液、糞便、結腸を採取して、さらなる実験に用いた。
結腸組織をホルマリン固定し、パラフィンに包埋した。5マイクロメートルの切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を施した後、盲検法を用いて既述の方法でスコアリングを行った。19
結腸組織からTrizol試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて総RNAを抽出し、続いて逆転写酵素（TaKaRa、滋賀県草津市）を用いてcDNAを抽出した。SYBR Green Master（Roche、Basel、スイス）を用いたリアルタイムPCRシステムで定量PCRを行った。標的遺伝子の転写産物はβ-アクチンで正規化し、2-ΔΔCT法を用いてデータを解析した。遺伝子プライマー配列は表1に示す。
マウス結腸上皮細胞の初代分離および培養は、既報²⁰に従って行った。簡単に説明すると、6～8週齢のマウスの結腸を頸椎脱臼により安楽死させた後、まず摘出し、縦方向に切開し、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS、カルシウムおよびマグネシウム不含）で処理し、0.5～1 mmの小片に切断した。続いて、組織を無添加DMEM培地中の0.4 mg/mLコラゲナーゼXI（Sigma、Poole、英国）で消化し、室温で300 xgで5分間遠心分離した。沈殿物を37℃のDMEM培地（10%ウシ胎児血清、100単位/mLペニシリン、および100 µg/mLストレプトマイシンを添加）に再懸濁し、ナイロンメッシュ（孔径約250 µm）を通した。結腸上皮細胞のアリコートをガラス底ディッシュに入れ、酢酸、プロピオン酸、酪酸、およびマウス糞便抽出物とともに、37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。
結腸組織をPBSで均質化し、結腸組織中のサイトカインIL-6、TNF-α、IL-1βのレベルをLuminex ELISAアッセイキット（R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を用いて検出した。同様に、初代マウス結腸上皮細胞の血清および培養培地中のGLP-1レベルを、製造元の指示に従ってELISAキット（Bioswamp、武漢、中国）を用いて測定した。
糞便からの全DNAは、DNA抽出キット（Tiangen、中国）を使用して抽出した。DNAの質と量は、それぞれ260 nm/280 nmと260 nm/230 nmの比率で測定した。続いて、抽出した各DNAをテンプレートとして使用し、特異的プライマー338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）と806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）を使用して、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を異なる領域で増幅した。PCR産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN、ドイツ）を使用して精製し、リアルタイムPCRで定量し、IlluminaMiseq PE300シーケンスプラットフォーム（Illumina Inc.、CA、米国）を使用してシーケンスした。バイオインフォマティクス解析については、以前に報告されたプロトコルに従ってデータ処理を行った。21,22 簡単に言うと、Cutadapt（V1.9.1）を使用して生のexpressファイルをフィルタリングする。OTU UPARSE（バージョン7.0.1001）を用いて類似度カットオフ97%でクラスタリングを行い、UCHIMEを用いてキメラ配列を除去した。コミュニティ構成解析および分類は、SILVAリボソームRNA遺伝子データベースに基づくRDP分類器（http://rdp.cme.msu.edu/）を用いて行った。
