Nature.com にアクセスいただきありがとうございます。ご利用のブラウザ バージョンでは、CSS のサポートが制限されています。最適なエクスペリエンスを得るには、更新されたブラウザを使用する (または Internet Explorer の互換モードをオフにする) ことをお勧めします。その間、継続的なサポートを確保するため、スタイルと JavaScript なしでサイトを表示します。
脊椎動物とは異なり、昆虫は雄に偏った性ステロイドホルモンを持たないと広く考えられています。ハマダラカ（Anopheles gambiae）では、エクジソンステロイドである20-ヒドロキシエクジソン（20E）は、雌によって合成されると卵の発達を制御し、雄によって性的に伝播されると交尾不応期を誘発するように進化したようです3。卵の発達と交尾は重要な生殖形質であるため、メスのハマダラカがこれらのホルモンシグナルをどのように統合するかを理解することは、新しいマラリア制御プログラムの設計を促進する可能性があります。本研究では、これらの生殖機能が、エクジステロイド活性化/不活性化酵素の複雑なネットワークを介して、異なる性ステロイドによって制御されていることを明らかにしました。私たちは、雄に特異的な酸化エクジソンである3-デヒドロ-20E（3D20E）を同定しました。これは、性的に伝播し、脱リン酸化によって活性化された後に雌の性的受容性をシャットダウンすることで親子関係を保護します。注目すべきことに、3D20Eの伝播はまたマラリア原虫感染中に卵の発達を維持する生殖遺伝子の発現を誘導し、感染した雌の健康を確保します。雌由来の 20E は性的反応を引き起こさないものの、20E 阻害キナーゼが阻害された後、交尾中の個体が卵を産むことを可能にします。この雄特異的昆虫ステロイドホルモンの特定と、雌の性的受容性、生殖能力、およびマラリア原虫との相互作用の調節におけるその役割は、マラリアを媒介する蚊の生殖成功率を低下させる可能性を示唆しています。
マラリアの症例数と死亡者数は、ヒトのマラリア原虫の唯一の媒介者であるハマダラカの殺虫剤耐性が広まっているために、再び増加しています4。これらの蚊の交尾生物学は、メスが一度しか交尾しないため5、新しいマラリア制御介入の特に魅力的なターゲットです。この1回の交尾を不妊にすることで、現場での蚊の個体数を大幅に減らすことができます。
女性は男性から高力価のステロイドホルモンを投与されると性的に無力になる。研究によると、交尾が困難になるきっかけは、幼虫期の脱皮周期の調節因子としてよく知られているステロイドホルモンである20-ヒドロキシエクジソン（20E）である。雄が20Eを合成して輸送する能力は、アフリカに分布し、マラリアの最も危険な媒介動物であるハマダラカ（Anopheles gambiae）を含むCellia7亜属に属するハマダラカ属で特に進化した。これらの種では、雌も吸血のたびに20Eを生成し、20Eが卵形成周期を駆動するため、これは特に注目に値する（文献8を参照）。しかし、雌が自身の交尾能力を損なうことなく、エクジソンの2つの異なる供給源（雄への輸送と吸血誘導）からの信号を統合する方法についてはほとんどわかっていない。実際、雌が生成した20Eが性的不耐性により、処女吸血個体の​​不妊症につながるが、これはこれらの蚊に非常によく見られる行動である5。
考えられる説明としては、A. gambiae のオスが改変されたオス特有のエクジソンを伝達し、それがメスの生殖管でシグナル伝達カスケードを活性化し、交尾の不安定性を引き起こすというものです。しかし、脊椎動物にはエストロゲンやアンドロゲンなど複数のステロイドホルモンがありますが (文献 9 でレビューされています)、私たちの知る限り、昆虫ではアンドロゲンに偏ったステロイドは確認されていません。
性的に成熟したA. gambiaeの雄の付属腺（MAG）におけるステロイドホルモンのレパートリーを特定し、修飾ステロイドの可能性を探りました。以前に使用された特異性の低い方法ではなく、タンデム質量分析法と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（HPLC-MS/MS）を使用して、この組織でエクジソン（E）と20Eを検出し、以前の結果を確認しました。しかし、サンプルは、化学式3-デヒドロ-20E-22-リン酸（3D20E22P）12に一致する酸化リン酸化ステロイドが大部分を占めていました（図1）。他の形態には、3-デヒドロ-20E（3D20E）と20E-22-リン酸（20E22P）があります。3D20E22PのHPLC-MS/MS信号強度は、脱リン酸化形態の3D20Eよりも2桁高く、Eと3桁高かったです。 20E（図1）。体の他の部分や下部生殖器官（LRT、拡張データ図1a）には存在するが。また、排卵直後（1日齢未満）の雄と雌のエクジステロイドを分析し、MAGでのみ3D20Eと3D20E22Pを検出した。E、20E、20E22Pは雌雄ともに存在していた（拡張データ図1b）。これらのデータは、A. gambiaeの成虫の雄が、雌では合成されない修飾ホルモンをMAGで高力価で産生することを示唆している。
MAG および雌の LRT (心房、精嚢、および卵巣周囲腔を含む) を、生後 4 日目の処女雄および処女および交尾済みの雌 (0.5、3、および 12 hpm) から切り離しました。これらの組織のエクジソンを HPLC-MS/MS で分析しました (平均 ± sem、対応のない t 検定、両側、偽発見率 (FDR) 補正済み、NS、有意差なし、*P < 0.05、**P < 0.01。3D20E: 3 時間 vs. 0.5 時間、P = 0.035、12 時間 vs. 3 時間、P = 0.0015、12 時間 vs. 0.5 時間、P = 0.030。3D20E22P: 3 時間 vs. 0.5 時間、P = 0.25、 3 時間、P = 0.0032、12 時間 vs. 0.5 時間、P = 0.015)。データは 3 回の生物学的反復から取得されています。対象となる各エクジソンのピーク領域が計算され、蚊の数で正規化されました。エクジソンは次のように色で表されます: E、緑、20E、オレンジ、20E22P、紫、3D20E、青、3D20E22P、ピンク。インセットでは、y 軸のスケールが拡大され、より低いエクジソン レベルが示されています。
