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脊椎動物とは異なり、昆虫には雄に偏った性ステロイドホルモンが存在しないと広く考えられている。ガンビアハマダラカでは、エクジソンステロイドである20-ヒドロキシエクジソン（20E）は、雌が合成すると卵の発育を制御し、雄が性的に伝達すると交尾不応期を誘発するように進化してきたと考えられている。卵の発育と交尾は生殖に不可欠な形質であるため、雌のハマダラカがこれらのホルモンシグナルをどのように統合しているかを理解することは、新しいマラリア対策プログラムの設計に役立つ可能性がある。本研究では、これらの生殖機能が、エクジステロイド活性化/不活性化酵素の複雑なネットワークを介して、異なる性ステロイドによって制御されていることを明らかにした。我々は、雄特異的な酸化エクジソンである3-デヒドロ-20E（3D20E）を同定した。これは、性的に伝達され、脱リン酸化によって活性化されると、雌の性的受容性を停止させることで親子関係を保護する。注目すべきことに、3D20Eの伝達は、マラリア原虫感染中に卵の発育を維持し、感染した雌の健康を確保する生殖遺伝子。雌由来の20Eは性的反応を引き起こさないが、20E阻害キナーゼが阻害された後に交尾個体が産卵することを可能にする。この雄特異的な昆虫ステロイドホルモンの同定と、雌の性的受容性、生殖能力、マラリア原虫との相互作用の調節におけるその役割は、マラリアを媒介する蚊の繁殖成功を低下させる可能性を示唆している。
マラリアの症例数と死亡者数は、ヒトマラリア原虫の唯一の媒介者であるアノフェレス蚊の殺虫剤耐性の広がりにより、再び増加傾向にあります。これらの蚊の交尾生物学は、雌が一度しか交尾しないため、新しいマラリア対策の特に魅力的な標的です。この一度の交尾イベントを不妊にすることで、野外での蚊の個体数を大幅に減らす可能性が高まります。
女性は男性から高濃度のステロイドホルモンを受け取った後、性的に不適格になる。研究によると、その後の交尾困難の引き金となるのは、幼虫期の脱皮周期の調節因子としてよく知られているステロイドホルモンである20-ヒドロキシエクジソン（20E）である。オスが20Eを合成して伝達する能力は、アフリカに分布し、マラリアの最も危険な媒介蚊であるガンビアハマダラカを含むセリア亜属に属するアノフェレス属の種で特に進化してきた。これは、これらの種ではメスも吸血後に20Eを産生し、20Eが卵形成周期を促進するため、特に注目に値する（参考文献8参照）。しかし、メスが2つの異なるエクジソン源（オスからの伝達と吸血による誘導）からのシグナルを、自身の交尾能力を損なうことなくどのように統合しているかについてはほとんど知られていない。実際、メスが産生する20Eが性不耐性を引き起こす場合、これは、未交尾の個体に不妊症を引き起こす可能性があり、これらの蚊では非常に一般的な行動である5。
考えられる説明としては、A. gambiae のオスが改変されたオス特有のエクジソンをメスに伝達し、それがメスの生殖器内でシグナル伝達カスケードを活性化させ、交尾の不安定性を引き起こすというものである。しかし、脊椎動物にはエストロゲンやアンドロゲンなどの複数のステロイドホルモンが存在するが (参考文献 9 で概説)、我々の知る限り、昆虫ではアンドロゲン偏向ステロイドは確認されていない。
我々は、性的に成熟したA. gambiaeの雄の副性腺（MAG）におけるステロイドホルモンのレパートリーを決定し、修飾ステロイドの可能性を探ることを目的とした。以前使用されていた特異性の低い方法ではなく、高速液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法（HPLC-MS/MS）を組み合わせることで、この組織中にエクジソン（E）と20Eを検出し、以前の結果を確認した。しかし、サンプルは酸化リン酸化ステロイドが主体であり、3-デヒドロ-20E-22-リン酸（3D20E22P）12の式と一致していた（図1）。他の形態には、3-デヒドロ-20E（3D20E）と20E-22-リン酸（20E22P）が含まれる。3D20E22PのHPLC-MS/MSシグナル強度は、その脱リン酸化形態である3D20Eよりも2桁高く、Eおよび20Eのシグナル強度よりも3桁高かった。 20E (図 1)。体の他の部分や下部生殖器 (LRT; 拡張データ図 1a) では、エクジステロイドも分析しました。また、新たに閉鎖した (1 日未満) 雄と雌のエクジステロイドも分析し、MAG でのみ 3D20E と 3D20E22P を検出しました。E、20E、20E22P は両性に存在していました (拡張データ図 1b)。これらのデータは、A. gambiae 成虫の雄が、雌では合成されない高力価の修飾ホルモンを MAG で産生することを示唆しています。
4日齢の未交尾雄と未交尾雌および交尾済み雌（交尾後0.5、3、12時間）からMAGと雌LRT（心房、精嚢、卵巣傍組織を含む）を解剖した。これらの組織中のエクジソンをHPLC-MS/MSで分析した（平均±標準誤差；対応のないt検定、両側検定、偽発見率（FDR）補正；NS：有意差なし；*P < 0.05、**P < 0.01）。3D20E：3時間対0.5時間、P = 0.035；12時間対3時間、P = 0.0015；12時間対0.5時間、P = 0.030。3D20E22P：3時間対0.5時間、P = 0.25；12時間対3時間12 時間 vs. 0.5 時間、P = 0.0032; 12 時間 vs. 0.5 時間、P = 0.015)。データは 3 つの生物学的複製から得られたものです。各エクジソンのピーク面積を計算し、蚊の数で正規化しました。エクジソンは、次の色で表されます: E、緑; 20E、オレンジ; 20E22P、紫; 3D20E、青; 3D20E22P、ピンク。挿入図は、y 軸のスケールを拡大して、エクジソンのレベルが低いことを示しています。
