抗真菌剤であり一般的な食品添加物であるプロピオン酸（PPA）は、マウスにおいて消化管機能障害を伴う神経発達異常を引き起こすことが示されており、これは腸内細菌叢の異常によって引き起こされる可能性がある。食事中のPPA曝露と腸内細菌叢の異常との関連性が示唆されているが、直接的な調査は行われていない。本研究では、腸内細菌叢の異常につながる可能性のあるPPA関連の腸内細菌叢組成の変化を調査した。未処理食（n=9）およびPPA添加食（n=13）を与えたマウスの腸内細菌叢を、長距離メタゲノムシーケンスを用いてシーケンスし、微生物組成および細菌代謝経路の違いを評価した。食事中のPPAは、いくつかのBacteroides属、Prevotella属、およびRuminococcus属の種を含む重要な分類群の存在量の増加と関連しており、これらの種は以前にPPA産生に関与していることが示唆されている。 PPAに曝露されたマウスの腸内細菌叢には、脂質代謝およびステロイドホルモン生合成に関連する経路もより多く存在していた。今回の結果は、PPAが腸内細菌叢とその関連代謝経路を変化させる可能性があることを示している。これらの観察された変化は、食用として安全と分類されている保存料が腸内細菌叢の構成、ひいては人間の健康に影響を与える可能性があることを浮き彫りにしている。 その中で、分析対象の分類レベルに応じて、P、G、またはSが選択されます。偽陽性分類の影響を最小限に抑えるため、最小相対存在量閾値1e-4（1/10,000リード）が採用されました。統計分析の前に、Brackenによって報告された相対存在量（fraction_total_reads）は、中心対数比（CLR）変換（Aitchison、1982）を使用して変換されました。CLR法は、スケール不変であり、非スパースデータセットに十分であるため、データ変換に選択されました（Gloor et al.、2017）。CLR変換は自然対数を使用します。Brackenによって報告されたカウントデータは、相対対数式（RLE）（Anders and Huber、2010）を使用して正規化されました。図は、matplotlib v. 3.7.1、seaborn v. 3.7.2、および逐次対数の組み合わせを使用して生成されました（Gloor et al.、2017）。 0.12.2 および stantanotations v. 0.5.0 (Hunter、2007; Waskom、2021; Charlier et al.、2022) を使用しました。各サンプルについて、正規化された細菌数を使用して Bacillus/Bacteroidetes 比を計算しました。表に報告されている値は、小数点以下 4 桁に丸められています。Simpson 多様性指数は、KrakenTools v. 1.2 パッケージ (Lu et al.、2022) で提供されている alpha_diversity.py スクリプトを使用して計算しました。スクリプトには Bracken レポートが提供され、-an パラメータには Simpson 指数「Si」が提供されています。存在量の有意差は、平均 CLR 差 ≥ 1 または ≤ -1 として定義されました。平均 CLR 差が ±1 の場合、サンプル タイプの存在量が 2.7 倍増加したことを示します。符号 (+/-) は、それぞれ PPA サンプルとコントロール サンプルで分類群がより豊富であるかどうかを示します。有意性はマン・ホイットニーU検定（Virtanen et al., 2020）を用いて判定した。統計モデルにはStatsmodels v. 0.14（Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010）を用い、多重検定補正にはBenjamini-Hochberg法を適用した。統計的有意性の判定基準として、調整済みp値≤0.05を用いた。
ヒトのマイクロバイオームはしばしば「体の最後の器官」と呼ばれ、ヒトの健康に重要な役割を果たしています（Baquero and Nombela、2012）。特に、腸内マイクロバイオームは全身に影響を及ぼし、多くの重要な機能において重要な役割を担っていることが知られています。腸内には共生細菌が豊富に存在し、複数の生態的ニッチを占め、栄養素を利用し、潜在的な病原体と競合しています（Jandhyala et al.、2015）。腸内細菌叢の多様な細菌成分は、ビタミンなどの必須栄養素を生成し、消化を促進する能力を持っています（Rowland et al.、2018）。また、細菌代謝産物は組織の発達に影響を与え、代謝経路や免疫経路を強化することも示されています（Heijtz et al.、2011; Yu et al.、2022）。ヒトの腸内細菌叢の構成は非常に多様であり、食事、性別、薬、健康状態などの遺伝的要因や環境要因に依存します（Kumbhare et al., 2019）。