短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）のレベルは、Taoらによって以前に記述された方法に若干の変更を加えて測定した。23 簡単に説明すると、まず100 mgの糞便を0.4 mLの脱イオン水に懸濁し、続いて0.1 mLの50%硫酸と0.5 mLの2-エチル酪酸（内部標準）を加え、均質化して4℃で加熱した。 12,000 rpmで15分間遠心分離した。上清を0.5 mLのエーテルで抽出し、GCに注入して分析した。ガスクロマトグラフィー（GC）分析では、フレームイオン化検出器（FID）を備えたGC-2010 Plusガスクロマトグラフ（島津製作所）を使用してサンプルを分析した。分離は、ZKAT-624カラム、30 m × 0.53 mm × 0.3 μm（蘭州中科安泰分析技術有限公司、中国）を使用して行った。データはGC solutionソフトウェア（島津製作所）を使用して取得した。スプリット比は10:1、キャリアガスは窒素、流量は6 mL/minであった。注入量は1 μLであった。インジェクターおよび検出器の温度は300℃であった。オーブン温度は140℃で13.5分間保持した後、 250℃まで120℃/分の速度で昇温し、その温度を5分間保持した。
データは平均値±標準誤差（SEM）として示されています。データの有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてダンカンの多重比較検定によって評価されました。すべての計算にはGraphPad Prism 5.0ソフトウェア（GraphPad Software Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用し、p < 0.05を統計的に有意とみなしました。
UCは、重度の腹痛、下痢、出血を伴う慢性再発性大腸炎であることがよく知られています。そこで、マウスにDSS誘発性慢性再発性大腸炎モデルを確立し、BLGの抗大腸炎効果を評価しました（図1A）。対照群と比較して、DSSモデル群のマウスは体重が有意に減少し、DAIが高くなりましたが、これらの変化は24日間のBLG投与後に有意に改善しました（図1BおよびC）。大腸短縮はUCの重要な特徴です。図1DおよびEに示すように、DSSを投与したマウスの大腸長は有意に短縮しましたが、BLG投与により改善しました。続いて、大腸の炎症を評価するために組織病理学的解析を行いました。H&E染色画像と病理学的スコアは、DSS投与により大腸の構造が著しく破壊され、陰窩が破壊されたのに対し、BLG投与により陰窩の破壊と病理学的スコアが有意に減少したことを示しました（図1FおよびG）。特に、BLGの保護効果は1 g/Kg の用量での BLG の効果は、200 mg/Kg の用量での SASP の効果と同等であった。これらの結果を総合すると、BLG はマウスの DSS 誘発慢性再発性大腸炎の重症度を軽減するのに効果的であることが示唆される。
TNF-α、IL-1β、IL-6は、大腸炎の重要な炎症マーカーです。図2Aに示すように、DSSは対照群と比較して、大腸におけるTNF-α、IL-1β、IL-6の遺伝子発現を著しく増加させました。BLGの投与は、これらのDSSによる変化を著しく逆転させることができます。次に、ELISAを使用して、大腸組織中の炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6のレベルを測定しました。結果は、DSSで処理したマウスでは大腸のTNF-α、IL-1β、IL-6のレベルが著しく増加したのに対し、BLG処理はこれらの増加を軽減したことも示しました（図2B）。
図2 BLGはDSS処理マウスの結腸における炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6の遺伝子発現と産生を阻害する。(A) 結腸におけるTNF-α、IL-1β、IL-6の遺伝子発現。(B) 結腸におけるTNF-α、IL-1β、IL-6のタンパク質レベル。データは平均値±標準誤差(n=4～6)として示されている。#p<0.05または##p<0.01または###p<0.001は対照群(Con)との比較。*p<0.05または**p<0.01はDSS群との比較。
腸内細菌叢の異常は、UC の病態形成において重要である。24 BLG が DSS 処理マウスの腸内細菌叢を調節するかどうかを調べるために、16S rRNA シーケンス解析を行い、腸内容物の細菌群集を分析した。ベン図は、3 つのグループが 385 個の OTU を共有していることを示している。同時に、各グループには固有の OTU があった (図 3A)。さらに、図 3B および C に示す Chao1 指数と Shannon 指数は、BLG 処理群で Shannon 指数が有意に低下したため、BLG 処理マウスでは腸内細菌叢の群集多様性が低下していることを示している。主成分分析 (PCA) および主座標分析 (PCoA) を使用して、3 つのグループ間のクラスタリングパターンを決定し、DSS 処理マウスの群集構造が BLG 処理後に明確に分離されていることを示した (図 3D および E)。これらのデータは、BLG 処理が DSS 誘発性大腸炎マウスの群集構造に有意な影響を与えたことを示唆している。