交尾中に3D20E22Pと3D20Eが移行するかどうかを調べるために、交尾後のさまざまな時点で雌のLRTを解剖しました。未交尾の雌ではエクジソンは見つかりませんでしたが、交尾直後（交尾後0.5時間、hpm）のLRTにかなりの量の3D20E22Pが観察され、時間の経過とともに減少しましたが、3D20Eのレベルは有意に増加しました（図1）。化学合成した3D20Eを標準として使用して、交尾中のLRTにおけるこのステロイドホルモンのレベルは20Eよりも少なくとも100倍高いことがわかりました（拡張データ表1）。したがって、3D20E22Pは交尾中に雌のLRTに移行する主要な雄のエクジソンであり、その脱リン酸化型である3D20Eは交尾直後に非常に豊富になります。これは、後者のエクジソンが雌の交尾後生物学において重要な役割を果たしていることを示唆しています。
カスタム構築したバイオインフォマティクスパイプラインを使用して、新しいRNAシーケンス（RNA-seq）データセット（図2a）を作成した後、エクジソンキナーゼ（EcK）、エクジソンオキシダーゼ（EO）、およびエクジソンをコードする20E修飾ホスファターゼ遺伝子を検索しました。EPP）は生殖組織で発現しています。1つの候補EPP遺伝子と2つの潜在的なEcK遺伝子（EcK1とEcK2）を特定しましたが、適切な候補EO遺伝子は見つかりませんでした。注目すべきことに、個々のEPP遺伝子はガンビアMAGでは高レベル（98.9パーセンタイル）で発現していましたが、雌LRTでは発現していませんでした（図2b）。これは、この雌組織で3D20E22Pの脱リン酸化が起こっているという我々の予想に反しています。したがって、雄のEPPは交尾中に伝達される可能性があると考えています。実際、交尾後に雌のタンパク質をマスクするためにin vivo安定同位体標識を使用しました。雌の心房におけるMS（図2cおよび補足表1）。MAGおよび交尾済みの（ただし未交尾ではない）雌のLRTにおけるEPPの存在も、特異抗体を用いて確認された（図2d）。
a、各性の生殖組織から EcK、EO、EPP をコードする遺伝子を検索するためのカスタム構築されたバイオインフォマティクスパイプライン。矢印の横の数字は、各ステップでの男性と女性の候補の数を示します。この分析により、男性で発現する 1 つの EPP 遺伝子 (EPP) と 1 つの EcK 遺伝子 (EcK1)、および両性で発現するが候補 EO 遺伝子を生成しない 1 つの EcK 遺伝子 (EcK2) が特定されました。b、未交尾 (V) および交尾 (M) の Anopheles gambiae および Anopheles albicans 組織における候補遺伝子発現を比較したヒートマップ。Spca、受精。MAGs、男性の付属腺。乳房、翼、脚、脂肪体、両性の内臓、雌の卵巣など、体の他の部分。EcK2 はガンビアの MAG と心房の両方で高発現しているが、EPP は MAG でのみ見られる。c、3、12、24 hpm での雄の射精群の雌の心房への移行のプロテオミクス解析。最も豊富な 67 種類のタンパク質を示す。雌は、すべてのタンパク質を標識（およびマスキング）するために 15N を含む餌で飼育された。標識されていない雄は標識された雌と交配され、雌の LRT は 3、12、24 hpm で解剖され、プロテオミクス解析が行われた（射精タンパク質の完全なリストについては補足表 1 を参照）。挿入図、EPP、Eck1、EcK2 は、これらの組織のプロテオミクス解析により、未交尾雄の MAG で検出された。d、EPP は、交配された雌の MAG と LRT でウェスタンブロットにより検出されたが、未経産の雌または雄、あるいは雌の体の残りの部分。膜は、抗アクチン（ローディングコントロール）抗体と抗EPP抗体で同時にプローブされた。雄はすべて未経産である。ゲルソースデータについては、補足図1を参照。ウェスタンブロットは2回実施され、同様の結果が得られた。
EPPのエクジステロイドホスホホスファターゼ活性は、MAGから単離した3D20E22PとのHPLC-MS/MSによるインキュベーション後に検証された（拡張データ図2a）。さらに、RNA媒介干渉（RNAi）によってEPPをサイレンシングすると、これらの雄の生殖組織でホスファターゼ活性が大幅に低下することが検出され（図3a）、EPPサイレンシングされた雄と交尾した雌は、部分的な遺伝子サイレンシングにもかかわらず、脱リン酸化された3D20Eの割合が有意に低かった（図3b）（拡張データ図2b、c）。対照的に、同じ蚊で20E22P/20E比に有意な変化は検出されず、この酵素が3D20E22Pに特異的であることを示唆している可能性がある（図3b）。
a、二本鎖EPP RNA（dsEPP）または二本鎖GFP RNA（dsGFP）コントロールを用いたEPPサイレンシングによるMAGのホスファターゼ活性の低下。各反復実験で20個のMAGプールが使用され（P = 0.0046、対応のあるt検定、両側）、別々の点で示されている。b、EPPサイレンシングされたオスと交配したメスは、3 hpmで脱リン酸化された3D20Eの割合が有意に低かった（P = 0.0043、対応のないt検定、両側）が、20Eレベルは影響を受けなかった（P = 0.063、対応のない）。 t検定、両側検定）。データは、それぞれ13、16、19匹の雌からなる3つのプールからの平均±標準誤差として示されています。c、EPPサイレンシングされた雄と交尾した雌は、再交尾率が有意に高かった（P = 0.0002、フィッシャーの正確検定、両側検定）。雌は、まず交尾を強制され、交尾状態が確認されました。 2日後、遺伝子組み換え精子を持つ他のオスと接触させ、遺伝子組み換え遺伝子の定量的PCR検出により再交配率を評価した。d、EPPサイレンシングオスと交配した吸血メスは、生殖能力が有意に低下し（P < 0.0001、マン・ホイットニー検定、両側）、卵数もわずかに減少したが（P = 0.088、マン・ホイットニー検定、両側）、産卵率は影響を受けなかった（P = 0.94、フィッシャーの正確確率検定、両側）。すべてのパネルにおいて、nは生物学的に独立した蚊のサンプル数を表す。NS、有意差なし。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.001。