母親の食事は胎児および新生児の発達の重要な要素であり、発達に影響を与える可能性のある化合物の推定供給源である（Bazer et al., 2004; Innis, 2014）。注目すべき化合物の1つはプロピオン酸（PPA）であり、細菌発酵から得られる短鎖脂肪酸の副産物であり、食品添加物である（den Besten et al., 2013）。PPAは抗菌性および抗真菌性を有するため、食品保存料として、またカビや細菌の増殖を抑制する工業用途で使用されている（Wemmenhove et al., 2016）。PPAは組織によって異なる効果を示す。肝臓では、PPAはマクロファージにおけるサイトカインの発現に影響を与えることで抗炎症効果を示す（Kawasoe et al., 2022）。この調節効果は他の免疫細胞でも観察されており、炎症のダウンレギュレーションにつながる（Haase et al., 2021）。しかし、脳では逆の効果が観察されている。これまでの研究では、PPAへの曝露がマウスに自閉症様の行動を引き起こすことが示されている（El-Ansary et al., 2012）。他の研究では、PPAが脳内でグリア細胞増殖を誘発し、炎症促進経路を活性化することが示されている（Abdelli et al., 2019）。PPAは弱酸であるため、腸管上皮を介して血流に拡散し、血液脳関門や胎盤などの制限的な障壁を通過できる（Stinson et al., 2019）。これは、細菌によって産生される調節代謝物としてのPPAの重要性を強調している。自閉症のリスク因子としてのPPAの潜在的な役割は現在調査中であるが、自閉症患者に対するその影響は神経分化の誘発にとどまらない可能性がある。
下痢や便秘などの消化器症状は、神経発達障害の患者によく見られる（Cao et al., 2021）。これまでの研究では、自閉スペクトラム症（ASD）患者のマイクロバイオームは健常者とは異なることが示されており、腸内細菌叢の異常の存在が示唆されている（Finegold et al., 2010）。同様に、炎症性腸疾患、肥満、アルツハイマー病などの患者のマイクロバイオームの特徴も健常者とは異なる（Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019）。しかし、いくつかの細菌種がこれらの疾患状態の一部に関与していると考えられているものの、現在までに腸内マイクロバイオームと神経疾患または症状との因果関係は確立されていない（Yap et al., 2021）。例えば、Akkermansia、Bacteroides、Clostridium、Lactobacillus、Desulfovibrioなどの属は、自閉症患者の腸内細菌叢でより豊富に存在します（Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020）。注目すべきことに、これらの属の一部の種は、PPA産生に関連する遺伝子を持っていることが知られています（Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023）。PPAの抗菌特性を考えると、その存在量を増やすことは、PPA産生細菌の増殖に有益である可能性があります（Jacobson et al., 2018）。したがって、PFAが豊富な環境は、消化管病原菌を含む腸内細菌叢の変化を引き起こし、それが消化器症状の原因となる可能性のある要因となる可能性がある。
マイクロバイオーム研究における中心的な疑問は、微生物組成の違いが基礎疾患の原因なのか症状なのかということです。食事、腸内マイクロバイオーム、神経疾患の複雑な関係を解明するための第一歩は、食事が微生物組成に及ぼす影響を評価することです。この目的のために、ロングリードメタゲノムシーケンスを使用して、PPAが豊富な食事またはPPAが不足した食事を与えられたマウスの子孫の腸内マイクロバイオームを比較しました。子孫には母親と同じ食事を与えました。PPAが豊富な食事は、腸内微生物組成と微生物機能経路、特にPPA代謝および/またはPPA産生に関連する経路に変化をもたらすと仮説を立てました。
本研究では、セントラルフロリダ大学動物実験委員会（UCF-IACUC）のガイドライン（動物使用許可番号：PROTO202000002）に従い、グリア特異的GFAPプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を過剰発現するFVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/Jトランスジェニックマウス（Jackson Laboratories）を使用した。離乳後、マウスは1ケージあたり雌雄各1～5匹で個別に飼育した。マウスには、精製対照食（改変オープンラベル標準食、脂肪16kcal%）またはプロピオン酸ナトリウム添加食（改変オープンラベル標準食、脂肪16kcal%、プロピオン酸ナトリウム5,000ppm含有）を自由に摂取させた。使用したプロピオン酸ナトリウムの量は、総飼料重量1kgあたり5,000mg PFAに相当する。これは、食品保存料として承認されているPPAの最高濃度です。この研究の準備として、親マウスは交配の4週間前から両方の餌を与えられ、母マウスの妊娠期間中ずっと与えられ続けました。子マウス[22匹、対照群9匹（オス6匹、メス3匹）、PPA群13匹（オス4匹、メス9匹）]は離乳後、母マウスと同じ餌を5か月間与え続けました。子マウスは生後5か月で屠殺され、腸内容物が採取され、最初は1.5 mlマイクロ遠心チューブに-20°Cで保存され、その後、宿主DNAが枯渇し微生物核酸が抽出されるまで-80°Cの冷凍庫に移されました。
