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バンランゲン顆粒は、腸内細菌叢を調節し、腸管SCFA由来GLP-1産生を回復させることにより、マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム誘発性慢性再発性大腸炎を軽減する。
Jiao Peng、1-3、*Li Xi、4、*Zheng Lin、3、5 Duan Lifang、1 Gao Zhengxian、2、5 Diehu、1 Li Jie、6 Li Xiaofeng、6 Shen Xiangchun、5 Xiao Haitao21 北京大学深圳病院薬科、深圳、中華人民共和国; 2 深圳大学健康科学センター薬学院、深圳、中華人民共和国; 3 貴州医科大学工学技術研究センター民族医学と中医学開発応用、教育部、貴州省薬学重点実験室、貴州医科大学、貴陽、中華人民共和国; 4 北京大学深圳病院消化器科、深圳、中華人民共和国; 5 貴州医科大学薬学部、薬用植物機能応用国家重点実験室、貴陽市6 北京大学深圳病院臨床検査医学科、深圳、中国 [email protected] 沈翔春、貴州医科大学薬学部、貴州省、中華人民共和国、550004、メールアドレス [email protected] 目的：GLP-1ベースの療法は、炎症性腸疾患の新しい治療オプションです。バンランゲン（BLG）顆粒は、様々な炎症性疾患の治療において潜在的な抗炎症活性を示すことが知られている抗ウイルス性TCM製剤です。しかし、大腸炎に対するその抗炎症効果とその作用機序はまだ不明です。方法：マウスでデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性慢性再発性大腸炎を確立する。疾患活動性指標、組織学的損傷マーカー、炎症性サイトカインレベルを測定し、BLGの保護効果を評価しました。BLGの腸内細菌叢と腸への影響は、血清GLP-1レベルと結腸Gcg、GPR41、および GRP43 の発現、腸内細菌叢の構成、糞便中の SCFA レベル、およびマウスの初代結腸上皮細胞からの GLP-1 放出、SCFA 由来の GLP-1 産生。結果: BLG 治療により、体重減少、DAI、結腸短縮、結腸組織損傷、結腸組織中の TNF-α、IL-1β、および IL-6 の炎症性サイトカイン レベルが大幅に減少しました。さらに、BLG 治療により、大腸炎マウスの結腸の Gcg、GPR41、GRP43 の発現と血清 GLP-1 レベルが大幅に回復し、Akkermansia や Prevotellaceae_UCG-001 などの SCFA 産生細菌が増加し、Eubacterium_xylanophilum_group、Ruminococcaceae_UCG-014、Intestinimonas、および Oscillibacter などの細菌の存在量が減少しました。さらに、BLG投与は大腸炎マウスの糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）レベルを有意に上昇させる可能性があります。同時に、in vitro実験では、BLG投与マウスの糞便抽出物が、マウスの一次小結腸上皮細胞からのGLP-1分泌を著しく刺激することが示されました。結論：これらの知見は、BLGが抗大腸炎作用を有することを示唆しています。BLGは、少なくとも部分的には腸内細菌叢の調節と腸内SCFA由来GLP-1産生の回復によって、治療薬として開発される可能性があります。慢性再発性大腸炎に対する有望な薬剤です。キーワード：大腸炎、バンランゲン顆粒、腸内細菌叢、短鎖脂肪酸、GLP-1
潰瘍性大腸炎（UC）は、繰り返す下痢、腹痛、体重減少、粘液膿性血便を特徴とする結腸直腸の長期炎症性疾患です。1 近年、西洋型ライフスタイルの普及に伴い、以前はUCの罹患率が低かった中国などの国々でもUCの罹患率が増加しています。2 この増加は公衆衛生上の大きな問題を引き起こし、患者の就労能力や生活の質に深刻な影響を与えています。特に、UCの病因は依然としてほとんど解明されていませんが、遺伝、環境因子、腸内細菌叢、免疫系がすべてUCの発症に寄与していることは一般的に認められています。3 現在でもUCを完治させる治療法はなく、治療の目標は臨床症状のコントロール、寛解の誘導と維持、粘膜治癒の促進、再発の減少です。古典的な治療法には、アミノサリチル酸塩、コルチコステロイド、免疫抑制剤、生物学的製剤などがあります。しかし、これらの薬剤ではUCの病因を完全に克服することはできません。近年、多くの症例研究で、伝統的な中国医学（TCM）が低毒性でUCの緩和に大きな可能性を示しており、新しいTCM療法の開発がUCの有望な治療戦略であることを示唆しています。5-7​​​​