次に、エクジソン脱リン酸化が雌の交尾抵抗性の誘導に重要かどうかを評価した。注目すべきことに、EPP欠損雄と交尾した雌は、追加の（遺伝子組み換え）雄に曝露された際に、対照雌（10.4%）よりもはるかに高い頻度（44.9%）で再交尾した（図3c）。また、これらの雌の生殖能力の有意な低下（図3d、左）と産卵数のわずかな減少（図3d、中央）が観察されたが、雌の産卵率（交尾によって雌に引き起こされる別の反応）は影響を受けなかった（図3d、右）。EPPの3D20E22Pに対する特異性が観察されたことを考慮すると、これらの結果は、交尾中に伝達されるEPPによる3D20Eの活性化が、雌のさらなる交尾に対する受容性をオフにする上で重要な役割を果たしている可能性を示唆している。この行動は、以前は20Eの性的伝達に起因すると考えられていた。したがって、この男性特有のホルモンは、女性の生殖能力にも強い影響を与える。
次に、性的に成熟した未経産雌に化学合成した3D20E（図4a～c）と市販の20Eを用いて注射実験を行い、20Eと3D20Eの活性を比較した。その結果、3D20Eは、両方の濃度において、雌の交尾に対する感受性を遮断する効果が20Eよりも有意に高いことがわかった（図4d）。特に、LRTにおける3D20Eの生理的レベルの半分（注射後1,066 pg vs. 交尾後2,022 pg）では、最高濃度である交尾後18 pgで注射してから24時間後の20Eの生理的レベル（注射後361 pg）よりも20倍高い割合の不応性雌が誘発された。拡張データ表1）。この結果は、20Eの性的伝達が交尾不応期を引き起こさないという考えと一致しており、さらに3D20Eが親子関係を確保する主要な要因であることを示唆しています。3D20Eは、未経産雌の産卵アッセイにおいて20Eよりも有意に活性が高かった（図4e）ことから、EPPの部分的サイレンシング後に観察された正常な産卵率は、交尾誘導雌因子によってまだ産生されている残留3D20E活性の存在によるものであることが示唆されます。
(a,b) 20E (a) から化学合成された 3D20E は非常に高い変換率/効率で合成された (データは 3 つの独立した合成反応の平均 ± 標準誤差として示されている) (b)。c、質量スペクトル (下半分) は、交尾した雌の LRT (上半分) で見つかったエクジソンと完全に一致する。d、20E (0.63 µg、P = 0.02; 0.21 µg、P < 0.0001; フィッシャーの正確確率検定、両側) および 10% エタノール (0.63 µg、P < 0.0001; 0.21 µg、P < 0.0001; フィッシャーの正確確率検定、両側) と比較すると、20E は高用量 (0.63 µg、P = 0.0002; 0.21 µg、P = 0.54; フィッシャーの正確確率検定、両側) でのみコントロールよりも有意に高かった。 3D20E 注射は、10% エタノール対照群よりも未交尾雌の産卵率を有意に高めた (0.21 µg、P < 0.0001; 0.13 µg、P = 0.0003; フィッシャーの正確検定、両側)。一方、20E は対照群と比較して、高用量でのみ有意な産卵率を示した (0.21 µg、P = 0.022; 0.13 µg、P = 0.0823; フィッシャーの正確検定、両側)。3D20E は、高用量で 20E よりも有意に高い産卵率を誘導した (0.21 µg、P = 0.0019; 0.13 µg、P = 0.075; フィッシャーの正確検定、両側)。すべてのパネルで、n は生物学的に独立した蚊のサンプル数を表す。NS、有意差なし。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.001。データは3回の反復実験によるものです。
これまでの研究で、ステロイドホルモンの性的伝達が、最も致命的なヒトマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫感染からA. gambiae雌を保護する雌性生殖遺伝子MISO（Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11）の発現を誘導することを明らかにしました。マラリア流行地域におけるAnophelesの生殖適応度に対するMISOの重要性を考慮し、3D20Eまたは20Eのどちらのホルモンがこの遺伝子の発現を誘発するかを決定することにしました。20Eの注射は、HR3やHR4などの核内ホルモン受容体（HR）や、卵黄形成遺伝子Vg14、15、16などの典型的な下流ステロイド標的を特異的またはより強力に誘導しましたが、MISOは3D20Eによってより強く誘導されました（拡張データ図3）。したがって、このアンドロゲンステロイドホルモンの性的伝達は、寄生虫感染によるコストから雌を守る。さらに、3D20EはE受容体EcRの両方のアイソフォームに異なる影響を与え、EcR-Aを誘導し、EcR-Bを抑制し、雌の生殖能力に影響を与えるHPX15を含む他の交配誘導遺伝子をより強く活性化する。これは、EPPサイレンシングされた雄と交配した雌に見られる著しい不妊を説明できる可能性がある（拡張データ図3）。これらのデータは、性別特異的な機能の根底にある可能性のある、2つのエクジソンホルモンによって優先的に活性化される下流経路の存在を示唆している。
次に、バイオインフォマティクスパイプラインで同定された 2 つの EcK 遺伝子の機能をテストしました。EcK1 または EcK2 のサイレンシングにより雄に有意な死亡が見られました (拡張データ図 4a)。これは、エクジソンのリン酸化、ひいては不活性化が生存に重要であることを示唆しています。EcK2 は EcK1 よりも高いレベルで発現しており、プロテオミクスにより MAG で検出されたため (図 2b、c および補足表 2)、20E とインキュベートしてエクジステロイドキナーゼ活性を検証したところ、リン酸化 20E22P が得られました (拡張データ図 2)。4b)。基質として 3D20E を使用した場合、リン酸化生成物 3D20E22P を検出できませんでした (拡張データ図 4c)。これは、3D20E ではなく 20E が EcK2 の優先ターゲットである可能性を示唆しています。