宿主DNAは、改変されたプロトコル（Charalampous et al., 2019）に従って除去した。簡単に説明すると、糞便内容物を500 µlのInhibitEX（Qiagen、Cat#/ID: 19593）に移し、凍結保存した。抽出ごとに最大1～2個の糞便ペレットを処理する。次に、チューブ内でプラスチック製の乳棒を使用して糞便内容物を機械的に均質化し、スラリー状にした。サンプルを10,000 RCFで5分間、またはサンプルがペレットになるまで遠心分離し、上清を吸引除去し、ペレットを250 µlの1× PBSに再懸濁する。真核細胞膜を緩めるための界面活性剤として、250 µlの4.4%サポニン溶液（TCI、製品番号S0019）をサンプルに加える。サンプルを滑らかになるまで穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートした。次に、真核細胞を破壊するために、サンプルにヌクレアーゼフリー水350 μlを加え、30秒間インキュベートした後、5 M NaCl 12 μlを加えた。次に、サンプルを6000 RCFで5分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを1X PBS 100 μlに再懸濁した。宿主DNAを除去するために、HL-SANバッファー（NaCl 12.8568 g、1M MgCl2 4 ml、ヌクレアーゼフリー水36 ml）10 μlとHL-SAN酵素（ArticZymes P/N 70910-202）10 μlを加えた。サンプルをピペットで十分に混合し、Eppendorf™ ThermoMixer Cを用いて37℃で30分間、800rpmでインキュベートした。インキュベーション後、6000 RCFで3分間遠心分離し、800 µlと1000 µlの1X PBSで2回洗浄した。最後に、沈殿物を100 µlの1X PBSに再懸濁した。
全細菌DNAは、New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ、カタログ番号T3010L）を使用して分離した。キットに付属の標準操作手順を若干変更した。最終溶出操作の前に、ヌクレアーゼフリー水を60℃でインキュベートして維持する。各サンプルに10 µlのプロテイナーゼKと3 µlのRNase Aを加える。次に、100 µlの細胞溶解バッファーを加え、穏やかに混合する。サンプルをEppendorf™ ThermoMixer Cで56℃、1400 rpmで少なくとも1時間、最大3時間インキュベートする。インキュベートしたサンプルを12,000 RCFで3分間遠心分離し、各サンプルの上清を400 µLの結合溶液を含む別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。次に、チューブを 1 秒間隔で 5～10 秒間パルスボルテックスします。各サンプルの全液体内容物 (約 600～700 µL) をフロー スルー コレクション チューブにセットしたフィルター カートリッジに移します。チューブを 1,000 RCF で 3 分間遠心分離して最初の DNA 結合を促し、次に 12,000 RCF で 1 分間遠心分離して残留液体を除去します。サンプル カラムを新しいコレクション チューブに移し、2 回洗浄します。最初の洗浄では、各チューブに 500 µL の洗浄バッファーを加えます。チューブを 3～5 回反転し、12,000 RCF で 1 分間遠心分離します。コレクション チューブから液体を捨て、フィルター カートリッジを同じコレクション チューブに戻します。2 回目の洗浄では、反転せずにフィルターに 500 µL の洗浄バッファーを加えます。サンプルを12,000 RCFで1分間遠心分離した。フィルターを1.5 mL LoBind®チューブに移し、予温したヌクレアーゼフリー水を100 µL加えた。フィルターを室温で1分間インキュベートした後、12,000 RCFで1分間遠心分離した。溶出されたDNAは-80℃で保存した。
DNA濃度はQubit™ 4.0蛍光光度計を用いて定量した。DNAはQubit™ 1X dsDNA高感度キット（カタログ番号Q33231）を用いて製造元の指示に従って調製した。DNA断片長分布はAgilent™ 4150または4200 TapeStationを用いて測定した。DNAはAgilent™ Genomic DNA Reagents（カタログ番号5067-5366）およびGenomic DNA ScreenTape（カタログ番号5067-5365）を用いて調製した。ライブラリー調製はOxford Nanopore Technologies™（ONT）Rapid PCR Barcoding Kit（SQK-RPB004）を用いて製造元の指示に従って行った。DNAはONT GridION™ Mk1シーケンサーとMin106Dフローセル（R 9.4.1）を用いてシーケンスした。シーケンス設定は高精度塩基コール、最小q値9、バーコード設定、バーコードトリミングであった。サンプルは72時間かけてシーケンスされ、その後、塩基配列決定データがさらなる処理と分析のために提出された。
バイオインフォマティクス処理は、既述の方法（Greenman et al., 2024）を用いて実施した。シーケンスから得られたFASTQファイルは、サンプルごとにディレクトリに分割した。バイオインフォマティクス解析の前に、データは以下のパイプラインを用いて処理した。まず、サンプルのFASTQファイルを1つのFASTQファイルにマージした。次に、Filtlong v. 0.2.1を用いて1000 bp未満のリードをフィルタリングした。この際、変更したパラメータは–min_length 1000のみである（Wick, 2024）。さらにフィルタリングを行う前に、NanoPlot v. 1.41.3を用いてリードの品質を以下のパラメータで制御した：–fastq –plots dot –N50 -o