バンランゲン顆粒（BLG）は、バンランゲンの根の水抽出物から作られた伝統的な漢方薬です。8 抗ウイルス効果に加えて、BLGはさまざまな炎症性疾患の治療において潜在的な抗炎症活性を示します。9,10 さらに、Radix isatidisの水抽出物からグルコシノレート（R、S-ゴイトリン、プロゴイトリン、エピプロルビン、グルコシド）とヌクレオシド（ヒポキサンチン、アデノシン、ウリジン、グアノシン）およびインジゴアルカロイド（インジゴやインジルビンなど）が単離・同定されています。11,12 これまでの研究では、アデノシン、ウリジン、インジルビンという化合物が、さまざまな大腸炎の動物モデルにおいて強力な抗大腸炎効果を示すことが十分に文書化されています。13-17 しかし、大腸炎におけるBLGの有効性を評価するためのエビデンスに基づく研究は行われていません。本研究では、BLGの大腸炎に対する保護効果を調査しました。 C57BL/6マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性慢性再発性大腸炎を研究し、BLGの経口投与によりマウスにおけるDSS誘発性慢性再発性大腸炎が著しく軽減されることを発見しました。炎症の調節メカニズムは、腸内細菌叢の調整および腸由来グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）産生の回復に関連しています。
BLG顆粒（無糖、NMPA承認Z11020357、北京同仁堂科技開発有限公司、中国北京市、バッチ番号：20110966）は薬局から購入しました。DSS（分子量：36,000～50,000ダルトン）はMP Biologicals（米国サンタアナ）から購入しました。スルファサラジン（SASP）（純度98％以上）、ヘマトキシリン、エオシンはSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から購入しました。マウスTNF-α、IL-1β、IL-6ルミネックスエリサアッセイキットはR&D systems（米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入しました。酢酸、プロピオン酸、酪酸はAladdin Industries（中国上海）から購入しました。2-エチル酪酸はMerck KGaAから購入しました。 （ドイツ、ダルムシュタット）。
6～8週齢の雄C57BL/6マウス（体重18～22g）を北京ウェタヘ実験動物科技有限公司（北京、中国）から購入し、22±2℃、12時間の明暗サイクルの環境で飼育した。マウスは新しい環境に順応するために、1週間、標準的なげっ歯類用飼料を与え、飲料水を自由に摂取させた。その後、マウスは無作為に4つのグループに分けられた：対照群、DSSモデル群、SASP投与群（200mg/kg、経口）、およびBLG投与群（1g/kg、経口）。図1Aに示すように、以前の研究に従って、マウスに実験的慢性再発性大腸炎を、以前の研究に従って、1.8％DSSを5日間投与し、その後蒸留水を7日間投与する3サイクルで誘発した。18 SASPおよびBLG投与群のマウスは、それぞれSASPおよびBLGで毎日治療された。 0日目から。予備実験によれば、BLGの投与量は1g/kgに設定された。一方、SASPの投与量は文献に従って200mg/Kgに設定された。4 対照群とDSSモデル群には、実験全体を通して同量の水が与えられた。
図 1 BLG はマウスの DSS 誘発性慢性再発性大腸炎を軽減します。(A) 慢性再発性大腸炎と治療の実験設計、(B) 体重変化、(C) 疾患活動性指数 (DAI) スコア、(D) 結腸の長さ、(E) 結腸の代表画像、(F) 結腸の H&E 染色 (倍率、×100)、および (G) 組織学的スコア。データは平均 ± SEM (n = 6) として示されています。##p < 0.01 または ###p < 0.001 vs コントロール (Con) グループ、*p < 0.05 または **p < 0.01 または ***p < 0.001 vs DSS グループ。
体重、便の硬さ、直腸出血は毎日記録されました。疾患活動指数 (DAI) は、前述のとおり、体重、便の硬さ、直腸出血のスコアを組み合わせて決定されました。19 実験終了時に、すべてのマウスを安楽死させ、さらなる実験のために血液、糞便、結腸を採取しました。