RNA-seq解析によると、EcK2は未経産雌のLRTでも高発現しており、交尾後に発現が抑制された（図2b）。これらのデータを確認し、EcK2の発現は吸血によって影響を受けないことを明らかにした（拡張データ図5a）。初期のMS実験を拡張し、20E22Pのピークが20Eのピークと密接に関連していることを明らかにした（吸血後22～26時間；拡張データ図5b）。未経産雌におけるEcK2のサイレンシングにより、吸血後26時間における20Eと20E22Pの相対比が3倍に増加した（拡張データ図2cおよび5c）。これは、EcK2が雌においても20Eをリン酸化することを示している。特筆すべきは、EcK2欠損未経産雌は完全な性的受容性を維持していたことである（拡張データ図5d、e）。これは、雌における20Eの産生が発情を誘発しないことをさらに示唆している。交尾不応期。しかし、これらの雌は対照群と比較して産卵率が有意に増加し、未交尾個体の 30% 以上が産卵した (拡張データ図 5f)。二本鎖 Eck2 RNA (dsEcK2) の注射を吸血後に行うと、産卵は起こらず、その時点では吸血による 20E のピークは減少していた。全体として、これらの結果は、吸血後に生成される 20E が産卵を誘発できるが、産卵ブロック (EcK2 およびおそらく他の因子) が交尾によってオフになった場合のみであるというモデルを支持する。20E も 3D20E も注射しても未交尾個体の EcK2 発現は阻害されなかった (拡張データ図 5g)。これは、他の因子がこのキナーゼの阻害を媒介していることを示唆している。しかし、吸血後の 20E レベルは交尾不快感を誘発するには不十分であったが、性的に伝達された 3D20E の高力価によって効果的に誘発された。
私たちの研究結果は、A. gambiaeの繁殖成功を制御するメカニズムに関する重要な知見を提供する。オスは、メスをさらなる交尾に対して鈍感にすることで親子関係を確実にする、オス特異的な修飾エクジソンである3D20Eを高力価で合成するように進化してきたというモデルが浮上している。同時に、これらのマラリア媒介昆虫は、オス特異的なEPPの性的伝達に応答してメスの3D20Eを活性化する効率的なシステムも進化させてきた。我々の知る限り、これは昆虫においてオスとメスが優位なステロイドホルモンシステムが独特かつ重要な機能を果たす最初の例である。オス特異的なエクジソン機能は仮説として提唱されてきたが、決定的に実証されてはいない。例えば、これらの機能は20E前駆体E1によって行われる可能性があるという仮説18は、ほぼ否定されている。ショウジョウバエでは、単婚制はニューロンと相互作用する小さな性ペプチド19,20の性的伝達によって引き起こされることがよく知られている。特定の性ペプチド受容体を介して雌の生殖器系に神経支配している21,22。A. gambiaeの雌における3D20Eによって制御される下流のシグナル伝達カスケードを決定し、これらのカスケードが蚊とショウジョウバエの間で保存されているかどうかを判断するには、さらなる研究が必要である。
本研究で明らかになった、雌の生殖能力と行動における3D20Eの重要な役割を考慮すると、3D20Eの合成と活性化につながる経路は、不妊虫放飼技術戦略における競争力のある不妊雄の生成など、将来の蚊の制御戦略に新たな機会を提供する。野生への放飼や、処女の遊びにおける3D20Eの模倣に利用する。3D20Eの雄特異的な機能は、A. gambiaeや他のCellia属が精液を凝固させて交尾栓にする能力を獲得した際に進化してきた可能性がある。これは、多数のホルモンとホルモン活性化酵素の効率的な伝達を可能にするためである。一方、単婚制を実現する3D20Eの進化は、雌が（MISOの高発現を通じて）マラリアの蔓延率が高い地域で生殖適応度を高めるメカニズムを提供し、間接的にプラスモジウムの伝播に寄与する。雌の20Eは、雌におけるP. falciparumの生存と成長に大きな影響を与えることが示されている。アノフェレス蚊24では、オスとメス両方のステロイドホルモン経路が蚊と寄生虫の相互作用の重要な側面となっている。
A. gambiae G3 株は、標準的な昆虫飼育条件 (26～28 °C、相対湿度 65～80%、明暗周期 12 時間: 12 時間) で飼育した。幼虫には粉末状の魚用飼料 (TetraMin Tropical Flakes、Koi Pellets、Tetra Pond Sticks を 7:7:2 の割合で混合) を与えた。成虫の蚊には、10% ブドウ糖溶液を自由に摂取させ、週に 1 回ヒトの血液 (研究用血液成分) を与えた。未交尾の蚊は、蛹の段階で両端を顕微鏡で観察した後、雌雄を分離して得た。DsRed トランスジーンを持つ雄については、既に報告されている。
強制交配実験は、既述のプロトコルに従って実施した。自然交配の場合、生後4日の未交尾雌を性的に成熟した未交尾雄と1：3の比率で2晩飼育した。dsEPPを雄に注射する実験では、ホスファターゼ活性が最大限に抑制される注射後3～4日目に同居させた（拡張データ図2b）。
蚊の組織、残りの死骸（体の残りの部分）、または全身を100%メタノールに解剖し、ビーズホモジナイザー（2 mmガラスビーズ、2,400 rpm、90秒）で均質化した。組織量とメタノール量は次のとおりである：体の残りの部分、50 / 1,000 µl；MAG、50～100 / 80 µl；雌LRT、25～50 / 80 µl。沈殿物を同じ量のメタノールで2回目のメタノール抽出にかけた。遠心分離により細胞破片を除去した。両方の抽出液からのメタノールを合わせて窒素気流下で乾燥させ、その後、次の量の80%メタノール水溶液に再懸濁した：体の残りの部分、50 µl；MAGと雌LRT、30 µl。
サンプルは、LC装置（Vanquish、Thermo Fisher）に接続された質量分析計（ID-X、Thermo Fisher）で分析されました。5 µlのサンプルが、25 °Cに維持された3 µm、100 × 4.6 mmカラム（Inspire C8、Dikma）に注入されました。LCの移動相は、A（水、0.1%ギ酸）とB（アセトニトリル、0.1%ギ酸）でした。LCグラジエントは次のとおりでした：1分間5% B、その後11分かけて100% Bまで増加。100%で8分後、5% Bで4分間カラムを再平衡化します。流速は0.3 ml min-1でした。MSソースでのイオン化は、正および負モードで加熱エレクトロスプレーイオン化によって行われます。