図3 BLGはDSS誘発性大腸炎マウスの腸内細菌叢の多様性を変化させる。(A) OTUのベン図、(B) Chao1指数、(C) シャノンの豊富度指数、(D) OTUの主成分分析(PCA)スコアプロット、(E) OTU主座標分析(PCoA)スコア図。データは平均値±SEM(n=6)として示されている。**p<0.01 vs DSS群。
糞便微生物叢の特定の変化を評価するために、腸内微生物叢の組成をすべての分類レベルで分析しました。図4Aに示すように、すべてのグループで主要な門はFirmicutesとBacteroidetesであり、続いてVerrucomicrobiaでした。Firmicutesの相対存在量とFirmicutes/Bacteroidetes比は、対照マウスと比較してDSS処理マウスの糞便微生物群集で有意に増加し、これらの変化はBLG処理後に有意に逆転しました。特に、BLG処理はDSS誘発性大腸炎マウスの糞便中のVerrucobacteriumの相対存在量を有意に増加させました。家庭レベルでは、糞便微生物群集はLachnospiriaceae、Muribaculaceae、Akkermansiaceae、Ruminococcaceae、Prevotellaceaeによって占められていました（図4B）。DSSグループと比較して、BLGの枯渇はAkkermansiaceaeの存在量を増加させましたが、 Lachnospiraceae および Ruminococcaceae。特に、属レベルでは、糞便微生物叢は Lachnospira_NK4A136_group、Akkermansia、および Prevotellaceae_UCG-001 によって占められていました (図 4C)。この発見はまた、BLG 治療が DSS チャレンジに対する微生物叢の不均衡を効果的に逆転させ、Eubacterium_xylanophilum_group、Ruminococcaceae_UCG-014、Intestinimonas、および Oscillibacter の減少と Akkermansia および Prevotellaceae_UCG-001 の増加を特徴としていることを示しました。
図4 BLGはDSS誘発性大腸炎マウスの腸内細菌叢の量を変化させる。(A) 門レベルでの腸内細菌叢の量。(B) 科レベルでの腸内細菌叢の量。(C) 属レベルでの腸内細菌叢の量。データは平均±SEM（n=6）として示されている。#p < 0.05または###p < 0.001は対照群（Con）との比較。*p < 0.05または**p < 0.01または***p < 0.001はDSS群との比較。
短鎖脂肪酸（SCFA）はAkkermansiaとPrevotellaceae_UCG-001の主要代謝物であり、酢酸、プロピオン酸、酪酸は腸管腔内で最も豊富なSCFAであることを考慮すると、25-27 我々の研究はまだ続いている。図5に示すように、DSS処理群では糞便中の酢酸、プロピオン酸、酪酸濃度が有意に減少したが、BLG処理はこの減少を大幅に抑制することができた。
図5. BLGはDSS誘発性大腸炎マウスの糞便中のSCFAレベルを増加させる。(A) 糞便中の酢酸含有量、(B) 糞便中のプロピオン酸含有量、(C) 糞便中の酪酸含有量。データは平均値±標準誤差(n=6)で示されている。#p<0.05または##p<0.01は対照群(Con)との比較、*p<0.05または**p<0.01はDSS群との比較。
さらに、属レベルの差分SCFAと糞便微生物叢との間のピアソン相関係数を計算しました。図6に示すように、Akkermansiaはプロピオン酸（ピアソン=0.4866）と酪酸（ピアソン=0.6192）の産生と正の相関がありました。対照的に、EnteromonasとOscillobacterは両方とも酢酸産生と負の相関があり、ピアソン係数はそれぞれ0.4709と0.5104でした。同様に、Ruminococcaceae_UCG-014はプロピオン酸（ピアソン=0.4508）と酪酸（ピアソン=0.5842）の産生と負の相関がありました。