分類学的分類には、リードとアセンブルされたコンティグをKraken2 v. 2.1.2 ( Wood et al., 2019 ) を使用して分類しました。リードとアセンブリのレポートと出力ファイルをそれぞれ生成します。リードとアセンブリを解析するには、–use-names オプションを使用します。リードセグメントには、–gzip-compressed オプションと –paired オプションを指定します。メタゲノムにおける分類群の相対存在量は、Bracken v. 2.8 ( Lu et al., 2017 ) を使用して推定しました。まず、bracken-build を使用して、次のパラメータで 1000 塩基を含む kmer データベースを作成しました: -d
遺伝子アノテーションと相対存在量の推定は、Marangaら（Maranga et al., 2023）が記述したプロトコルの改変版を用いて実施した。まず、SeqKit v. 2.5.1（Shen et al., 2016）を用いて、すべてのアセンブリから500 bp未満のコンティグを除去した。次に、選択されたアセンブリを結合してパンメタゲノムを作成した。オープンリーディングフレーム（ORF）は、Prodigal v. 1.0.1（Prodigal v. 2.6.3のパラレルバージョン）を用いて、以下のパラメータで同定した：-d
遺伝子は、遺伝子経路の存在量を比較するために、eggNOG によって割り当てられた京都遺伝子ゲノム百科事典 (KEGG) オルソログ (KO) 識別子に従って最初にグループ化されました。ノックアウトのない遺伝子、または複数のノックアウトを持つ遺伝子は、解析前に削除されました。次に、サンプルごとの各 KO の平均存在量が計算され、統計解析が実行されました。PPA 代謝遺伝子は、KEGG によるとプロピオン酸代謝に関与していることを示す KEGG_Pathway 列の行 ko00640 が割り当てられた遺伝子として定義されました。PPA 産生に関連すると特定された遺伝子は、補足表 1 に記載されています (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017)。順列検定が実行され、各サンプルタイプで有意に多く存在する PPA 代謝および産生遺伝子が特定されました。解析された各遺伝子について 1000 回の順列が実行されました。統計的有意性を決定するためのカットオフとして p 値 0.05 が使用されました。クラスター内の代表的な遺伝子の注釈に基づいて、クラスター内の個々の遺伝子に機能注釈が割り当てられた。Kraken2の出力ファイル内のコンティグIDをeggNOGを用いた機能注釈中に保持された同じコンティグIDと照合することにより、PPA代謝および/またはPPA産生に関連する分類群を特定できた。有意性検定は、前述のMann-Whitney U検定を用いて実施した。多重検定の補正は、Benjamini-Hochberg法を用いて行った。統計的有意性を判断するためのカットオフ値として、p値≤0.05を用いた。
マウスの腸内マイクロバイオームの多様性は、シンプソン多様性指数を用いて評価した。属および種の多様性に関して、コントロール群とPPA群のサンプル間に有意差は認められなかった（属のp値：0.18、種のp値：0.16）（図1）。次に、主成分分析（PCA）を用いて微生物組成を比較した。図2は、サンプルを門ごとにクラスタリングした結果を示しており、PPA群とコントロール群のサンプル間でマイクロバイオームの種組成に違いがあることを示している。このクラスタリングは属レベルではあまり顕著ではなく、PPAが特定の細菌に影響を与えていることを示唆している（補足図1）。
図1. マウス腸内マイクロバイオームの属および種のアルファ多様性。PPAおよび対照サンプルにおける属（A）および種（B）のシンプソン多様性指数を示す箱ひげ図。有意性はマン・ホイットニーU検定を用いて判定し、多重比較補正はベンジャミニ・ホッホベルグ法を用いて行った。nsはp値が有意ではない（p>0.05）ことを示す。
図2. 種レベルでのマウス腸内マイクロバイオーム組成の主成分分析結果。主成分分析プロットは、サンプルが最初の2つの主成分にわたってどのように分布しているかを示しています。色はサンプルタイプを示しており、PPA曝露マウスは紫色、対照マウスは黄色です。主成分1と2はそれぞれx軸とy軸にプロットされ、説明分散比として表されます。
RLE変換されたカウントデータを使用すると、コントロールマウスとPPAマウスでバクテロイデス/バチルス比の中央値が有意に減少していることが観察されました（コントロール：9.66、PPA：3.02、p値 = 0.0011）。この差は、コントロールと比較してPPAマウスでバクテロイデスの存在量が多かったことによるものでしたが、その差は有意ではありませんでした（コントロール平均CLR：5.51、PPA平均CLR：6.62、p値 = 0.054）。一方、バクテロイデスの存在量は類似していました（コントロール平均CLR：7.76、PPA平均CLR：7.60、p値 = 0.18）。
腸内マイクロバイオームの分類学的メンバーの存在量の分析により、PPAサンプルと対照サンプル間で1つの門と77種が有意に異なることが明らかになった（補足表2）。PPAサンプル中の59種の存在量は対照サンプルよりも有意に高かったが、対照サンプル中の16種の存在量はPPAサンプルよりも高かった（図3）。