質量分析計は、フルMSモードで60,000の分解能でm/z 350～680の範囲のデータを測定します。MS/MSデータは、[M + H]+（すべてのターゲット）、[M - H2O + H]+（すべてのターゲット）、および[M - H]-（リン酸化ターゲット）について取得しました。MS/MSデータは、標準が入手できないターゲットのエクジソン特性を確認するために使用されました。非ターゲットのエクジステロイドを同定するために、相対存在量が15%を超えるすべてのHPLCピークのMS/MSデータが分析されました。純粋な標準（20E、3D20E）から作成された標準曲線を使用して絶対量を計算するか、特定のサンプル（他のすべてのターゲット）の希釈を使用して、1人の男性で見つかった量との等価性を計算して定量します。3D20Eの場合、次の付加物の合計を使用して定量しました：[M + TFA]-、[M + COOH]-、[M + Na]+、[M + Cl]-、[M + NO3]-。データはTracefinder（バージョン4.1）を使用して抽出および定量化されました。MS/MSデータはXcalibur（バージョン4.4）を使用して分析されました。E、20E、および3D20EのMSスペクトルは、それぞれの標準と比較されました。3D20E22Pは、ジラール試薬による誘導体化によって分析されました。20E22Pは、m/z比によって分析されました。
3D20E22PはMAGから精製された。精製は、HPLC-MS/MS分析と同じLC条件で、四重極質量検出器（QDa、Acquity、Waters）を備えた超高速液体クロマトグラフ（Acquity、Waters）を使用して分析スケールで行われた。3D20E22Pに対応するm/zが、以前に決定されたのと同じ保持時間で検出されたときに、フラクションの収集が開始された。抽出された化合物の純度は、上記のようにHPLC-MS/MSで確認された。
製造元の指示に従い、TRI試薬（Thermo Fisher）を用いて、10～12個の生殖組織または他の部位（頭部なし）から総RNAを抽出した。RNAはTURBO DNase（Thermo Fisher）で処理した。製造元の指示に従い、Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素（M-MLV RT；Thermo Fisher）を用いてcDNAを合成した。逆転写定量PCR（RT-qPCR；拡張データ表2）用のプライマーは、既報24のもの、またはPrimer-BLAST26を用いて設計したもので、70～150 bpのサイズでエクソン間接合部をまたぐもの、あるいはエクソンを分離するプライマーペアを優先した。3～4個の生物学的複製サンプルから得られたcDNAサンプルをRT-qPCR用に水で4倍希釈した。定量は、1× PowerUp SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher）、プライマー、および希釈した5 µlを含む15 µlの複製反応で行った。 cDNA。反応はQuantStudio 6 ProリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher）で実行され、データはDesign and Analysis（バージョン2.4.3）を使用して収集および分析されました。この研究で実証されているように、相対量はリボソーム遺伝子RpL19（AGAP004422）に対して正規化されました。RpL19の発現は、吸血27または交配3によって有意に変化しませんでした。
RNAの品質は、Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) を使用してチェックしました。Illumina ペアエンドライブラリは、MIT とハーバード大学の Broad Institute で準備および実行されました。シーケンスリードは、デフォルトパラメータを使用して HISAT2 (バージョン 2.0.5) を使用して A. gambiae ゲノム (PEST 株、バージョン 4.12) にアライメントされました。マッピング品質 (MAPQ) スコアが 30 未満のリードは、Samtools (バージョン 1.3.1) を使用して削除されました。遺伝子にマッピングされたリードの数は、デフォルトパラメータを使用して htseq-count (バージョン 0.9.1) を使用してカウントされました。正規化されたリードカウントが計算され、R (バージョン 4.0.3) の DESeq2 パッケージ (バージョン 1.28.1) を使用して遺伝子の差次的発現が分析されました。
エクジソン修飾遺伝子候補は、まずPSI-BLASTアルゴリズム（https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/）を使用してA. gambiaeゲノムを検索し、デフォルト値のパラメータを使用して、以下のクエリタンパク質配列で同定されました：カイコ（アクセッション番号NP_001038956.1）、イエバエ（アクセッション番号XP_005182020.1、XP_005175332.1、XP_011294434.1）、およびミクロプリティス・デモリター（アクセッション番号XP_008552646.1、XP_008552645.1）由来のEcK、カイコ（アクセッション番号NP_001036900）、ショウジョウバエ（アクセッション番号NP_651202）由来のEcK、 Apis mellifera (アクセッション番号 XP_394838) および Acyrthosiphon pisum (アクセッション番号 XP_001947166)、B. mori (アクセッション番号 XP_001947166) の EPP (NP_001177919.1 および NP_001243996.1) および D. melanogaster (アクセッション番号 NP_572986.1) の EO (ステップ 1)。次に、ガンビアの生殖組織 (雌 LRT または MAG) における高 mRNA 発現 (100 万マッピング リードあたり 100 フラグメント/キロベース エキソン (FPKM) または 85%) に基づいてヒットをフィルタリングします (ステップ 2)。特異性を向上させるため、交尾中にエクジソンを合成または伝達しないアノフェレス属の一種である A. albimanus の生殖組織でも発現している候補酵素を選択しました。候補遺伝子は、A. albimanus の生殖組織での発現が低い (<100 FPKM または <85 パーセンタイル) ことを基準にフィルタリングされました (ステップ 3)。最終フィルター (ステップ 4) として、候補遺伝子は、次の少なくとも 1 つを満たす必要があります。(1) 差次的発現遺伝子の分析によると、交尾後に有意に上方制御される (P < 0.05)、および (2) 非生殖組織 (< 85 % または <100 FPKM)。