図6 異なるSCFAと結腸微生物間のピアソン相関分析。(A) エンテロモナスと酢酸; (B) コンカッションバチルスと酢酸; (C) アッケルマンシアとプロピオン酸; (D) ルミノコッカス_UCG-014とプロピオン酸; (E) アッケルマンシアと酪酸; (F) ルミノコッカス_UCG-014と酪酸。
グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）は、抗炎症作用を持つプログルカゴン（Gcg）の細胞型特異的な翻訳後産物である。28 図7に示すように、DSSはGcg mRNA発現の有意な減少を誘導した。結腸およびBLG治療は、対照群と比較してDSS誘導性Gcg減少を有意に回復させることができた（図7A）。同時に、DSS投与群では血清中のGLP-1レベルが有意に低下したが、BLG治療はこの低下を大幅に抑制することができた（図7B）。短鎖脂肪酸はGタンパク質共役受容体43（GRP43）およびGタンパク質共役受容体41（GRP41）の活性化を介してGLP-1分泌を刺激できるため、大腸炎マウスの結腸におけるGPR41およびGRP43も調べたところ、DSS投与後に結腸におけるGRP43およびGPR41のmRNA発現が有意に低下し、BLG治療によって効果的に回復することができた。これらの減少（図7CおよびD）。
図7 BLGはDSS投与マウスの血清GLP-1レベルと結腸Gcg、GPR41、GRP43 mRNA発現を増加させる。(A)結腸組織におけるGcg mRNA発現; (B)血清中のGLP-1レベル; (C)結腸組織におけるGPR41 mRNA発現; (D)結腸組織におけるGPR43 mRNA発現。データは平均値±SEM（n = 5～6）として示されている。#p < 0.05または##p < 0.01は対照群（Con）との比較、*p < 0.05はDSS群との比較。
BLG治療によりDSS処理マウスの血清GLP-1レベル、結腸Gcg mRNA発現、および糞便SCFAレベルが上昇する可能性があるため、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ならびにコントロール（F-Con）、DSS大腸炎（F-Con-DSS）、およびBLG処理大腸炎（F-BLG）マウスからの初代マウス結腸上皮細胞からのGLP-1放出についてさらに検討した。図8Aに示すように、2 mM酢酸、プロピオン酸、および酪酸でそれぞれ処理した初代マウス結腸上皮細胞は、以前の研究と一致して、GLP-1放出を有意に刺激した。29,30 同様に、F-Con、F-DSS、およびF-BLG（糞便0.25 gに相当）はすべて、初代マウス結腸上皮細胞からのGLP-1放出を大きく刺激した。注目すべきは、F-DSS処理した初代マウス結腸上皮細胞から放出されたGLP-1の量が、細胞におけるその値は、F-ConおよびF-BLGで処理した初代マウス結腸上皮細胞における値よりもはるかに低かった（図8B）。これらのデータは、BLG処理が腸管SCFA由来GLP-1産生を著しく回復させたことを示唆している。
図8 BLG由来SCFAは初代マウス結腸上皮細胞からのGLP-1放出を刺激する。(A)酢酸、プロピオン酸、酪酸は初代マウス結腸上皮細胞からのGLP-1放出を刺激した。(B)糞便抽出物F-Con、F-DSS、F-BLGは初代マウス結腸上皮細胞からのGLP-1放出を刺激した。放出されたGLP-1の量。結腸上皮細胞のアリコートをガラス底ペトリ皿に入れ、それぞれ2 mM酢酸、プロピオン酸、酪酸、および糞便抽出物F-Con、F-DSS、F-BLG（0.25 gの糞便に相当）で処理した。それぞれ37℃、5% CO2で2時間培養した。初代マウス結腸上皮細胞から放出されたGLP-1の量をELISAで検出した。データは平均値±SEM（n=3）として示されている。#p < 0.05または##p < 0.01 vs. blankまたはF-Con; *p < 0.05 vs. F-DSS。
略語: Ace、酢酸; Pro、プロピオン酸; however、酪酸; F-Con、対照マウスの糞便抽出物; F-DSS、大腸炎マウスの糞便抽出物; F-BLG、BLG処理した結腸由来の炎症マウスの糞便抽出物。