3D20E22P と 3D20E が交尾中に伝達されるかどうかを調べるために、交尾後のさまざまな時点で雌の LRT を解剖しました。処女ではエクジソンは検出されませんでしたが、交尾直後 (交尾後 0.5 時間、hpm) の LRT には相当量の 3D20E22P が存在し、時間の経過とともに減少しましたが、3D20E のレベルは大幅に増加しました (図 1)。化学的に合成した 3D20E を標準として使用し、交尾中の LRT におけるこのステロイド ホルモンのレベルは 20E よりも少なくとも 100 倍高いことを測定しました (拡張データ表 1)。したがって、3D20E22P は交尾中に雌の LRT に伝達される主要な雄のエクジソンであり、その脱リン酸化型である 3D20E は交尾後まもなく非常に豊富になります。
新しいRNAシーケンス（RNA-seq）データセット（図2a）を生成した後、カスタム構築されたバイオインフォマティクスパイプラインを使用して、エクジソンキナーゼ（EcK）、エクジソンオキシダーゼ（EO）、およびエクジソンをコードする20E修飾ホスファターゼ遺伝子を検索しました。EPP）は生殖組織で発現しています。1つの候補EPP遺伝子と2つの潜在的なEcK遺伝子（EcK1とEcK2）を特定しましたが、適切な候補EO遺伝子は見つかりませんでした。注目すべきことに、個々のEPP遺伝子はガンビアMAGで高レベル（98.9パーセンタイル）で発現しましたが、メスのLRTでは発現していませんでした（図2b）。これは、このメスの組織で3D20E22Pの脱リン酸化が起こったため、予想に反しています。したがって、オスのEPPは交配中に伝達される可能性があると考えています。実際、交配後にメスのタンパク質をマスクするためにin vivo安定同位体標識を使用しました。 MSにより雌心房中に同定された酵素（図2cおよび補足表1）。MAGおよび交配した（処女ではない）雌LRTにおけるEPPの存在も、特異的抗体を使用して確認された（図2d）。
a、それぞれの性別の生殖組織で EcK、EO、EPP をコードする遺伝子を検索するためのカスタム構築されたバイオインフォマティクス パイプライン。矢印の横の数字は、各ステップでのオスとメスの候補の数を示します。この解析により、オスで発現する EPP 遺伝子 (EPP) と EcK 遺伝子 (EcK1) を 1 つずつ、また、両方の性別で発現するが候補の EO 遺伝子は生成しない EcK 遺伝子 (EcK2) を 1 つ特定しました。b、処女 (V) および交尾中 (M) の Anopheles gambiae と Anopheles albicans の組織における候補遺伝子の発現を比較したヒートマップ。Spca、受精、MAG、オスの付属腺。体の他の部分、すなわち男女ともに乳房、羽、脚、脂肪体、内臓、および雌では卵巣に発現している。ガンビアでは、EcK2 は MAG と心房の両方で高度に発現しているが、EPP は MAG にのみ存在する。c、交尾後 3、12、24 hpm における雄の射精液グループの雌心房への転座のプロテオーム解析により、最も豊富な 67 種類のタンパク質が示されている。雌は、すべてのタンパク質を標識（およびマスク）するために、15N​​ を含む飼料で飼育された。タグなしの雄はタグ付き雌と交配され、雌の LRT は交尾後 3、12、24 hpm で解剖され、プロテオーム解析が行われた（射精タンパク質の完全なリストについては、補足表 1 を参照）。挿入図、これらの組織のプロテオーム解析により、処女雄の MAG で EPP、Eck1、および EcK2 が検出されしかし、処女の雌や雄、または雌の体の残りの部分では見られませんでした。膜は、抗アクチン（ローディングコントロール）抗体と抗EPP抗体で同時に調べられました。雄はすべて処女です。ゲルソースデータについては、補足図1を参照してください。ウェスタンブロットを2回実行し、同様の結果が得られました。
EPP のエクジステロイド ホスホホスファターゼ活性は、MAG から単離された 3D20E22P と共に HPLC-MS/MS でインキュベートした後に検証されました (拡張データ図 2a)。さらに、RNA 介在干渉 (RNAi) によって EPP をサイレンシングすると、これらの雄の生殖組織でホスファターゼ活性の大幅な低下が検出され (図 3a)、EPP サイレンシングされた雄と交配した雌は、部分的な遺伝子サイレンシングにもかかわらず、脱リン酸化 3D20E の割合が有意に低下しました (図 3b) (拡張データ図 2b、c)。対照的に、同じ蚊の 20E22P/20E 比に大きな変化は検出されなかったため、この酵素は 3D20E22P に特異的である可能性があります (図 3b)。
a、二本鎖 EPP RNA (dsEPP) または二本鎖 GFP RNA (dsGFP) コントロールを使用した EPP サイレンシングによって減少した MAG のホスファターゼ活性。各反復では 20 個の MAG プールが使用され (P = 0.0046、対応のある t 検定、両側)、別々のドットで表されています。b、EPP サイレンシングされた雄と交配した雌は、3 hpm で脱リン酸化 3D20E の割合が有意に低かった (P = 0.0043、非対応の t 検定、両側) 一方、20E レベルは影響を受けませんでした (P = 0.063、非対応)。データは、それぞれ 13、16、19 匹のメスからなる 3 つのプールからの平均 ± 標準誤差として提示されています。c、EPP サイレンシングされたオスと交配したメスは、再交配率が有意に高くなりました (P = 0.0002、Fisher の正確検定、両側)。メスは、交配状態を確実にするために、最初に交配を強制されました。 2 日後、それらをトランスジェニック精子を持つ他の雄と接触させ、トランスジェニックの定量的 PCR 検出によって再交配率を評価しました。d、EPP サイレンシングされた雄と交配した血液を摂取した雌は、繁殖力が著しく低下し (P < 0.0001、Mann-Whitney 検定、両側)、卵数がわずかに減少しました (P = 0.088、Mann-Whitney 検定、両側)。ただし、産卵率は影響を受けませんでした (P = 0.94、Fisher の正確検定、両側)。すべてのパネルで、n は生物学的に独立した蚊のサンプル数を表します。NS、有意ではありません。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.001。