図 3. PPA マウスとコントロール マウスの腸内マイクロバイオームにおける分類群の存在量の差。ボルケーノ プロットは、PPA サンプルとコントロール サンプル間の属 (A) または種 (B) の存在量の差を示しています。灰色のドットは、分類群の存在量に有意差がないことを示します。色の付いたドットは、存在量に有意差があることを示します (p 値 ≤ 0.05)。サンプル タイプ間で存在量の差が最も大きい上位 20 分類群は、それぞれ赤色と水色 (コントロール サンプルと PPA サンプル) で示されています。黄色と紫色のドットは、コントロール サンプルまたは PPA サンプルでコントロールよりも少なくとも 2.7 倍多く存在していました。黒色のドットは、平均 CLR 差が -1 ～ 1 で、存在量に有意差がある分類群を表します。p 値は、Mann-Whitney U 検定を使用して計算され、Benjamini-Hochberg 法を使用して多重検定補正されました。太字の平均 CLR 差は、存在量の有意差を示します。
腸内微生物叢の構成を分析した後、マイクロバイオームの機能アノテーションを実施しました。低品質の遺伝子を除外した後、全サンプルで合計378,355個の固有遺伝子が同定されました。これらの遺伝子の変換された存在量を用いて主成分分析（PCA）を行ったところ、機能プロファイルに基づいてサンプルタイプが高度にクラスタリングされていることが示されました（図4）。
図4. マウス腸内マイクロバイオームの機能プロファイルを用いたPCAの結果。PCAプロットは、サンプルが最初の2つの主成分にわたってどのように分布しているかを示しています。色はサンプルタイプを示しており、PPA曝露マウスは紫色、対照マウスは黄色です。主成分1と2はそれぞれx軸とy軸にプロットされ、説明分散比として表されます。
次に、異なるサンプルタイプにおける KEGG ノックアウトの存在量を調べた。合計 3648 個の固有のノックアウトが同定され、そのうち 196 個はコントロール サンプルで有意に多く、106 個は PPA サンプルで多く存在していた (図 5)。コントロール サンプルでは合計 145 個の遺伝子が、PPA サンプルでは 61 個の遺伝子が検出され、その存在量に有意な差が見られた。脂質およびアミノ糖代謝に関連するパスウェイは、PPA サンプルで有意に多く存在していた (補足表 3)。窒素代謝および硫黄リレー システムに関連するパスウェイは、コントロール サンプルで有意に多く存在していた (補足表 3)。アミノ糖/ヌクレオチド代謝 (ko:K21279) およびイノシトールリン酸代謝 (ko:K07291) に関連する遺伝子の存在量は、PPA サンプルで有意に高かった (図 5)。対照サンプルでは、安息香酸代謝（ko:K22270）、窒素代謝（ko:K00368）、解糖/糖新生（ko:K00131）に関連する遺伝子が有意に多く存在していた（図5）。
図 5. PPA マウスとコントロール マウスの腸内マイクロバイオームにおける KO の差分存在量。ボルケーノ プロットは、機能グループ (KO) の存在量の差を示しています。灰色のドットは、サンプル タイプ間で存在量が有意に異ならなかった KO (p 値 > 0.05) を示します。色の付いたドットは、存在量に有意差がある (p 値 ≤ 0.05) ことを示します。サンプル タイプ間で存在量に最も大きな差がある 20 個の KO は、それぞれコントロール サンプルと PPA サンプルに対応して、赤色と水色で示されています。黄色と紫色のドットは、それぞれコントロール サンプルと PPA サンプルで少なくとも 2.7 倍多く存在していた KO を示します。黒色のドットは、平均 CLR 差が -1 ～ 1 で、存在量に有意差がある KO を示します。p 値は、Mann-Whitney U 検定を使用して計算され、Benjamini-Hochberg 法を使用して多重比較の調整が行われました。NaN は、KO が KEGG のパスウェイに属さないことを示します。太字で示された平均CLR差の値は、存在量の有意差を示します。記載されているKOが属する経路の詳細については、補足表3を参照してください。
注釈付き遺伝子のうち、1601個の遺伝子はサンプルタイプ間で有意に異なる存在量を示し（p ≤ 0.05）、各遺伝子は少なくとも2.7倍多く存在していました。これらの遺伝子のうち、4個の遺伝子はコントロールサンプルでより多く存在し、1597個の遺伝子はPPAサンプルでより多く存在していました。PPAは抗菌特性を持つため、サンプルタイプ間でPPA代謝および産生遺伝子の存在量を調べました。1332個のPPA代謝関連遺伝子のうち、27個の遺伝子はコントロールサンプルで有意に多く存在し、12個の遺伝子はPPAサンプルでより多く存在していました。223個のPPA産生関連遺伝子のうち、1個の遺伝子はPPAサンプルで有意に多く存在していました。図6Aは、PPA代謝に関与する遺伝子の存在量が高いことをさらに示しており、コントロールサンプルで有意に多く存在し、効果量も大きいことがわかります。一方、図6Bは、PPAサンプルで有意に多く存在することが観察された個々の遺伝子を強調しています。
図 6. マウス腸内マイクロバイオームにおける PPA 関連遺伝子の発現量の差異。ボルケーノ プロットは、PPA 代謝 (A) および PPA 産生 (B) に関連する遺伝子の発現量の差異を示しています。灰色のドットは、サンプル タイプ間で発現量が有意に異ならなかった遺伝子 (p 値 > 0.05) を示します。色の付いたドットは、発現量に有意差がある遺伝子 (p 値 ≤ 0.05) を示します。発現量の差が最も大きい 20 個の遺伝子は、それぞれ赤色と水色 (コントロール サンプルと PPA サンプル) で示されています。黄色と紫色のドットの発現量は、コントロール サンプルと PPA サンプルでコントロール サンプルよりも少なくとも 2.7 倍高くなっています。黒色のドットは、平均 CLR 差が -1 ～ 1 で、発現量に有意差がある遺伝子を表します。p 値は、Mann-Whitney U 検定を使用して計算され、Benjamini-Hochberg 法を使用して多重比較補正されました。遺伝子は、非冗長遺伝子カタログの代表的な遺伝子に対応します。遺伝子名は、KO遺伝子を示すKEGGシンボルで構成されています。太字の平均CLR差は、有意に異なる発現量を示します。ダッシュ（-）は、KEGGデータベースにその遺伝子のシンボルがないことを示します。