世界保健機関によって難治性疾患に分類されている潰瘍性大腸炎は、世界的な脅威となりつつある。しかしながら、この疾患の予測、予防、治療に有効な方法は依然として限られています。したがって、UCに対する安全で効果的な新しい治療戦略を探索し開発することが緊急に必要とされています。多くの伝統的な漢方薬製剤は、何世紀にもわたって中国人のUC治療に有効であることが示されており、すべて生物学的有機物および天然物質であり、ほとんどが人間や動物に無害であるため、有望な選択肢です。31,32 本研究は、UC治療のための安全で効果的な伝統的な漢方薬製剤を探し、その作用機序を解明することを目的としています。BLGは、インフルエンザの治療に使用されるよく知られた漢方処方です。8,33 当研究室および他の研究室での研究により、BLGと同じ原料から作られた加工された伝統的な漢方薬製品であるインディゴが、人間および動物のUC治療に有意な有効性を示すことが示されています。4,34 しかし、BLGの抗大腸炎効果とその作用機序は不明です。本研究では、BLGがDSS誘発性大腸炎を効果的に軽減し、腸内細菌叢の調節および腸由来GLP-1産生の回復に関連している。
UCは、体重減少、下痢、直腸出血、広範囲の結腸粘膜損傷などの典型的な臨床症状を伴う再発期を特徴とすることがよく知られています。35 そこで、1.8% DSSを5日間投与し、その後7日間飲水するというサイクルを3回繰り返すことで、慢性再発性大腸炎を誘発しました。図1Bに示すように、体重減少とDAIスコアの変動は、慢性再発性大腸炎の誘発が成功したことを示しています。BLG投与群のマウスは8日目から回復が見られ、24日目とは有意に異なっていました。DAIスコアにも同様の変化が見られ、大腸炎の臨床症状の改善が示唆されました。結腸損傷と炎症状態に関しては、結腸の長さ、結腸組織の損傷、および結腸組織における炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6の遺伝子発現と産生もBLG投与後に大幅に改善しました。これらの結果を総合すると、BLGは慢性大腸炎の治療に有効であることが明確に示されています。マウスにおける再発性大腸炎。
BLGはどのようにして薬理作用を発揮するのでしょうか？これまでの多くの研究で、腸内細菌叢がUCの病態形成に重要な役割を果たしていることが示されており、マイクロバイオームベースおよびマイクロバイオーム標的療法はUCの治療において非常に魅力的な戦略として浮上しています。本研究では、BLG治療により腸内細菌叢の構成に有意な変化が生じ、DSS誘発性大腸炎に対するBLGの保護効果が腸内細菌叢の調節に関連していることが示されました。この観察結果は、腸内細菌叢の恒常性を再プログラムすることが、漢方薬製剤の有効性を理解するための重要なアプローチであるという考えと一致しています。36,37 特に、Akkermansiaはグラム陰性で偏性嫌気性の細菌であり、腸の粘液層に生息し、ムチンを分解し、プロピオン酸を産生し、杯細胞の分化を刺激し、粘膜を維持します。バリア機能の完全性。26 複数の臨床および動物データは、Akkermansia が健康な粘膜と強く関連していることを示唆しており、38 Akkermansia spp の経口投与は粘膜炎症を大幅に改善できる。39 我々の現在のデータは、BLG治療後にAkkermansiaの相対存在量が有意に増加することを示唆している。さらに、Prevotellaceae_UCG-001はSCFA産生菌である。27 複数の研究で、Prevotellaceae_UCG-001は結腸炎動物の糞便中に低相対存在量で検出されたことが示されている。40,41 我々の現在のデータも、BLG治療がDSS投与マウスの結腸におけるPrevotellaceae_UCG-001の相対存在量を大幅に増加させることを示している。一方、Oscillibacterは中温性で偏性嫌気性の細菌である。42 Oscillibacterの相対存在量はUCマウスで有意に増加し、IL-6およびIL-1βレベルと病理学的スコアと有意に正の相関があることが報告されている。43,44 特に、BLG治療はDSS投与マウスの糞便中のOscillibacterの相対存在量を大幅に減少させた。マウス。特に、これらのBLGで変化した細菌は、最もSCFAを産生する細菌であった。これまでの多くの研究で、SCFAが結腸の炎症や腸管上皮の完全性の保護に有益な効果をもたらす可能性が示されている。45,46 また、今回のデータでは、DSS処理した糞便中のSCFAである酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度がBLG処理したマウスで大幅に増加していることも観察された。これらの知見を総合すると、BLG処理は慢性再発性大腸炎のマウスにおいてDSS誘発性SCFA産生細菌を効果的に増強できることが明確に示されている。