次に、エクジソンの脱リン酸化がメスの交配抵抗性の誘導に重要であるかどうかを評価しました。特に、EPPを枯渇させたオスと交配したメスは、追加の（トランスジェニック）オスにさらされた場合、対照メス（10.4％）よりもはるかに高い頻度（44.9％）で再交配しました（図3c）。また、繁殖力の有意な低下（図3d、左）とこれらのメスによって産まれた卵数のわずかな減少（図3d、中央）を観察しましたが、メスによって産まれた卵の割合（交配によってメスに誘発される別の反応）は影響を受けませんでした（図3d、右）。3D20E22Pに対するEPPの特異性が観察されたことを考慮すると、これらの結果は、交配中に移行したEPPによる3D20Eの活性化が、メスのさらなる交配に対する受容性をオフにする上で重要な役割を果たしている可能性があることを示唆しています。この行動は、以前は20Eの性的移行に起因すると考えられていました。そのため、この男性特有のホルモンは女性の生殖能力にも大きな影響を与えます。
次に、化学的に合成した 3D20E (図 4a ～ c​​) と市販の 20E を使用して、性的に成熟した処女における注射実験で 20E と 3D20E の活性を比較しました。両濃度において、3D20E は 20E よりもメスの交尾に対する感受性を遮断するのに有意に効果的であることが観察されました (図 4d)。特に、LRT における 3D20E の生理学的レベルの半分 (注射後 1,066 pg 対交尾後 2,022 pg) では、注射から 24 時間後に、最高濃度である交尾後 18 pg での 20E の生理学的レベル (注射後 361 pg) の 20 倍の不応性メスの割合が誘発されました。この結果は、20Eの性交渉が交尾不応期を引き起こさないという考えと一致しており、さらに、3D20Eが親子関係を確保する主な要因であることを示しています。3D20Eは、処女の雌の産卵アッセイでも20Eよりも有意に活性が高く（図4e）、部分的なEPPサイレンシング後に観察された正常な産卵率は、交尾によって誘発された雌の要因によって依然として生成される残留3D20E活性の存在によるものであることを示唆しています。
(a,b) 3D20E は (a) 20E から非常に高い変換/効率で化学的に合成されました (データは 3 つの独立した合成反応から得た平均値 ± 標準誤差として提示) (b)。c、質量スペクトル (下半分) は、交尾した雌の LRT (上半分) で見つかったエクジソンと正確に一致します。d、20E (0.63 µg、P = 0.02、0.21 µg、P < 0.0001、フィッシャーの正確検定、両側) および 10% エタノール (0.63 µg、P < 0.0001、0.21 µg、P < 0.0001、フィッシャーの正確検定、両側) と比較したところ、20E は、より高い用量でのみコントロールよりも有意に高くなりました (0.63 µg、P = 0.0002、0.21 µg、P = 0.54)。フィッシャーの正確検定、両側）。e、3D20Eの注射は、処女雌において、10%エタノール対照群と比較して有意に高い産卵率を誘発した（0.21 µg、P < 0.0001; 0.13 µg、P = 0.0003; フィッシャーの正確検定、両側）。一方、20Eは対照群と比較して、より高い用量でのみ産卵率を誘発した（0.21 µg、P = 0.022; 0.13 µg、P = 0.0823; フィッシャーの正確検定、両側）。3D20Eは、より高い用量で、20Eよりも有意に高い産卵率を誘発した（0.21 µg、P = 0.0019; 0.13 µg、P = 0.075; フィッシャーの正確検定、両側）。すべてのパネルにおいて、nは生物学的に独立した蚊のサンプル数を表す。NS、有意。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.001。データは3回の反復から得られたものです。
これまでの研究で、ステロイドホルモンの性的伝播がMISO（交配誘導卵形成刺激因子11）の発現を誘導することを明らかにしました。MISOは、アフリカハマダラカ（Anopheles）の雌を熱帯マラリア原虫（Plasmodium falciparum）感染から守る雌生殖遺伝子です。マラリア流行地域におけるハマダラカの生殖適応度にとってMISOが重要であることから、3D20Eと20Eのどちらのホルモンがこの遺伝子の発現を誘発するかを判定することにしました。20Eの注射は、HR3やHR4などの核ホルモン受容体（HR）や、卵黄形成遺伝子Vg14、15、16などの典型的な下流ステロイド標的を特異的に、またはより強力に誘導しましたが、MISOは3D20Eによってより強く誘導されました（拡張データ図3）。したがって、このアンドロゲンステロイドホルモンの性的伝播は、寄生虫感染による被害から雌を守るメカニズムを誘導します。さらに、3D20E は E 受容体 EcR の両方のアイソフォームに異なる影響を与え、EcR-A を誘導して EcR-B を抑制し、雌の生殖能力に影響を与える HPX15 などの他の交配誘導遺伝子をより強く誘発します。これは、EPP をサイレンシングした雄と交配した雌で観察される顕著な不妊症を説明できる可能性があります (拡張データ図 3)。これらのデータは、性別に特有の機能の基礎となる可能性のある 2 つのエクジソン ホルモンによって優先的に活性化される下流経路の存在を示唆しています。
次に、バイオインフォマティクス パイプラインで特定された 2 つの EcK 遺伝子の機能をテストしました。EcK1 または EcK2 をサイレンシングすると、オスで有意な死亡率が得られました (拡張データ図 4a)。これは、エクジソンのリン酸化、ひいては不活性化が生存に重要であることを示唆しています。EcK2 は EcK1 よりも高いレベルで発現し、プロテオミクスによって MAG で検出されたため (図 2b、c、補足表 2)、20E と一緒にインキュベートしてエクジステロイド キナーゼ活性を検証し、20E22P のリン酸化をもたらしました (拡張データ図 2)。4b)。3D20E を基質として使用した場合、リン酸化産物 3D20E22P を検出できませんでした (拡張データ図 4c)。これは、3D20E よりも 20E が EcK2 の優先ターゲットである可能性を示唆しています。