我々は、全生物同位体標識を実現するために、以前に説明した方法28,29,30を改良した。簡単に説明すると、野生型サッカロミセス・セレビシエII型（YSC2、シグマ）を、2%グルコース（G7528、シグマ）、1.7%アミノ酸フリー、および硫酸アンモニウム（重量/体積）を含む酵母窒素ベース（BD Difco、DF0335）で試験した。培養培地）と窒素源として 5% 15N 硫酸アンモニウム (NLM-713、>99%、Cambridge Isotope Laboratories) のみを使用した。酵母は遠心分離によって回収し、蚊の幼虫は蛹になるまで自由に餌を与えられた。第 4 齢幼虫の死亡を防ぐため、魚粉 (300 匹の幼虫あたり 0.5 mg) を補給した。その後、雌のみを標識されていない雄との交配実験に使用し、交配中に伝達される雄のプロテオームを分析した。
4～6日齢の15N標識未交尾雌を、同年齢の標識なし未交尾雄と強制的に交尾させた。交尾の成功は、落射蛍光顕微鏡下で交尾栓を検出することによって確認した。3、12、24時間後、交尾した45～55匹の雌の心房を50 µlの炭酸水素アンモニウム緩衝液（pH 7.8）に解剖し、乳鉢で均質化した。均質化物を遠心分離し、上清を50 mM炭酸水素アンモニウム中の0.1% RapiGest（186001860、Waters）50 µlと混合した。各サンプルの上清と沈殿物をドライアイスで急速凍結し、ワシントン大学のMacCoss研究室に一晩で輸送し、そこでLC-MS/MS用のサンプル調製を完了した。沈殿物を50 µlの0.1% RapiGestに再懸濁し、 50 mM炭酸水素アンモニウムを加え、水浴中で超音波処理を行った。沈殿物と上清のタンパク質濃度をBCAアッセイで測定し、サンプルを5 mMジチオスレイトール（DTT；Sigma）で還元し、15 mMヨードアセトアミド（Sigma）でアルキル化し、37℃で1時間インキュベートした（トリプシン処理：トリプシン：基質比1：0：50）。RapiGestは200 mM HClの添加により溶解し、続いて37℃で45分間インキュベートした後、4℃で14,000 rpmで10分間遠心分離してデブリを除去した。サンプルをデュアルモード固相抽出（Oasis MCXカートリッジ、Waters）で洗浄し、0.1%ギ酸に再懸濁して最終タンパク質濃度を0.33 µgとした。 µl-1。ラベルなしMAGプロテオームも同様に未経産男性から分析した。各サンプルについて2回の分析レプリケートを分析した。次に、各サンプル1µgを、Jupiter C12逆相樹脂（Phenomenex）を充填した4cmの溶融シリカKasil1（PQ）フリットトラップを備えた25cmの溶融シリカ75μmカラムと180分間の液体クロマトグラフィーを使用して分析した。サンプル消化物 – MS/MSは、nanoACQUITY UPLCシステム（Waters）を備えたQ-Exactive HF質量分析計（Thermo Fisher）で実行されました。各実行で生成されたデータ関連の取得データは、Proteowizard（バージョン3.0.20287）を使用してmzML形式に変換され、Comet31（バージョン3.2）を使用して、Anopheles gambiae（VectorBaseバージョン54）、Anopheles coluzziのタンパク質配列を含むFASTAデータベースに対して検索されました。検索は、Mali-NIH（VectorBaseバージョン54）、Saccharomyces cerevisiae（Uniprot、2021年3月）、A. gambiae RNA-seq、および既知のヒト汚染物質の3フレーム翻訳に対して実行されました。ペプチドマップにマッチしたFDRは、閾値0.01でPercolator32（バージョン3.05）を使用して決定され、ペプチドは、タンパク質最小法を使用してタンパク質同定に組み立てられました。 Limelight33（バージョン2.2.0）。相対的なタンパク質存在量は、前述のように各ランの各タンパク質について計算された正規化スペクトル存在量係数（NSAF）を使用して推定した。各タンパク質に対するNSAFは、2つの異なる生物学的複製からのサンプル間で平均化された。15N標識は雌のプロテオームをうまくマスキングしたが、標識された未経産から少量の非標識タンパク質が検出された。雌の生サンプルで雄のタンパク質減少（1～5スペクトル）が検出されたのは、HPLCの「キャリーオーバー」の結果として、生サンプルが雄/交配サンプルの後に実行された技術的実行のみであった。標識された未経産から「汚染物質」として見つかったタンパク質は、補足表1に記載されている。
Genscript社製の2つの抗原ペプチド、QTTDRVAPAPDQQQ（アイソタイプPA内）とMESDGTTPSGDSEQ（アイソタイプPAおよびPB内）を混合し、キャリアタンパク質KLHに結合させてニュージーランドウサギに注射した。ウサギは4回目の注射後に屠殺し、アフィニティー精製により総IgGを分離した。最もEPP特異性の高いウサギから得られたIgGを、その後のウェスタンブロッティングに使用した。