PPA代謝および/または産生に関連する遺伝子を持つ分類群は、コンティグの分類学的同一性を遺伝子のコンティグIDと照合することによって特定された。属レベルでは、130属がPPA代謝に関連する遺伝子を持ち、61属がPPA産生に関連する遺伝子を持つことが判明した（補足表4）。しかし、どの属も存在量に有意な差は見られなかった（p > 0.05）。
種レベルでは、144種の細菌種がPPA代謝に関連する遺伝子を持ち、68種の細菌種がPPA産生に関連する遺伝子を持っていることがわかった（補足表5）。PPA代謝菌のうち、8種の細菌はサンプルタイプ間で存在量が有意に増加し、すべて効果に有意な変化を示した（補足表6）。存在量に有意差が認められたすべてのPPA代謝菌は、PPAサンプルでより多く存在していた。種レベルの分類では、いくつかのBacteroides属およびRuminococcus属の種、ならびにDuncania dubois、Myxobacterium enterica、Monococcus pectinolyticus、およびAlcaligenes polymorphaを含む、サンプルタイプ間で有意差が認められなかった属の代表種が明らかになった。PPA産生菌のうち、4種の細菌はサンプルタイプ間で存在量に有意差を示した。存在量に有意な差が見られた種には、Bacteroides novorossi、Duncania dubois、Myxobacterium enteritidis、およびRuminococcus bovisが含まれていた。
本研究では、PPA曝露がマウスの腸内細菌叢に及ぼす影響を調べた。PPAは、特定の種によって産生されたり、他の種によって栄養源として利用されたり、抗菌作用を持つため、細菌に対して異なる反応を引き起こす可能性がある。したがって、食事によるサプリメントとして腸内環境にPPAを加えると、耐性、感受性、栄養源としての利用能力に応じて異なる影響が生じる可能性がある。感受性の高い細菌種は排除され、PPAに対する耐性が高い、またはPPAを栄養源として利用できる細菌種に置き換わることで、腸内細菌叢の構成が変化する可能性がある。我々の結果は、微生物構成に有意な差が見られたものの、微生物の多様性全体には影響が見られなかったことを示した。最も大きな影響は種レベルで観察され、PPAサンプルと対照サンプル間で70以上の分類群の存在量が有意に異なっていた（補足表2）。 PPAに曝露したサンプルの組成をさらに評価したところ、曝露していないサンプルと比較して微生物種の多様性がより大きいことが明らかになった。これは、PPAが細菌の増殖特性を高め、PPAが豊富な環境で生存できる細菌集団を制限する可能性があることを示唆している。したがって、PPAは腸内細菌叢の多様性を広範囲に破壊するのではなく、選択的に変化を誘発する可能性がある。
PPAなどの食品保存料は、腸内細菌叢の多様性全体に影響を与えることなく、腸内細菌叢の構成要素の量を変化させることが以前から示されています（Nagpal et al., 2021）。本研究では、PPAに曝露されたマウスで有意に増加したバクテロイデス門（以前はバクテロイデスとして知られていた）内のバクテロイデス種の間で最も顕著な違いが観察されました。バクテロイデス種の増加は粘液分解の増加と関連しており、感染リスクを高め、炎症を促進する可能性があります（Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019）。ある研究では、Bacteroides fragilis を投与された新生児雄マウスが自閉症スペクトラム障害 (ASD) を彷彿とさせる社会的行動を示したことが分かり (Carmel et al., 2023)、他の研究では、Bacteroides 属が免疫活性を変化させ、自己免疫性炎症性心筋症を引き起こす可能性があることが示されています (Gil-Cruz et al., 2019)。また、PPA に曝露されたマウスでは、Ruminococcus、Prevotella、Parabacteroides 属に属する種も有意に増加していました (Coretti et al., 2018)。特定の Ruminococcus 種は、炎症誘発性サイトカインの産生を介してクローン病などの疾患と関連している (Henke et al., 2019) が、Prevotella humani などの Prevotella 種は、高血圧やインスリン感受性などの代謝性疾患と関連している (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017)。最後に、PPA 曝露マウスでは、Bacteroidetes 種の総存在量が多いため、Bacteroidetes (以前は Firmicutes として知られていた) と Bacteroidetes の比率が対照マウスよりも有意に低いことがわかりました。この比率は以前から腸内恒常性の重要な指標であることが示されており、この比率の乱れは炎症性腸疾患（Stojanov et al., 2020）を含む様々な疾患状態（Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023）と関連付けられています。総じて、バクテロイデス門の種は、食事中のPPAの増加によって最も強く影響を受けるようです。これは、PPAに対する耐性が高いか、PPAをエネルギー源として利用できる能力によるものと考えられます。これは、少なくとも1つの種であるHoylesella enocea（Hitch et al., 2022）で真実であることが示されています。あるいは、母体のPPA曝露は、マウスの子孫の腸をバクテロイデスのコロニー形成に対してより感受性にすることで胎児の発育を促進する可能性があります。しかし、私たちの研究デザインではそのような評価はできませんでした。