RNA-seq解析によると、EcK2は処女雌のLRTでも高発現していたが、交尾後には発現がオフになった（図2b）。これらのデータを確認し、EcK2発現は吸血の影響を受けないことを決定した（拡張データ図5a）。最初のMS実験を拡張して、20E22Pのピークは20Eのピーク（吸血後22～26時間；拡張データ図5b）と密接に関連していることを決定した。処女雌におけるEcK2のサイレンシングは、吸血後26時間で20Eと20E22Pの相対比が3倍に増加したことをもたらし（拡張データ図2cおよび5c）、EcK2が雌の20Eもリン酸化することを確認。注目すべきことに、EcK2を枯渇させた処女は完全な性的受容性を維持した（拡張データ図5d、e）。これは、雌による20Eの産生が交尾不応期を誘発しない。しかし、これらの雌は対照群と比較して産卵率が有意に増加し、処女個体の30%以上が産卵した（拡張データ図5f）。二本鎖Eck2 RNA（dsEcK2）を吸血後に注入した場合、産卵は起こらず、その時点で吸血による20Eのピークは減少していた。全体として、これらの結果は、吸血後に生成された20Eが産卵を誘発できるが、産卵阻害（EcK2およびおそらく他の因子）が交尾によって解除された場合にのみ誘発するというモデルを支持する。20Eおよび3D20Eの注入は処女個体のEcK2発現を阻害しなかった（拡張データ図5g）。これは、他の因子がこのキナーゼの阻害を媒介していることを示唆している。しかし、吸血後の20Eレベルは交尾不快感を誘発するのに十分ではなかったが、性的に伝達された高力価の3D20E。
我々の研究結果は、A. gambiaeの繁殖成功を制御するメカニズムに関する重要な知見を提供する。雄が3D20Eを高力価で合成するように進化したというモデルが出現した。3D20Eは雄特異的な修飾エクジソンであり、雌を交尾に対して鈍感にすることで親子関係を保証する。同時に、これらのマラリア媒介昆虫は、雄特異的EPPの性的伝達に反応して雌の3D20Eを活性化する効率的なシステムも進化させた。我々の知る限り、これは昆虫において雄と雌が優位なステロイドホルモン系が独特かつ重要な機能を果たした初めての例である。雄特異的エクジソンの機能は仮説として提唱されてきたが、決定的に実証されたわけではない。例えば、これらの機能は20Eの前駆体であるE1によって担われているという仮説は、ほぼ反証されている。ショウジョウバエでは、一夫一婦制は、雄と雌の生殖細胞に相互作用する小さな性ペプチド19,20の性的伝達によって引き起こされることがよく知られている。特定の性ペプチド受容体21,22を介して雌の生殖管を支配するニューロン。A. gambiae の雌で 3D20E によって制御される下流シグナル伝達カスケードを特定し、これらのカスケードが蚊とショウジョウバエの間で保存されるかどうかを決定するには、さらなる研究が必要です。
本研究で明らかにされた雌の繁殖力と行動における3D20Eの重要な役割を考えると、3D20Eの合成と活性化につながる経路は、不妊昆虫技術戦略における競争力のある不妊雄の生成など、将来の蚊の制御戦略に新たな機会を提供します。野生への放出に使用したり、処女プレイで3D20Eを模倣したりするために使用します。3D20Eの雄特有の機能は、A. gambiaeや他のCellia種が精液を交尾栓に凝固させる能力を獲得したときに進化した可能性があります。これにより、大量のホルモンとホルモン活性化酵素を効率的に移動できます。次に、一夫一婦制を実現する3D20Eの進化は、（MISOの高発現を通じて）雌がマラリアの蔓延地域で生殖適応度を優先するメカニズムを提供し、間接的にマラリア原虫の伝播に寄与します。雌の20Eが熱帯地域での熱帯マラリア原虫の生存と成長に大きな影響を与えることが示されていることを考えると、メスのハマダラカ24 では、オスとメスの両方のステロイドホルモン経路が、蚊と寄生虫の相互作用の重要な側面となっています。
A. gambiae G3株は、標準的な昆虫環境（26～28℃、相対湿度65～80%、12:12時間の明期/暗期）下で飼育されました。幼虫には粉末状の魚の餌（TetraMin Tropical Flakes、Koi Pellets、Tetra Pond Sticksを7:7:2の比率で）を与えました。成虫には10%デキストロース溶液と毎週のヒト血液（研究用血液成分）を自由に摂取させました。蛹の段階で末端を顕微鏡で検査した後、雌雄を分けて処女蚊を入手しました。DsRedトランスジーンを持つ雄については、以前に報告されています。
強制交配実験は、以前に記載されたプロトコルに従って実施しました。自然交配では、4日齢の処女雌を性成熟した処女雄と1:3の比率で2晩飼育しました。雄にdsEPPを注射する実験では、ホスファターゼ活性が最大限に抑制された注射後3～4日目に共ケージ化が行われました（拡張データ図2b）。
蚊の組織、残りの死体 (体の残りの部分)、または全身を 100% メタノールに切り込み、ビーダー (2 mm ガラス ビーズ、2,400 rpm、90 秒) でホモジェナイズしました。組織の量とメタノールの容量は次のとおりです: 体の残りの部分、50 個を 1,000 µl 中、MAG、50～100 個を 80 µl 中、メスの LRT、25～50 個を 80 µl 中。沈殿物を同容量のメタノールで 2 回目のメタノール抽出にかけました。細胞残骸は遠心分離で除去しました。両方の抽出物から得たメタノールを合わせて窒素気流下で乾燥させた後、次の容量の 80% メタノール水溶液に再懸濁しました: 体の残りの部分、50 µl
サンプルは、LC 機器 (Vanquish、Thermo Fisher) に接続された質量分析計 (ID-X、Thermo Fisher) で分析されました。5 µl のサンプルを、25 °C に維持された 3 µm、100 × 4.6 mm カラム (Inspire C8、Dikma) に注入しました。LC の移動相は、A (水、0.1% ギ酸) と B (アセトニトリル、0.1% ギ酸) でした。LC グラジエントは次のとおりでした: 1 分間 5% B、その後 11 分かけて 100% B まで増加しました。100% で 8 分後、5% B で 4 分間カラムを再平衡化しました。流量は 0.3 ml min-1 でした。MS ソースでのイオン化は、正および負のモードで加熱されたエレクトロスプレー イオン化によって行われます。