結腸組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。5ミクロンの切片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）で染色し、前述のように盲検化してスコア付けした。19
結腸組織の全RNAはTrizol試薬（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）で抽出し、続いて逆転写酵素（TaKaRa、滋賀県草津市、日本）でcDNAを抽出した。定量PCRは、SYBR Green Master（Roche、スイス、バーゼル）を使用したリアルタイムPCRシステムを使用して実施した。標的遺伝子転写産物はβ-アクチンに正規化し、データは2-ΔΔCT法を使用して分析した。遺伝子プライマー配列を表1に示す。
マウス結腸上皮細胞の初代分離および培養は、以前に記載された方法に従って行われた。20 簡単に説明すると、6～8週齢のマウスの結腸を頸椎脱臼により屠殺した後、まず切除し、縦に開いてハンクス平衡塩類溶液（HBSS、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）で処理し、0.5～1 mmの小片に切断した。続いて、組織を遊離DMEM培地中の0.4 mg/mLコラーゲナーゼXI（Sigma、英国プール）で消化し、室温で5分間300 xgで遠心分離した。ペレットを37℃でDMEM培地（10%ウシ胎児血清、100単位/mLペニシリン、および100 µg/mLストレプトマイシンを補充）に再懸濁し、ナイロンメッシュ（孔径約250 µm）を通過させた。結腸上皮細胞のアリコートをガラス底皿に入れた。酢酸、プロピオン酸、酪酸、マウス糞便抽出物とともに37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。
結腸組織を PBS でホモジェナイズし、ルミネックス ELISA アッセイ キット (R&D systems、米国ミネソタ州ミネアポリス) を使用して結腸組織中のサイトカイン IL-6、TNF-α、IL-1β のレベルを検出しました。同様に、初代マウス結腸上皮細胞の血清および培養液中の GLP-1 レベルを、ELISA キット (Bioswamp、中国武漢) を使用して製造元の指示に従って測定しました。
糞便からの全DNAは、DNA抽出キット（天源、中国）を使用して抽出した。DNAの質と量は、それぞれ260 nm / 280 nmと260 nm / 230 nmの比率で測定した。次に、抽出した各DNAをテンプレートとして使用し、特定のプライマー338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）と806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）を使用して、異なる領域の16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅した。PCR産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN、ドイツ）を使用して精製し、リアルタイムPCRで定量し、IlluminaMiseq PE300シーケンシングプラットフォーム（Illumina Inc.、カリフォルニア州、米国）を使用してシーケンスした。バイオインフォマティクス解析では、以前に報告されたプロトコル21,22に従ってデータ処理を行った。つまり、生のエクスプレスをフィルタリングするには、Cutadapt（V1.9.1）を使用する。ファイル。OTU は、類似度カットオフ 97% の UPARSE (バージョン 7.0.1001) を使用してクラスタ化され、キメラ配列を除去するために UCHIME が使用されました。コミュニティ構成の分析と分類は、SILVA リボソーム RNA 遺伝子データベースに基づく RDP 分類器 (http://rdp.cme.msu.edu/) を使用して実行されました。