メタゲノム内容の評価により、PPA代謝および産生に関連する遺伝子の存在量に有意な差があることが明らかになった。PPA曝露マウスではPPA産生に関与する遺伝子の存在量が高く、PPA非曝露マウスではPAA代謝に関与する遺伝子の存在量が高い（図6）。これらの結果は、PPAが微生物組成に及ぼす影響は、PPAの使用のみによるものではない可能性を示唆している。そうでなければ、PPA代謝に関連する遺伝子の存在量は、PPA曝露マウスの腸内マイクロバイオームでより高い値を示すはずである。一つの説明として、PPAは細菌による栄養素としての利用ではなく、主に抗菌作用によって細菌の存在量を調節しているということが挙げられる。これまでの研究では、PPAがサルモネラ菌（Salmonella Typhimurium）の増殖を濃度依存的に阻害することが示されている（Jacobson et al., 2018）。高濃度のPPAに曝露すると、その抗菌特性に耐性があり、必ずしもPPAを代謝または産生できない細菌が選択される可能性がある。例えば、いくつかの Parabacteroides 種は PPA サンプルで有意に高い存在量を示しましたが、PPA 代謝または生成に関連する遺伝子は検出されませんでした (補足表 2、4、および 5)。さらに、発酵副産物としての PPA 生成は、さまざまな細菌に広く分布しています (Gonzalez-Garcia et al., 2017)。細菌の多様性が高いことが、コントロール サンプルで PPA 代謝に関連する遺伝子の存在量が高い理由である可能性があります (Averina et al., 2020)。さらに、1332 個の遺伝子のうち、PPA 代謝のみに関連する遺伝子であると予測されたのは 27 (2.14%) のみでした。PPA 代謝に関連する多くの遺伝子は、他の代謝経路にも関与しています。これは、コントロール サンプルで PPA 代謝に関与する遺伝子の存在量が高いことをさらに示しています。これらの遺伝子は、副産物として PPA の利用または生成をもたらさない経路で機能している可能性があります。この場合、PPA 生成に関連する 1 つの遺伝子のみが、サンプル タイプ間で存在量に有意な差を示しました。 PPA代謝に関連する遺伝子とは対照的に、PPA産生のマーカー遺伝子は、細菌のPPA産生経路に直接関与しているため選択された。PPAに曝露されたマウスでは、すべての種においてPPA産生量と産生能力が有意に増加していることがわかった。これは、PPAがPPA産生菌を選択し、したがってPPA産生能力が増加するという予測を裏付けている。しかし、遺伝子の存在量は必ずしも遺伝子発現と相関するとは限らない。したがって、PPA代謝に関連する遺伝子の存在量は対照サンプルで高いが、発現率は異なる可能性がある（Shiら、2014）。PPA産生遺伝子の存在量とPPA産生との関係を確認するには、PPA産生に関与する遺伝子の発現に関する研究が必要である。
PPAおよびコントロールメタゲノムの機能アノテーションにより、いくつかの違いが明らかになった。遺伝子内容のPCA分析により、PPAサンプルとコントロールサンプルの間に明確なクラスターが明らかになった（図5）。サンプル内クラスタリングでは、コントロール遺伝子内容がより多様であるのに対し、PPAサンプルはまとまってクラスターを形成した。遺伝子内容によるクラスタリングは、種構成によるクラスタリングと同程度であった。したがって、経路存在量の違いは、特定の種とその中の株の存在量の変化と一致している。PPAサンプルでは、存在量が有意に高い2つの経路がアミノ糖/ヌクレオチド糖代謝（ko:K21279）および複数の脂質代謝経路（ko:K00647、ko:K03801；補足表3）に関連していた。ko:K21279に関連する遺伝子は、PPAサンプルで有意に種数が多い属の1つであるBacteroides属に関連していることが知られている。この酵素は、莢膜多糖を発現することで免疫応答を回避できる（Wangら、2008）。これは、PPA曝露マウスで観察されたバクテロイデスの増加を説明できる可能性がある。これは、PPAマイクロバイオームで観察された脂肪酸合成の増加を補完する。細菌はFASIIko:K00647（fabB）経路を利用して脂肪酸を生成するが、これは宿主の代謝経路に影響を与える可能性があり（Yao and Rock、2015; Johnson et al.、2020）、脂質代謝の変化は神経発達に役割を果たす可能性がある（Yu et al.、2020）。PPAサンプルで存在量が増加したもう1つの経路は、ステロイドホルモン生合成（ko:K12343）であった。腸内細菌叢がホルモンレベルに影響を与える能力とホルモンによって影響を受ける能力の間には逆相関関係があり、ステロイドレベルの上昇が下流の健康への影響をもたらす可能性があるという証拠が増えている（Tetel et al.、2018）。