質量分析計は、フルMSモードで60,000の分解能で350から680のm/z範囲でデータを測定します。MS/MSデータは、[M + H]+（すべてのターゲット）、[M - H2O + H]+（すべてのターゲット）、および[M - H]-（リン酸化ターゲット）で取得されました。MS/MSデータは、標準が利用できないターゲットのエクジソン特性を確認するために使用されました。非ターゲットエクジステロイドを識別するために、相対存在量が15％を超えるすべてのHPLCピークのMS/MSデータを分析しました。純粋な標準（20E、3D20E）から作成された標準曲線を使用して定量し、1つの特定のサンプル（他のすべてのターゲット）の絶対量または希釈度を計算して、1人の男性で見つかった量との当量を計算します。3D20Eの場合、定量は、次の付加物の合計を使用して実行されました：[M + TFA]-、[M + COOH]-、[M + Na]+、[M + Cl]-、 [M + NO3]-。データはTracefinder（バージョン4.1）を使用して抽出および定量化されました。MS/MSデータはXcalibur（バージョン4.4）を使用して分析されました。E、20E、3D20EのMSスペクトルをそれぞれの標準と比較しました。3D20E22Pはジラール試薬による誘導体化によって分析されました。20E22Pはm/z比によって分析されました。
3D20E22PはMAGから精製されました。精製は、HPLC-MS/MS分析と同じLC条件下で、四重極質量ベース検出器（QDa、Acquity、Waters）を備えた超高性能液体クロマトグラフ（Acquity、Waters）を使用して分析規模で実行されました。以前に決定されたのと同じ保持時間で3D20E22Pに対応するm/zが検出されたときに、フラクションコレクションがトリガーされました。その後、抽出された化合物の純度は、上記のようにHPLC-MS/MSによって確認されました。
製造元の指示に従って、TRI試薬（Thermo Fisher）を使用して、10～12個の生殖組織または体の他の部分（頭部なし）から全RNAを抽出しました。RNAはTURBO DNase（Thermo Fisher）で処理しました。cDNAは、製造元の指示に従って、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（M-MLV RT、Thermo Fisher）を使用して合成しました。逆転写定量PCR（RT-qPCR、Extended Data Table 2）用のプライマーは、以前に公開24されているか、Primer-BLAST26を使用して設計されており、70～150 bpのサイズでエクソン間ジャンクションにまたがる、またはプライマーペアプライマーがエクソンを分離する産物が優先されました。3～4回の生物学的反復からのcDNAサンプルは、RT-qPCR用に水で4倍に希釈されました。定量は、1× PowerUp SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher）、プライマー、および5 µlの希釈液を含む15 µlの反復反応で実施しました。 cDNA。反応はQuantStudio 6 ProリアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher）で実行され、データはDesign and Analysis（バージョン2.4.3）を使用して収集および分析されました。この研究で実証されているように、相対量はリボソーム遺伝子RpL19（AGAP004422）に対して標準化されており、その発現は吸血27または交配3によって大幅に変化しませんでした。
RNA の品質は、Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) を使用して確認しました。Illumina ペアエンドライブラリを準備し、MIT とハーバードのブロード研究所で実行しました。シーケンスリードは、HISAT2 (バージョン 2.0.5) をデフォルトパラメータで使用して A. gambiae ゲノム (PEST 株、バージョン 4.12) にアラインメントしました。マッピング品質 (MAPQ) スコアが 30 未満のリードは、Samtools (バージョン 1.3.1) を使用して削除しました。遺伝子にマップされたリードの数は、htseq-count (バージョン 0.9.1) をデフォルトパラメータで使用してカウントしました。正規化されたリード数を計算し、R (バージョン 4.0.3) の DESeq2 パッケージ (バージョン 1.28.1) を使用して差次的遺伝子発現を分析しました。
エクジソン修飾遺伝子候補は、まず PSI-BLAST アルゴリズム (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) を使用して A. gambiae ゲノムを検索し、次のクエリ タンパク質配列を持つデフォルト値パラメータを使用することで特定されました: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1)、Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1、XP_005175332.1、および XP_011294434.1)、および Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1、および XP_008552645.1) からの EcK、B. mori (Accession No. NP_001036900)、Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202)、Apis mellifera (Accession No. XP_394838)、Acyrthosiphon pisum (Accession No. XP_001947166)、B. mori の EPP (Accession No. XP_001947166)、NP_001177919.1 および NP_001243996.1)、および D. melanogaster の EO (Accession No. NP_572986.1) (ステップ 1)。