短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）のレベルは、Tao らが以前に報告した方法に若干の変更を加えて測定した。23 簡単に説明すると、まず 100 mg の糞便を 0.4 mL の脱イオン水に懸濁し、次に 0.1 mL の 50% 硫酸と 0.5 mL の 2-エチル酪酸（内部標準）を加えて均質化し、4°C で加熱した。 12,000 rpmで15分間、Cで遠心分離した。上澄み液を0.5 mLのエーテルで抽出し、GCに注入して分析した。ガスクロマトグラフィー（GC）分析では、サンプルは、炎イオン化検出器（FID）を備えたGC-2010 Plusガスクロマトグラフ（島津製作所）を使用して分析した。分離は、ZKAT-624カラム、30 m × 0.53 mm × 0.3 μm（蘭州中科安泰分析技術有限公司、中国）を使用して達成された。データは、GCソリューションソフトウェア（島津製作所）を使用して取得した。スプリット比は10：1、キャリアガスは窒素、流量は6 mL/分であった。注入量は1 μLであった。インジェクターと検出器の温度は300°Cであった。オーブン温度は140°Cで13.5分間保持され、その後120°C/分の速度で250°Cまで昇温し、その温度を5分間保持した。
データは平均値±平均値の標準誤差（SEM）として提示されます。データの有意性は、一元配置分散分析とそれに続くダンカンの多重範囲検定によって評価されました。すべての計算にはGraphPad Prism 5.0ソフトウェア（GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）が使用され、p < 0.05が統計的に有意であると判断されました。
UCは、激しい腹痛、下痢、出血を伴う慢性再発性大腸炎であることはよく知られています。そこで、BLGの抗大腸炎効果を評価するために、マウスでDSS誘発慢性再発性大腸炎を確立しました（図1A）。対照群と比較して、DSSモデル群のマウスは体重が有意に減少し、DAIが高く、これらの変化はBLG治療24日後に有意に回復しました（図1BおよびC）。結腸の短縮はUCの重要な特徴です。図1DおよびEに示すように、DSSを投与されたマウスの結腸の長さは有意に短縮しましたが、BLG治療によって軽減されました。その後、結腸の炎症を評価するために組織病理学的分析を実施しました。H＆E染色画像と病理学的スコアは、DSS投与が結腸構造を有意に破壊し、陰窩破壊をもたらしたのに対し、BLG治療は陰窩破壊と病理学的スコアを有意に減少させたことを示しました（図1FおよびG）。特に、保護効果1 g/kgの用量でのBLGの抗炎症効果は、200 mg/kgの用量でのSASPの抗炎症効果に匹敵しました。総合的に、これらの結果は、BLGがマウスのDSS誘発性慢性再発性大腸炎の重症度を軽減するのに効果的であることを示唆しています。
TNF-α、IL-1β、IL-6は、結腸の炎症の重要な炎症マーカーです。図2Aに示すように、DSSは、コントロールグループと比較して、結腸でのTNF-α、IL-1β、IL-6の遺伝子発現の大幅な増加を引き起こしました。BLGの投与は、これらのDSS媒介性の変化を大幅に逆転させることができます。次に、ELISAを使用して、結腸組織の炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6のレベルを測定しました。結果はまた、DSSで治療したマウスでは結腸のTNF-α、IL-1β、IL-6のレベルが大幅に増加したのに対し、BLG治療ではこれらの増加が緩和されたことを示しました（図2B）。
図 2 BLG は、DSS 処理マウスの結腸における炎症誘発性サイトカイン TNF-α、IL-1β、IL-6 の遺伝子発現および産生を阻害します。(A) 結腸における TNF-α、IL-1β、IL-6 の遺伝子発現。(B) 結腸における TNF-α、IL-1β、IL-6 のタンパク質レベル。データは平均 ± SEM (n = 4–6) として示されています。#p < 0.05 または ##p < 0.01 または ###p < 0.001 vs コントロール (Con) グループ。*p < 0.05 または **p < 0.01 vs DSS グループ。
腸内細菌叢の異常はUCの病因において極めて重要である。24 BLGがDSS投与マウスの腸内細菌叢を調整するかどうかを調べるために、16S rRNAシークエンシングを行って腸内容物の細菌群集を解析した。ベン図は、3つのグループが385のOTUを共有していることを示しています。同時に、各グループは独自のOTUを持っていました（図3A）。さらに、図3BとCに示されているChao1指数とShannon指数は、BLG投与マウスの腸内細菌叢の群集多様性が減少したことを示しており、BLG投与グループではShannon指数が有意に減少しました。主成分分析（PCA）と主座標分析（PCoA）を使用して、3つのグループ間のクラスタリングパターンを決定し、DSS投与マウスの群集構造がBLG投与後に明確に分離されることを示しました（図3DとE）。これらのデータは、BLG投与がDSS誘発性大腸炎。