GLP-1は主に回腸と結腸で産生されるインクレチンであり、胃内容排出の遅延と食後血糖値の低下に重要な役割を果たします。47 証拠は、GLP-1受容体アゴニストであるジペプチジルペプチダーゼ（DPP）-4とGLP-1ナノ医薬品がマウスの腸炎症を効果的に軽減できることを示唆しています。48-51 以前の研究で報告されているように、高濃度のSCFAはヒトとマウスの血漿GLP-1レベルと関連していました。52 現在のデータでは、BLG処理後、血清GLP-1レベルとGcg mRNA発現が有意に増加したことが示されています。同様に、DSS処理した大腸炎マウスの糞便抽出物で刺激した場合と比較して、BLG処理した大腸炎マウスの糞便抽出物で刺激した場合、大腸培養におけるGLP-1分泌が有意に増加しました。SCFAはGLP-1の放出にどのように影響するのでしょうか。Gwen TolhurstらSCFAはGRP43とGPR41を介してGLP-1分泌を刺激することが報告されている。29 我々の現在のデータも、BLG処理がDSS処理マウスの結腸におけるGRP43とGPR41のmRNA発現を著しく増加させることを示している。これらのデータは、BLG処理がGRP43とGPR41を活性化することによってSCFA促進GLP-1産生を回復できることを示唆している。
BLGは中国において長期服用可能な市販薬（OTC医薬品）である。昆明マウスにおけるBLGの最大耐用量は80g/kgであり、急性毒性は観察されていない。53 現在、ヒトにおけるBLG（糖分なし）の推奨用量は9～15g/日（1日3回）である。本研究では、1g/kgのBLGがマウスのDSS誘発慢性再発性大腸炎を改善することが示された。この用量は臨床で使用されているBLG用量に近い。また、本研究では、その作用機序は、少なくとも部分的には、腸内細菌叢、特にAkkermansiaやPrevotellaceae_UCG-001などのSCFA産生細菌の変化を介して、腸由来のGLP-1産生を回復させることによって媒介されることも明らかになった。これらの知見は、BLGが臨床大腸炎治療の潜在的な治療薬としてさらに検討する価値があることを示唆している。しかし、腸内細菌叢を調節する正確なメカニズムは、腸内細菌叢欠損マウスや糞便細菌を用いて確認する必要がある。移植。
Ace、酢酸；but、酪酸；BLG、パンダン；DSS、デキストラン硫酸ナトリウム；DAI、疾患活動性指数；DPP、ジペプチジルペプチダーゼ；FID、フレームイオン化検出器；F-Con、マウスのコントロール糞便抽出物；F-DSS、DSS大腸炎マウスの糞便抽出物；F-BLG、BLG処理大腸炎マウスの糞便抽出物；GLP-1、グルカゴン様ペプチド-1；Gcg、グルカゴン；ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー；GRP43、Gタンパク質共役受容体43；GRP41、Gタンパク質共役受容体41；H&E、ヘマトキシリン・エオシン；HBSS、ハンクス平衡塩類溶液；OTC、OTC；PCA、主成分分析；PCoA、主座標分析；Pro、プロピオン酸；SASP、スルファサラジン；SCFA、短鎖脂肪酸；中国医学、伝統中国医学； UCとは、潰瘍性大腸炎のことです。
すべての実験プロトコルは、北京大学深圳・香港科技大学医学センター（中国深圳）の動物倫理委員会により、機関ガイドラインおよび動物規制に従って承認されました（倫理番号A2020157）。
すべての著者は、構想と設計、データ収集、またはデータ分析と解釈に大きく貢献し、論文の草稿作成または重要な知的コンテンツの批判的改訂に参加し、現在のジャーナルに原稿を投稿することに同意し、最終的に出版版を承認し、作業のすべての側面について責任を負います。
この研究は、中国国家自然科学基金（81560676および81660479）、深圳大学一流プロジェクト（86000000210）、深圳市科学技術イノベーション委員会基金（JCYJ20210324093810026）、広東省医学科学技術研究基金（A2020157およびA2020272）、貴州医科大学薬学部貴州省重点実験室（YWZJ2020-01）、北京大学深圳病院（JCYJ2018009）の支援を受けて実施されました。
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