次に、ガンビアの生殖組織 (雌の LRT または MAG) における高 mRNA 発現 (百万マップ リードあたり > 100 フラグメント/キロベース エクソン (FPKM) または > 85%) に基づいてヒットをフィルターします (ステップ 2)。特異性を向上させるために、交尾中にエクジソンを合成または伝達しないハマダラカ属の A. albimanus の生殖組織でも発現している候補酵素を選択しました。候補遺伝子は、A. albimanus 生殖組織での発現が低いこと (<100 FPKM または <85 パーセンタイル) に基づいてフィルタリングされました (ステップ 3)。最終フィルター (ステップ 4) として、候補遺伝子は、(1) 差次的発現遺伝子の分析によると交尾後に大幅にアップレギュレーションされる (P < 0.05)、および (2) 非生殖組織で発現する (< 85 % または <100 FPKM)、少なくとも次のいずれかを満たす必要があります。
我々は、以前に記載された方法28、29、30を修正して、生物全体の同位体標識を達成しました。簡単に言うと、野生型のSaccharomyces cerevisiaeタイプII（YSC2、Sigma）を、2％グルコース（G7528、Sigma）、1.7％アミノ酸フリー、および硫酸アンモニウム（wt/vol）を含む酵母窒素ベース（BD Difco、DF0335）でテストしました。培養培地)と5% 15N硫酸アンモニウム(NLM-713、>99%、Cambridge Isotope Laboratories)を唯一の窒素源として添加した。酵母は遠心分離により回収し、蚊の幼虫には蛹化まで自由に給餌した。第4齢期の死亡を防ぐため、魚粉(幼虫300匹あたり0.5 mg)を補充した。その後、交配中に伝達された雄のタンパク質を分析するために、雌のみを標識されていない雄との交配実験に使用した。
4～6日齢の15Nタグ付き処女雌を、同年齢のタグなし処女雄と交尾させました。交尾の成功は、落射蛍光顕微鏡下で交尾プラグを検出することによって確認しました。交尾後3、12、24時間で、45～55匹の交尾雌の心房を50μlの重炭酸アンモニウム緩衝液（pH 7.8）に切り込み、乳棒でホモジナイズしました。ホモジネートを遠心分離し、上清を50mM重炭酸アンモニウム中の0.1% RapiGest（186001860、Waters）50μlと混合しました。各サンプルの上清とペレットをドライアイスで急速凍結し、LC-MS/MS用のサンプル調製が行われたワシントン大学のMacCoss研究室に一晩送りました。ペレットを50μlの0.1% RapiGestを50 mMの重炭酸アンモニウムに溶解し、水浴中で超音波処理した。ペレットと上清のタンパク質濃度をBCAアッセイで測定した。サンプルは5 mMジチオトレイトール（DTT、Sigma）で還元し、15 mMヨードアセトアミド（Sigma）でアルキル化し、37 °C（1:0 50）で1時間インキュベートした。トリプシン処理：トリプシン：基質比）。RapiGestは200 mM HClを加えて溶解し、37 °Cで45分間インキュベートした後、4 °Cで10分間、14,000 rpmで遠心分離してデブリを除去した。サンプルはデュアルモード固相抽出（Oasis MCXカートリッジ、Waters）で洗浄し、0.1%ギ酸に再懸濁して最終タンパク質濃度を0.33 µgにした。未標識MAGプロテオームを処女雄から同様に分析しました。各サンプルについて2回の分析を反復しました。次に、各1 µgを、Jupiter C12逆相樹脂（Phenomenex）を充填した4 cmフューズドシリカKasil1（PQ）フリットトラップを備えた25 cmフューズドシリカ75 μmカラムと180分間の液体クロマトグラフィーを使用して分析しました。サンプル消化物 - MS/MSは、Q-Exactive HF質量分析計（Thermo Fisher）とnanoACQUITY UPLCシステム（Waters）を使用して実行されました。各実行で生成されたデータ関連の取得データは、Proteowizard（バージョン3.0.20287）を使用してmzML形式に変換され、Comet31（バージョン3.2）を使用して、Anopheles gambiae（VectorBaseバージョン54）、Anopheles coluzziのタンパ​​ク質配列を含むFASTAデータベースに対して検索が実行されました。Mali-NIH（VectorBaseバージョン54）、Saccharomyces cerevisiae（Uniprot、2021年3月）、A. gambiae RNA-seq、および既知のヒト汚染物質の3フレーム翻訳で検索が実行されました。ペプチドマップマッチングFDRは、閾値0.01でPercolator32（バージョン3.05）を使用して決定され、ペプチドはタンパク質節約法を使用してタンパク質同定に組み立てられました。 Limelight33（バージョン 2.2.0）。前述のように、各実行で各タンパク質について計算された正規化スペクトル存在係数（NSAF）を使用して、相対的なタンパク質存在量を推定しました。各タンパク質に対する NSAF は、2 つの異なる生物学的複製からのサンプル全体で平均化されました。15N 標識付けにより、雌のプロテオームはうまくマスクされましたが、標識付けされた処女サンプルからは少量の非標識タンパク質が検出されました。HPLC の「キャリーオーバー」の結果として、生のサンプルが雄/交配サンプルの後に実行された技術的な実行でのみ、雌の生のサンプルで雄のタンパク質の減少（1-5 スペクトル）の検出を記録しました。標識付けされた処女サンプルから「汚染物質」として時々見つかるタンパク質は、補足表 1 にリストされています。
Genscript には 2 つの抗原ペプチド、QTTDRVAPAPDQQQ (アイソタイプ PA 内) と MESDGTTPSGDSEQ (アイソタイプ PA と PB 内) があります。この 2 つのペプチドを結合し、キャリア タンパク質 KLH に結合させて、ニュージーランドのウサギに注射しました。4 回目の注射後にウサギを屠殺し、アフィニティー精製によって総 IgG を分離しました。最も EPP 特異性の高いウサギの IgG を使用して、さらにウェスタン ブロットを行いました。