図3 BLGはDSS誘発性大腸炎マウスの腸内細菌叢の多様性を変化させる。(A) OTUのベン図、(B) Chao1指数、(C) シャノンの豊富さ指数、(D) OTUの主成分分析（PCA）スコアプロット、(E) OTU主座標分析（PCoA）スコア図。データは平均±SEM（n = 6）として提示されている。**DSS群と比較してp < 0.01。
糞便微生物叢の特定の変化を評価するために、すべての分類レベルで腸内微生物叢の構成を分析しました。図4Aに示すように、すべてのグループで主な門はFirmicutes門とBacteroidetes門であり、次にVerrucomicrobia門でした。DSS処理マウスの糞便微生物群集では、対照マウスと比較してFirmicutes門の相対的存在量とFirmicutes門/Bacteroidetes門比が有意に増加し、これらの変化はBLG処理後に有意に回復しました。特に、BLG処理はDSS誘発性大腸炎のマウスの糞便中のVerrucobacteriumの相対的存在量を有意に増加させました。家庭レベルでは、糞便微生物群集はLachnospiriaceae、Muribaculaceae、Akkermansiaceae、Ruminococcaceae、およびPrevotellaceaeで占められていました（図4B）。DSSグループと比較して、BLGの枯渇によりAkkermansiaceaeの存在量が増加しましたが、 : Lachnospiraceae と Ruminococcaceae が豊富に存在しました。特に、属レベルでは、糞便微生物叢は Lachnospira_NK4A136_group、Akkermansia、および Prevotellaceae_UCG-001 によって占められていました (図 4C)。この発見は、BLG 処理が DSS チャレンジに対する微生物叢の不均衡を効果的に逆転させ、Eubacterium_xylanophilum_group、Ruminococcaceae_UCG-014、Intestinimonas、および Oscillibacter の減少と、Akkermansia および Prevotellaceae_UCG-001 の増加を特徴としていることも示しました。
図4 BLGはDSS誘発性大腸炎マウスの腸内細菌叢の豊富さを変化させます。(A) 門レベルでの腸内細菌叢の豊富さ、(B) 科レベルでの腸内細菌叢の豊富さ、(C) 属レベルでの腸内細菌叢の豊富さ。データは平均±SEM（n = 6）として提示されています。#p < 0.05または###p < 0.001 vs コントロール（Con）グループ、*p < 0.05または**p < 0.01または***p < 0.001 vs DSSグループ。
短鎖脂肪酸（SCFA）はAkkermansiaとPrevotellaceae_UCG-001の主な代謝物である一方、酢酸、プロピオン酸、酪酸は腸腔内で最も豊富なSCFAであると考えると、25-27、私たちはまだ研究中です。図5に示すように、糞便中の酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度はDSS処理群で大幅に減少しましたが、BLG処理ではこの減少を大幅に抑制することができました。
図 5. BLG は、DSS 誘発性大腸炎を患ったマウスの糞便中の SCFA レベルを増加させます。(A) 糞便中の酢酸含有量、(B) 糞便中のプロピオン酸含有量、(C) 糞便中の酪酸含有量。データは平均 ± SEM (n = 6) として示されています。#p < 0.05 または ##p < 0.01 vs コントロール (Con) グループ、*p < 0.05 または **p < 0.01 vs DSS グループ。
さらに、属レベルの異なる SCFA と糞便微生物叢との間のピアソン相関係数を計算しました。図 6 に示すように、Akkermansia はプロピオン酸 (ピアソン = 0.4866) および酪酸 (ピアソン = 0.6192) の生成と正の相関がありました。対照的に、Enteromonas と Oscillobacter は両方とも酢酸生成と負の相関があり、ピアソン係数はそれぞれ 0.4709 と 0.5104 でした。同様に、Ruminococcaceae_UCG-014 は、それぞれプロピオン酸 (ピアソン = 0.4508) および酪酸 (ピアソン = 0.5842) の生成と負の相関がありました。