本研究には限界と留意点があります。重要な違いは、動物の生理学的評価を実施していないことです。したがって、マイクロバイオームの変化が何らかの疾患と関連しているかどうかを直接結論付けることはできません。もう1つの留意点は、本研究のマウスは母親と同じ餌を与えられていたことです。今後の研究では、PPAが豊富な食事からPPAを含まない食事に切り替えることで、マイクロバイオームへの影響が改善されるかどうかを明らかにできるかもしれません。他の多くの研究と同様に、本研究の限界の1つはサンプルサイズが限られていることです。妥当な結論を導き出すことはできますが、サンプルサイズが大きければ、結果を分析する際の統計的検出力が向上します。また、腸内マイクロバイオームの変化と何らかの疾患との関連性について結論を出すことにも慎重です（Yap et al., 2021）。年齢、性別、食事などの交絡因子は、微生物の構成に大きく影響する可能性があります。これらの要因は、腸内マイクロバイオームと複雑な疾患との関連性に関する文献で観察される矛盾を説明する可能性がある（Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023）。たとえば、Bacteroidetes属のメンバーは、ASDの動物とヒトで増加または減少することが示されている（Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017）。同様に、炎症性腸疾患患者の腸内組成の研究では、同じ分類群で増加と減少の両方が見つかっている（Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023）。性別バイアスの影響を制限するために、男女の代表性を均等にすることで、差異が食事によって引き起こされている可能性が最も高いようにした。機能アノテーションの課題の1つは、冗長な遺伝子配列の除去である。我々の遺伝子クラスタリング法では、偽のクラスタリングを排除するために、95%の配列同一性と85%の長さ類似性、および90%のアライメントカバレッジを必要とします。しかし、場合によっては、同じ注釈（例：MUT）を持つCOGが観察されました（図6）。これらのオルソログが別個のものであるか、特定の属に関連しているか、あるいはこれが遺伝子クラスタリングアプローチの限界であるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。機能アノテーションのもう1つの限界は、潜在的な誤分類です。細菌遺伝子mmdAはプロピオン酸合成に関与する既知の酵素ですが、KEGGはそれをプロピオン酸代謝経路に関連付けていません。対照的に、scpBとmmcDのオルソログは関連しています。ノックアウトが指定されていない遺伝子の数が多いため、遺伝子存在量を評価する際にPPA関連遺伝子を特定できない可能性があります。今後の研究では、腸内細菌叢の機能的特性をより深く理解し、遺伝子発現を潜在的な下流効果にリンクできるメタトランスクリプトーム解析が役立つでしょう。特定の神経発達障害や炎症性腸疾患に関する研究においては、腸内細菌叢の構成変化とこれらの疾患との関連性を明らかにするために、動物の生理学的および行動学的評価が必要となる。また、腸内細菌叢が疾患の原因となるのか、あるいは疾患の特徴となるのかを判断するために、無菌マウスに腸内細菌叢を移植する追加研究も有用であろう。
要約すると、食事由来のPPAが腸内細菌叢の構成を変化させる要因となることを実証しました。PPAはFDA承認の保存料で、様々な食品に広く含まれており、長期にわたって摂取すると正常な腸内細菌叢の乱れを引き起こす可能性があります。いくつかの細菌の存在量に変化が見られたことから、PPAが腸内細菌叢の構成に影響を与える可能性が示唆されました。腸内細菌叢の変化は、特定の代謝経路のレベルの変化につながり、宿主の健康に関連する生理学的変化を引き起こす可能性があります。食事由来のPPAが微生物構成に及ぼす影響が、ディスバイオシスやその他の疾患につながるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。本研究は、PPAが腸内構成に及ぼす影響がヒトの健康にどのように影響するかについての今後の研究の基礎を築くものです。
本研究で提示されたデータセットは、オンラインリポジトリで入手可能です。リポジトリ名とアクセッション番号は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/、PRJNA1092431です。
本動物実験は、セントラルフロリダ大学動物実験倫理委員会（UCF-IACUC）の承認を得て実施されました（動物実験許可番号：PROTO202000002）。本研究は、地域の法令、規制、および大学の規定を遵守しています。
NG: 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、ソフトウェア、視覚化、執筆（原稿）、執筆（レビューおよび編集）。 LA: 概念化、データキュレーション、方法論、リソース、執筆（レビューおよび編集）。 SH: 形式分析、ソフトウェア、執筆（レビューおよび編集）。 SA: 調査、執筆（レビューおよび編集）。 主任審査員: 調査、執筆（レビューおよび編集）。 SN: 概念化、プロジェクト管理、リソース、監督、執筆（レビューおよび編集）。 TA: 概念化、プロジェクト管理、監督、執筆（レビューおよび編集）。
著者らは、本論文の研究、執筆、および／または出版に関して、いかなる資金援助も受けていないことを表明する。
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投稿日時：2025年4月18日