ウエスタンブロットでは、4日齢の処女オスと処女または強制交配したメス（交配後10匹未満）からMAG（n = 10、nは生物学的に独立した蚊のサンプル数）とメスのLRT（n = 30）を採取し、タンパク質抽出緩衝液（50 mM Tris、pH 8.0、1% NP-40、0.25% デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche））を別々に加えました。サンプルは、解剖後すぐにビーダー（2 mmガラスビーズ、2,400 rpm、90秒）でホモジナイズしました。不溶性の破片は、4 °Cで20,000 gの遠心分離によって除去しました。タンパク質はBradfordアッセイ（Bio-Rad）で定量しました。次に、20 µgのMAGタンパク質、40 µgのLRTタンパク質と20 µgの残留バルクタンパク質を変性し、MOPS緩衝液を用いて10% Bis-Tris NuPAGEで分離した。タンパク質はiBlot2転写システム（Thermo Fisher）を用いてポリフッ化ビニリデン膜に転写した。膜を1×PBS-T（PBS中0.1% Tween-20）で2回洗浄し、Odysseyブロッキング緩衝液（Li-Cor）で22°Cで1時間ブロッキングした。膜をカスタムウサギ抗EPPポリクローナル一次抗体（ブロッキング緩衝液中1:700）およびラット抗アクチンモノクローナル一次抗体MAC237（Abeam; 1:4,000）とともに4°Cで一晩振盪した。膜をPBS-Tで洗浄し、二次抗体（ロバ抗ウサギ800CWおよびヤギ抗ラット680LT (Li-Cor、両方とも 1:20,000) を、0.01% SDS および 0.2% Tween-20 を含むブロッキング バッファーで 22 °C で 1 時間処理しました。膜を PBS-T で洗浄し、Odyssey CLx スキャナーでイメージングしました。画像は Image Studio (バージョン 5.2) で収集および処理しました。EPP-RA アイソフォーム (82 kDa) に対応する特定のバンドは検出されませんでした。
EPP（ヒスチジンホスファターゼドメインを含むアイソフォームAGAP002463-RB、NCBI保存ドメイン検索34）およびEcK2（AGAP002181）のコーディング領域をpET-21a（+）プラスミド（Novagen Millipore Sigma）にクローニングしました。プライマーは、拡張データ表 2 にリストされています。8 つの GS4 リンカー (直列) が、pET-21a(+)-EcK2 コンストラクトの C 末端 6xHis タグの前に挿入されました。組み換えタンパク質は、NEBExpress 無細胞 E. coli タンパク質合成反応 (New England BioLabs) を使用して生成されました。組み換えタンパク質は、NEBExpress Ni スピン カラム (New England BioLabs) を使用して精製されました。ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) コントロール タンパク質は、NEBExpress 無細胞 E. coli タンパク質合成キットの DNA テンプレートを使用して生成されました。タンパク質は、PBS 内の 50% グリセロールで -20 °C で最大 3 か月間保存されました。
EPP および組織抽出物のホスファターゼ活性を、4-ニトロフェニルリン酸 (pNPP、Sigma-Aldrich) を使用して測定しました。反応バッファーには、25 mM Tris、50 mM 酢酸、25 mM Bis-Tris、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、および 1 mM DTT が含まれていました。組織を反応バッファーでホモジェナイズし、細胞残骸を遠心分離で除去しました。2.5 mg ml-1 pNPP を含む反応バッファーに酵素または組織抽出物を添加して反応を開始しました。反応混合物を暗所で室温でインキュベートし、さまざまな時点で 405 nm の吸光度を測定することで、pNPP から変換された pNP の量を定量しました。
in vitro EcK活性については、10 mM HEPES-NaOH、0.1% BSA、2 mM ATP、10 mM MgCl2を含む200 µlの緩衝液（pH 7.5）中で、0.2 mgの20Eまたは3D20Eとともにタンパク質を27 °Cで2時間インキュベートしました。800 µlのメタノールを加えて反応を停止し、-20 °Cで1時間冷却した後、4 °Cで10分間、20,000 gで遠心分離しました。上清をHPLC-MS/MSで分析しました。対照群に使用したタンパク質を熱不活性化するために、タンパク質をPBS中の50%グリセロールで95 °Cで20分間インキュベートしました。
インビトロEPP活性については、タンパク質を、25 mMトリス、50 mM酢酸、25 mMビストリス、150 mM NaCl、0.1 mM EDTA、および1 mM DTTを含む100 µlの緩衝液（pH 7.5）中で3D20E22P（HPLC-MS/MSで精製された18対のMAGに含まれる量に相当）とともに、27 °Cで3時間インキュベートしました。400 µlのメタノールを加えて反応を停止し、-20 °Cで1時間冷却した後、4 °Cで20,000 gで10分間遠心分離しました。上清をHPLC-MS/MSで分析しました。
EPP（362 bp）、EcK1（AGAP004574、365 bp）およびEcK2（556 bp）のPCR断片は、混合性別の頭なし蚊の死体から調製したcDNAから増幅されました。eGFPコントロールのPCR断片（495 bp）は、前述のpCR2.1-eGFPから増幅されました。 PCRプライマーは、拡張データ表2に記載されています。PCRフラグメントは、pL4440プラスミド上の反転T7プロモーターの間に挿入されました。プラスミド構築物は、NEB 5-αコンピテントE. coli（New England Biolabs）から回収され、使用前にDNA配列決定によって検証されました（挿入配列については補足データ1を参照）。T7プロモーターに適合するプライマー（拡張データ表2）を使用して、pL4440ベースのプラスミドからの挿入物を増幅しました。PCR産物のサイズは、アガロースゲル電気泳動によって確認しました。dsRNAは、Megascript T7転写キット（Thermo Fisher）を使用してPCRテンプレートから転写され、前述の変更を加えて製造元の指示に従って精製されました。