図6 異なるSCFAと結腸微生物とのピアソン相関分析。(A)酢酸を加えたエンテロモナス属、(B)酢酸を加えたコンカッション桿菌、(C)プロピオン酸を加えたアッカーマンシア属、(D)プロピオン酸を加えたルミノコッカス_UCG-014、(E)酪酸を加えたアッカーマンシア属、(F)酪酸を加えたルミノコッカス_UCG-014。
グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）は、抗炎症作用を持つプログルカゴン（Gcg）の細胞型特異的な翻訳後産物です。28 図7に示すように、DSSはGcg mRNA発現の有意な減少を引き起こしました。結腸およびBLG治療は、対照群と比較して、DSS誘導性Gcg減少を有意に逆転させることができました（図7A）。同時に、DSS治療群では血清中のGLP-1レベルが有意に低下し、BLG治療はこの低下を大幅に防止することができました（図7B）。短鎖脂肪酸はGタンパク質共役受容体43（GRP43）およびGタンパク質共役受容体41（GRP41）の活性化を介してGLP-1分泌を刺激することができるため、大腸炎マウスの結腸におけるGPR41およびGRP43も調べたところ、DSSチャレンジ後、GRP43およびGPR41の結腸mRNA発現が有意に低下し、BLG治療後、GRP43およびGPR41の結腸mRNA発現が有意に低下しました。これらの減少を効果的に救済することができました（図7CおよびD）。
図 7 BLG は、DSS 処理マウスの血清 GLP-1 レベルと結腸の Gcg、GPR41、および GRP43 mRNA の発現を増加させます。(A) 結腸組織における Gcg mRNA の発現、(B) 血清中の GLP-1 レベル、(C) 結腸組織における GPR41 mRNA の発現、(D) 結腸組織における GPR43 mRNA の発現。データは平均 ± SEM (n = 5–6) として示されています。#p < 0.05 または ##p < 0.01 vs コントロール (Con) グループ、*p < 0.05 vs DSS グループ。
BLG投与はDSS投与マウスの血清GLP-1濃度、結腸Gcg mRNA発現、糞便中SCFA濃度を上昇させる可能性があるため、対照マウス（F-Con）、DSS大腸炎マウス（F-Con）、BLG投与大腸炎マウス（F-BLG）の酢酸、プロピオン酸、酪酸をさらに調べ、マウスの初代結腸上皮細胞からのGLP-1放出を調べた。図8Aに示すように、それぞれ2mM酢酸、プロピオン酸、酪酸で処理した初代マウス結腸上皮細胞は、以前の研究と一致して、GLP-1放出を有意に刺激した。29,30同様に、F-Con、F-DSS、F-BLG（糞便0.25gに相当）はすべて、マウスの初代結腸上皮細胞からのGLP-1放出を大きく刺激した。注目すべきことに、F-DSS投与した初代マウス結腸上皮細胞から放出されたGLP-1の量は、上皮細胞におけるGLP-1産生は、F-ConおよびF-BLG処理した初代マウス結腸上皮細胞よりもはるかに低かった（図8B）。これらのデータは、BLG処理により腸のSCFA由来GLP-1産生が著しく回復したことを示唆している。
図 8 BLG 由来の SCFA は初代マウス結腸上皮細胞からの GLP-1 放出を刺激します。(A) 酢酸、プロピオン酸、酪酸は初代マウス結腸上皮細胞からの GLP-1 放出を刺激しました。(B) 糞便抽出物 F-Con、F-DSS、F-BLG は初代マウス結腸上皮細胞を刺激しました。放出された GLP-1 の量。結腸上皮細胞の一部をガラス底ペトリ皿に入れ、それぞれ 2 mM 酢酸、プロピオン酸、酪酸、糞便抽出物 F-Con、F-DSS、F-BLG (糞便 0.25 g に相当) で処理しました。それぞれ37°C、5% CO2で2時間。初代マウス結腸上皮細胞から放出されたGLP-1の量はELISAによって検出されました。データは平均±SEM（n = 3）として示されています。#p < 0.05または##p < 0.01 vs. ブランクまたはF-Con; *p < 0.05 vs. F-DSS。
略語: Ace、酢酸、Pro、プロピオン酸、butyric 酸、F-Con、コントロールマウスの糞便抽出物、F-DSS、大腸炎マウスの糞便抽出物、F-BLG、BLG 処理した炎症マウスの結腸糞便抽出物。