ウェスタンブロットでは、4日齢の未交尾オスと未交尾または強制交尾メス（交尾後10日未満）のMAG（n = 10、nは生物学的に独立した蚊のサンプル数を表す）とメスLRT（n = 30）を、タンパク質抽出バッファー（50 mM Tris、pH 8.0、1% NP-40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））を別々に加えた。サンプルは解剖後すぐにビーズホモジナイザー（2 mmガラスビーズ、2,400 rpm、90秒）で均質化した。不溶性残渣は4℃で20,000 gの遠心分離で除去した。タンパク質はBradfordアッセイ（Bio-Rad）で定量した。 LRTタンパク質と20 µgの残りのバルクタンパク質を変性させ、MOPSバッファーを用いて10% Bis-Tris NuPAGEで分離した。タンパク質はiBlot2転写システム（Thermo Fisher）を用いてポリフッ化ビニリデン膜に転写した。膜を1× PBS-T（PBS中の0.1% Tween-20）で2回洗浄し、Odysseyブロッキングバッファー（Li-Cor）で22℃で1時間ブロッキングした。膜をカスタムウサギ抗EPPポリクローナル一次抗体（ブロッキングバッファーで1:700）とラット抗アクチンモノクローナル一次抗体MAC237（Abeam; 1:4,000）と共に4℃で一晩振盪した。膜をPBS-Tで洗浄し、二次抗体（ロバ抗ウサギ800CWおよびヤギ抗ラット680LT（Li-Cor））と共にインキュベートした。 0.01% SDS と 0.2% Tween -20 を含むブロッキングバッファーで 1:20,000 に希釈し、22 °C で 1 時間インキュベートした。メンブレンを PBS-T で洗浄し、Odyssey CLx スキャナーで画像を取得した。画像は Image Studio (バージョン 5.2) で収集および処理した。EPP-RA アイソフォーム (82 kDa) に対応する特定のバンドは検出されなかった。
EPP（ヒスチジンホスファターゼドメインを含むアイソフォームAGAP002463-RB、NCBI保存ドメイン検索34）およびEcK2（AGAP002181）のコード領域をpET-21a(+)プラスミド（Novagen Millipore Sigma）にクローニングした。プライマーは拡張データ表2に記載されています。8つのGS4リンカー（タンデム）がpET-21a(+)-EcK2構築物のC末端6xHisタグの前に挿入されました。組換えタンパク質はNEBExpress無細胞大腸菌タンパク質合成反応（New England BioLabs）を使用して製造されました。組換えタンパク質はNEBExpress Niスピンカラム（New England BioLabs）を使用して精製されました。ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）コントロールタンパク質は、NEBExpress無細胞大腸菌タンパク質合成キットのDNAテンプレートを使用して製造されました。タンパク質は、PBS中の50%グリセロールで-20℃で最大3か月間保存されました。
EPPおよび組織抽出物のホスファターゼ活性は、4-ニトロフェニルリン酸（pNPP；Sigma-Aldrich）を用いて測定した。反応バッファーは、25 mM Tris、50 mM酢酸、25 mM Bis-Tris、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、および1 mM DTTを含んでいた。組織を反応バッファー中で均質化し、遠心分離によって細胞破片を除去した。2.5 mg ml-1 pNPPを含む反応バッファーに酵素または組織抽出物を加えて反応を開始した。反応混合物を暗所で室温にてインキュベートし、様々な時間で405 nmの吸光度を測定することにより、pNPPから変換されたpNPの量を定量した。
in vitro EcK 活性については、タンパク質を 0.2 mg の 20E または 3D20E とともに、10 mM HEPES–NaOH、0.1% BSA、2 mM ATP、および 10 mM MgCl2 を含む 200 µl の緩衝液 (pH 7.5) 中で 27 °C で 2 時間インキュベートした。反応は 800 µl のメタノールを加えることで停止し、その後 -20 °C で 1 時間冷却し、その後 4 °C で 20,000 g で 10 分間遠心分離した。上清を HPLC-MS/MS で分析した。コントロール群で使用したタンパク質を熱失活させるには、タンパク質を PBS 中の 50% グリセロール中で 95 °C で 20 分間インキュベートした。
in vitro EPP活性については、タンパク質を3D20E22P（HPLC-MS/MSで精製したMAG 18ペアに含まれる量に相当）とともに、25 mM Tris、50 mM酢酸、25 mM Bis-Tris、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、および1 mM DTTを含む100 µlの緩衝液（pH 7.5）中で27 °Cで3時間インキュベートした。反応は400 µlのメタノールを加えて停止し、-20 °Cで1時間冷却した後、4 °Cで20,000 gで10分間遠心分離した。上清をHPLC-MS/MSで分析した。
EPP（362 bp）、EcK1（AGAP004574、365 bp）、EcK2（556 bp）のPCR断片は、雌雄混合の頭部のない蚊の死骸から調製したcDNAから増幅した。eGFPコントロール（495 bp）のPCR断片は、以前に説明したpCR2.1-eGFPから増幅した。 PCRプライマーは拡張データ表2に記載されています。PCR断片はpL4440プラスミド上の逆向きT7プロモーター間に挿入されました。プラスミド構築物はNEB 5-αコンピテントE. coli（New England Biolabs）から回収され、使用前にDNAシーケンスによって検証されました（挿入配列については補足データ1を参照）。T7プロモーターに一致するプライマー（拡張データ表2）を使用して、pL4440ベースのプラスミドから挿入物を増幅しました。PCR産物のサイズはアガロースゲル電気泳動によって確認されました。dsRNAはMegascript T7 Transcription Kit（Thermo Fisher）を使用してPCRテンプレートから転写され、製造元の指示に従って、前述の変更を加えて精製されました。