dsRNA注入については、羽化後1日以内に、1,380 ngのdsRNA（dsGFP、dsEcK1、dsEcK2、dsEPP）を10 ng nl-1の濃度で成虫の雄または雌（Nanoject III、Drummond）の胸部に注入した。遺伝子ノックダウンレベルは、RNA抽出、cDNA合成、およびRT-qPCRによって少なくとも3回の生物学的反復で決定した。エクジソン注入については、4日齢の処女または6日齢の処女の吸血雌に、実験設計に応じてそれぞれ1.3、2.1の濃度で0.13、0.21、または0.63 µgの20Eまたは3D20E（Nanoject III、Drummond）を注入した。または6.3 ng nl-1を注入した。 10% (vol/vol)エタノール水溶液、10%エタノール中の3D20E22P 100 nl (MAG 1組に含まれる量の75%に相当)。蚊は注射グループにランダムに割り当てられました。
産卵試験では、3 日齢の雌に人間の血液を自由に摂取させました。部分的にしか餌を与えられていない、または餌を与えていない蚊を除去します。処理に応じて、雌は吸血後少なくとも 48 時間、別々の産卵カップに 4 晩入れられました。卵は実体顕微鏡 (Stemi 508、Zeiss) で数えられ、交尾した雌については、幼虫に孵化した卵は受精卵とみなされました。
交配試験では、処理に応じて雌が交配に対する耐性を獲得するまで少なくとも 2 日間与え、その後、野生型の年齢を合わせた雄を同じケージに入れました。2 日後、雌の受精小胞を解剖し、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、および 25 mM NaCl (pH 8.2) を含むバッファーで凍結融解および超音波処理によりゲノム DNA を放出しました。サンプルはプロテイナーゼ K (0.86 µg µl-1) とともに 55 °C で 15 分間インキュベートし、続いて 95 °C で 10 分間インキュベートしました。粗ゲノム DNA 調製物を 10 倍希釈し、Y 染色体配列の qPCR 検出にかけました。プライマーは拡張データ表 2 にリストされています。Y 染色体配列が存在しない場合は、交配が行われていないことを示します。
再交配アッセイでは、強制交配した雌について、交尾プラグの存在を調べて交配状態を確認し、前述のとおり36 、雄の不在下で交配に対する不応性が生じるまで 2 日間放置した。次に、DsRed トランスジェニック精子を持つ雄を雌のケージに導入した。2 日後、受精小胞を雌から切り離し、上記のとおりゲノム DNA を調製して、DsRed トランスジェニックの qPCR 検出を実施した。プライマーは拡張データ表 2 にリストされている。DsRed トランスジェニックが存在しなかったことは、再交配が発生しなかったことを示している。
3D20Eは前述の37に従って合成しました。簡単に言うと、10 mgの20E（Sigma-Aldrich）を10 mlの水に溶かし、続いて30 mgの白金黒（粉末状、Sigma-Aldrich）を加えました。反応混合物にO2を穏やかに連続的に吹き込み、室温で撹拌しました。6時間後、30 mLのメタノールを加えて反応を停止しました。混合物を遠心分離して触媒粒子を除去しました。上澄み液を室温で真空蒸発乾固しました。乾燥した反応生成物を10%エタノールおよびメタノール注入に溶解し、HPLC-MS/MS分析にかけました。変換率（20Eから3D20Eへ）は約97%（図4b）で、合成した3D20EのMSスペクトルは交尾した雌のスペクトルと一致しました（図4c）。
凡例には、実行された統計テストの詳細が含まれています。GraphPad (バージョン 9.0) を使用して、Fisher の正確検定、Mantel-Cox 検定、および Student の t 検定を実行しました。Cochran-Mantel-Haenszel 検定は、カスタム R スクリプト (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test で入手可能) を使用して実行しました。データ分布は、有意水準 0.05 の Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性テストを行いました。データが正規性テストに失敗した場合は、Mann-Whitney 検定を実行しました。生存データは、Mantel-Cox 検定を使用して分析しました。DESeq2 パッケージ (バージョン 1.28.1) を使用して、RNA-seq 遺伝子レベルの差次的発現解析を実行しました。グラフ上の水平バーは中央値を表します。すべてのテストの閾値として、有意水準 P = 0.05 を使用しました。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research Report の概要を参照してください。
MS プロテオームデータは、データセット識別子 PXD032157 で、PRIDE パートナー リポジトリ (https://www.ebi.ac.uk/pride/) を通じて ProteomeXchange コンソーシアム (http://proteomecentral.proteomexchange.org) に保存されました。
RNA-seq データセットは、シリアルレコード GSE198665 で Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) に保存されています。
現在の研究中に生成および/または分析された追加のデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。この記事ではソースデータを提供します。
De Loof, A. エクジステロイド：無視された昆虫の性ステロイド？男性：ブラックボックス。昆虫科学。13、325–338（2006）。
Redfern, CPF 20-ヒドロキシエクジソンとAnopheles stephensの卵巣発育。J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982)。