世界保健機関によって難治性疾患としてリストされている UC は、世界的な危険になりつつあります。しかし、この疾患を予測、予防、治療するための効果的な方法は依然として限られています。そのため、UCに対する安全で効果的な新たな治療戦略の探求と開発が急務となっています。多くの伝統的な漢方薬製剤は、何世紀にもわたって中国人のUC治療に効果があることが示されており、それらはすべて生物学的有機物と天然素材であり、ヒトや動物にほとんど無害であるため、有望な選択肢です。31,32本研究は、UC治療のための安全で効果的な伝統的な漢方薬製剤を探し、その作用機序を探ることを目的としました。BLGは、インフルエンザの治療に使用されるよく知られた漢方薬です。8,33私たちの研究室や他の研究室での研究では、BLGと同じ原料から加工された伝統的な漢方薬製品である藍が、ヒトと動物のUC治療に顕著な有効性を示すことが示されています。4,34しかし、BLGの抗大腸炎効果とその効果のメカニズムは不明です。本研究では、BLGがDSS誘発性結腸炎を効果的に軽減することを示しています。炎症は腸内細菌叢の調整および腸由来の GLP-1 産生の回復に関連しています。
UCは、体重減少、下痢、直腸出血、広範囲な結腸粘膜損傷などの典型的な臨床的特徴を伴う再発期を特徴とすることがよく知られています。35 そのため、慢性再発性大腸炎は、1.8％DSSを5日間3サイクル投与し、その後7日間水を飲ませることで治療されました。図1Bに示すように、体重減少とDAIスコアの変動は、慢性再発性大腸炎の誘導に成功したことを示していました。BLGで治療したグループのマウスは、8日目から回復の上昇を示し、これは24日目とは有意に異なっていました。同じ変化はDAIスコアにも観察され、大腸炎の臨床的改善の改善を示唆しています。結腸の損傷と炎症状態に関しては、結腸の長さ、結腸組織の損傷、結腸組織における炎症性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6の遺伝子発現と産生もBLG治療後に大幅に改善されました。これらの結果を総合すると、BLGが治療に有効であることは明らかです。マウスにおける慢性再発性大腸炎。
BLG はどのように薬理作用を発揮するのでしょうか。これまでの多くの研究から、腸内細菌叢が UC の発症に重要な役割を果たしていることが示されており、マイクロバイオーム ベースおよびマイクロバイオームを標的とした治療法は、UC の治療における非常に魅力的な戦略として浮上しています。本研究では、BLG 治療によって腸内細菌叢の組成に大きな変化がもたらされ、DSS 誘発性大腸炎に対する BLG の保護効果が腸内細菌叢の調整に関連していることが示されました。この観察結果は、腸内細菌叢の恒常性を再プログラムすることが TCM 製剤の有効性を理解するための重要なアプローチであるという考えと一致しています。36,37 特に、Akkermansia は腸の粘液層に生息するグラム陰性の厳密な嫌気性細菌で、ムチンを分解し、プロピオン酸を生成し、杯細胞の分化を刺激し、粘膜を維持します。 26 複数の臨床データおよび動物データから、Akkermansia は健康な粘膜と高い関連性があることが示唆されており、38 Akkermansia 属の細菌を経口投与すると、粘膜バリアの完全性を維持することが示唆されています。粘膜の炎症を著しく改善することができる。39 我々の現在のデータは、BLG処理後にAkkermansiaの相対的存在量が有意に増加することを示唆している。さらに、Prevotellaceae_UCG-001はSCFA産生細菌である。27 複数の研究は、Prevotellaceae_UCG-001が大腸炎を患う動物の糞便中に低い相対存在量で発見されたことを示した。40,41 我々の現在のデータはまた、BLG処理がDSS処理マウスの大腸におけるPrevotellaceae_UCG-001の相対的存在量を有意に増加させることができることを示している。対照的に、Oscillibacterは中温性で、厳密な嫌気性細菌である。42はUCマウスにおいてOscillibacterの相対的存在量が有意に増加し、IL-6およびIL-1βレベルおよび病理学的スコアと有意に正の相関関係にあったと報告した。43,44 注目すべきことに、BLG処理は、 DSS 処理マウス。注目すべきことに、これらの BLG 変化細菌は最も多くの SCFA 産生細菌でした。これまでの多数の研究で、SCFA が結腸の炎症および腸上皮の完全性の保護に対して潜在的に有益な効果があることが実証されています。45,46 私たちの現在のデータでは、DSS 処理した糞便中の SCFA 酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度が BLG 処理したマウスで大幅に増加したことも観察されています。総合すると、これらの知見は、BLG 処理が慢性再発性大腸炎のマウスの DSS 誘発性 SCFA 産生細菌を効果的に強化できることを明確に示しています。