dsRNA注射の場合、羽化後1日以内に、成虫の雄または雌の胸部に、1,380 ngのdsRNA（dsGFP、dsEcK1、dsEcK2、dsEPP）を10 ng nl-1の濃度で注射した（Nanoject III、Drummond）。遺伝子ノックダウンレベルは、RNA抽出、cDNA合成、およびRT-qPCRにより、少なくとも3つの生物学的複製で決定した。エクジソン注射の場合、4日齢の未交尾雌または6日齢の未交尾吸血雌に、実験計画に応じて、それぞれ1.3、2.1 ng nl-1または6.3 ng nl-1の濃度で、0.13、0.21、または0.63 µgの20Eまたは3D20E（Nanoject III、Drummond）を注射した。10% （体積/体積）エタノール水溶液；10%エタノール中の3D20E22P 100 nl（MAGペアに含まれる量の75%に相当）。蚊はランダムに注射群に割り当てられた。
産卵試験では、生後3日の雌に人間の血液を自由に摂取させた。部分的に吸血した蚊や吸血していない蚊は取り除いた。処理に応じて、雌は吸血後少なくとも48時間経過してから、4晩にわたって別々の産卵カップに入れられた。卵は実体顕微鏡（Stemi 508、Zeiss）で計数した。交尾した雌の場合、幼虫に孵化した卵は受精卵とみなした。
交配試験では、メスは処理に応じて少なくとも 2 日間交配に対する抵抗性を発達させ、その後、野生型の年齢を合わせたオスを同じケージに導入した。2 晩後、メスの受精卵を解剖し、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、および 25 mM NaCl (pH 8.2) を含む緩衝液中で凍結融解および超音波処理によりゲノム DNA を放出した。サンプルをプロテイナーゼ K (0.86 µg µl-1) とともに 55 °C で 15 分間、続いて 95 °C で 10 分間インキュベートした。粗ゲノム DNA 調製物を 10 倍に希釈し、qPCR により Y 染色体配列を検出した。プライマーは拡張データ表 2 に記載されている。Y 染色体配列がない場合は、交配がなかったことを示す。
再交配アッセイでは、強制交配した雌を交配栓の有無を調べて交配状態を確認し、雄がいない状態で2日間交配不応性を発現させた（既述36）。次に、DsRed遺伝子導入精子を持つ雄を雌のケージに導入した。2晩後、雌から受精嚢を解剖し、上記のようにゲノムDNAを調製して、qPCR法でDsRed遺伝子を検出した。プライマーは拡張データ表2に記載されている。DsRed遺伝子が存在しないことは、再交配が起こらなかったことを示している。
3D20Eは、既報37に従って合成した。簡単に説明すると、10 mgの20E（Sigma-Aldrich）を10 mlの水に溶解し、続いて30 mgの白金黒（粉末状、Sigma-Aldrich）を加えた。室温で撹拌しながら、反応混合物に穏やかなO2の流れを連続的にバブリングした。6時間後、反応を停止するために30 mLのメタノールを加えた。混合物を遠心分離して触媒粒子を除去した。上澄み液を室温で真空下で乾固させた。乾燥した反応生成物を10%エタノールとメタノールに溶解し、HPLC-MS/MS分析に注入した。変換率（20Eから3D20Eへ）は約97%（図4b）であり、合成した3D20EのMSスペクトルは交尾した雌で見つかったものと一致した（図4c）。
凡例には、実行された統計的検定の詳細が記載されています。GraphPad (バージョン 9.0) を使用して、Fisher の正確検定、Mantel-Cox 検定、および Student の t 検定を実行しました。Cochran-Mantel-Haenszel 検定は、カスタム R スクリプト (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test で入手可能) を使用して実行しました。データの分布は、有意水準 0.05 で Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性の検定を行いました。データが正規性検定に不合格だった場合、Mann-Whitney 検定を実行しました。生存データは、Mantel-Cox 検定を使用して分析しました。DESeq2 パッケージ (バージョン 1.28.1) を使用して、RNA-seq 遺伝子レベルの差次的発現分析を実行しました。グラフの横棒は中央値を表します。すべての検定の閾値として、有意水準 P = 0.05 を使用しました。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされているNature Research Reportの要約を参照してください。
MSプロテオミクスデータは、データセット識別子PXD032157で、PRIDEパートナーリポジトリ（https://www.ebi.ac.uk/pride/）を介してProteomeXchangeコンソーシアム（http://proteomecentral.proteomexchange.org）に登録されました。
RNA-seqデータセットは、Gene Expression Comprehensive Library（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）にシリアルレコードGSE198665として登録されています。
本研究中に生成および/または分析された追加のデータセットは、合理的な要請があれば、責任著者から入手できます。この記事は、そのソースデータを提供します。
De Loof, A. エクジステロイド：見過ごされてきた昆虫の性ステロイド？オス：ブラックボックス。Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-ヒドロキシエクジソンとAnopheles stephensの卵巣発達。J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).
投稿日時：2022年7月8日