GLP-1 は、主に回腸と結腸で生成されるインクレチンであり、胃内容排出を遅らせ、食後血糖値を下げる上で重要な役割を果たします。47 証拠は、ジペプチジルペプチダーゼ (DPP)-4、GLP-1 受容体作動薬、および GLP-1 ナノ医薬品が、マウスの腸の炎症を効果的に緩和できることを示唆しています。48-51 以前の研究で報告されているように、高い SCFA 濃度は、ヒトとマウスの血漿 GLP-1 レベルと関連していました。52 私たちの現在のデータは、BLG 治療後、血清 GLP-1 レベルと Gcg mRNA 発現が有意に増加したことを示しています。同様に、BLG 治療を受けた大腸炎マウスの糞便抽出物で刺激した後の結腸培養では、DSS 治療を受けた大腸炎マウスの糞便抽出物で刺激した場合と比較して、GLP-1 分泌が有意に増加しました。SCFA は GLP-1 の放出にどのように影響するのでしょうか。 SCFA は GRP43 と GPR41 を介して GLP-1 分泌を刺激できることが報告されています。29 私たちの現在のデータはまた、BLG 治療により DSS 治療マウスの結腸で GRP43 と GPR41 の mRNA 発現が著しく増加することを示しています。これらのデータは、BLG 治療により GRP43 と GPR41 が活性化され、SCFA 促進による GLP-1 産生が回復することを示唆しています。
BLG は中国では長期にわたって市販されている医薬品です。昆明マウスにおけるBLGの最大耐量は80g/kgであり、急性毒性は観察されていない。53 現在、ヒトにおけるBLG（無糖）の推奨投与量は9～15g/日（1日3回）である。本研究では、BLG 1g/kgをマウスに投与したところ、DSS誘発性慢性再発性大腸炎が改善したことが示された。この投与量は、臨床で使用されるBLG投与量に近い。また、本研究では、その作用機序は、少なくとも部分的には、腸内細菌叢、特にAkkermansiaやPrevotellaceae_UCG-001などのSCFA産生細菌の変化によって、腸内由来GLP-1産生を回復させることによって媒介されることも明らかになった。これらの知見は、BLGが臨床大腸炎治療における潜在的な治療薬としてさらに検討する価値があることを示唆している。しかし、BLGが腸内細菌叢をどのように調節するかという正確なメカニズムは、細菌叢欠損マウスと糞便実験によって確認される必要がある。細菌移植。
Ace、酢酸、but、酪酸、BLG、パンダン、DSS、デキストラン硫酸ナトリウム、DAI、疾患活動指数、DPP、ジペプチジルペプチダーゼ、FID、水素炎イオン化検出器、F-Con、マウスのコントロール糞便抽出物、F-DSS、DSS大腸炎マウスの糞便抽出物、F-BLG、BLG治療大腸炎マウスの糞便抽出物、GLP-1、グルカゴン様ペプチド-1、Gcg、グルカゴン、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、GRP43、Gタンパク質共役受容体43、GRP41、Gタンパク質共役受容体41、H&E、ヘマトキシリン-エオシン、HBSS、ハンクス平衡塩類溶液、OTC、OTC、PCA、主成分分析、PCoA、主座標分析漢方薬、伝統中国医学、UC、潰瘍性大腸炎。
すべての実験プロトコルは、機関ガイドラインおよび動物規則（倫理番号 A2020157）に従って、北京大学深圳-香港科技大学医療センター（中国深圳）の動物倫理委員会によって承認されました。
すべての著者は、構想と設計、データ取得、またはデータ分析と解釈に大きく貢献し、記事の草稿作成や重要な知的コンテンツの批判的改訂に参加し、現在のジャーナルに原稿を提出することに同意し、最終的に出版バージョンを承認し、作業のすべての側面に責任を負っています。
この研究は、中国国家自然科学基金（81560676 および 81660479）、深セン大学一流プロジェクト（86000000210）、深セン市科学技術イノベーション委員会基金（JCYJ20210324093810026）、広東省医学科学技術研究基金（A2020157 および A2020272）、貴州省貴州医科大学薬学部重点実験室（YWZJ2020-01）、北京大学深セン病院（JCYJ2018009）の支援を受けて行われました。
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