抗真菌剤で一般的な食事添加物であるプロピオン酸（PPA）は、マウスで異常な神経発達を引き起こし、消化管機能障害を伴うことが示されており、これは腸内細菌叢の乱れによって引き起こされる可能性がある。食事性PPA曝露と腸内細菌叢の乱れとの関連は示唆されているが、直接調査されたことはない。本研究では、PPAが腸内細菌叢の構成に及ぼす乱れが、腸内細菌叢の乱れにつながる可能性について調査した。無処理食（n=9）とPPA強化食（n=13）を摂取したマウスの腸内細菌叢を長距離メタゲノムシーケンス法で解析し、微生物構成と細菌代謝経路の違いを評価した。食事性PPAは、これまでPPA産生への関与が示唆されてきたバクテロイデス属、プレボテラ属、ルミノコッカス属などの重要な分類群の増加と関連していた。 PPAに曝露されたマウスのマイクロバイオームには、脂質代謝とステロイドホルモン生合成に関連する経路も増加していました。私たちの研究結果は、PPAが腸内細菌叢とそれに関連する代謝経路を変化させる可能性があることを示唆しています。これらの観察された変化は、摂取しても安全と分類されている防腐剤が腸内細菌叢の構成、ひいてはヒトの健康に影響を与える可能性があることを浮き彫りにしています。 分析する分類レベルに応じて、P、G、またはSが選択されます。偽陽性分類の影響を最小限に抑えるために、最小相対存在量しきい値として1e-4（1/10,000リード）が採用されました。統計分析の前に、Brackenによって報告された相対存在量（fraction_total_reads）は、中心対数比（CLR）変換（Aitchison、1982）を使用して変換されました。データ変換には、スケール不変で非スパースデータセットに十分であるため、CLR法が選択されました（Gloor et al.、2017）。CLR変換では自然対数を使用します。Brackenによって報告されたカウントデータは、相対対数表現（RLE）（Anders and Huber、2010）を使用して正規化されました。図は、matplotlib v. 3.7.1、seaborn v. 3.7.2、および逐次対数（Gloor et al.、2017）の組み合わせを使用して生成されました。 0.12.2およびstantanotations v. 0.5.0（Hunter、2007; Waskom、2021; Charlier et al.、2022）を使用して、各サンプルのバチルス/バクテロイデス比を正規化された細菌数を使用して計算しました。表に報告されている値は、小数点以下4桁に丸められています。シンプソン多様性指数は、KrakenTools v. 1.2パッケージ（Lu et al.、2022）で提供されるalpha_diversity.pyスクリプトを使用して計算されました。Brackenレポートはスクリプトで提供され、シンプソン指数「Si」は-anパラメーターに対して提供されます。存在量の有意差は、平均CLR差≥1または≤-1として定義されました。平均CLR差±1は、サンプルタイプの存在量が2.7倍増加することを示します。符号（+/-）は、分類群がPPAサンプルとコントロールサンプルのどちらでより豊富であるかを示します。有意差はMann-Whitney U検定（Virtanen et al., 2020）を用いて判定した。Statsmodels v. 0.14（Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010）を使用し、多重検定の補正にはBenjamini-Hochberg法を適用した。統計的有意差判定の閾値として、調整p値≤0.05を用いた。
ヒトマイクロバイオームはしばしば「人体最後の臓器」と呼ばれ、ヒトの健康に極めて重要な役割を果たしています（Baquero and Nombela, 2012）。特に、腸内マイクロバイオームは、全身に影響を及ぼすだけでなく、多くの重要な機能において重要な役割を果たしていることが知られています。腸内には常在細菌が豊富に存在し、多様な生態学的地位を占め、栄養素を利用し、潜在的な病原体と競合しています（Jandhyala et al., 2015）。腸内マイクロバイオームを構成する多様な細菌成分は、ビタミンなどの必須栄養素を産生し、消化を促進する能力を持っています（Rowland et al., 2018）。細菌代謝産物は、組織の発達に影響を与え、代謝経路と免疫経路を強化することも示されています（Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022）。ヒトの腸内微生物叢の構成は非常に多様であり、食事、性別、投薬、健康状態などの遺伝的要因と環境的要因に依存します (Kumbhare et al.、2019)。
母親の食事は胎児および新生児の発育に不可欠な要素であり、発育に影響を与える可能性のある化合物の推定供給源です (Bazer et al., 2004; Innis, 2014)。そのような興味深い化合物の1つがプロピオン酸 (PPA) です。これは、細菌発酵によって得られる短鎖脂肪酸の副産物であり、食品添加物でもあります (den Besten et al., 2013)。PPA には抗菌・抗真菌作用があるため、食品保存料として、また工業用途ではカビや細菌の増殖を抑制するために使用されています (Wemmenhove et al., 2016)。PPA は組織によって作用が異なります。肝臓では、マクロファージのサイトカイン発現に作用することで抗炎症作用を示します (Kawasoe et al., 2022)。この調節作用は他の免疫細胞でも観察されており、炎症のダウンレギュレーションにつながっています (Haase et al., 2021)。しかし、脳では逆の作用が観察されています。これまでの研究では、PPAへの曝露がマウスに自閉症様行動を引き起こすことが示されています（El-Ansary et al., 2012）。また、PPAが脳内のグリオーシスを誘発し、炎症誘発経路を活性化する可能性があることも示されています（Abdelli et al., 2019）。PPAは弱酸であるため、腸管上皮を通過して血流に拡散し、血液脳関門や胎盤などの制限的な障壁を通過できます（Stinson et al., 2019）。これは、細菌によって産生される調節性代謝物としてのPPAの重要性を浮き彫りにしています。PPAが自閉症のリスク因子として潜在的に果たす役割は現在調査中ですが、自閉症患者への影響は神経分化の誘導だけにとどまらない可能性があります。
神経発達障害患者では、下痢や便秘などの消化器症状がよく見られます（Cao et al., 2021）。これまでの研究では、自閉スペクトラム症（ASD）患者のマイクロバイオームは健常者とは異なり、腸内細菌叢の異常（dysbiosis）の存在が示唆されています（Finegold et al., 2010）。同様に、炎症性腸疾患、肥満、アルツハイマー病などの患者のマイクロバイオームの特徴も健常者とは異なります（Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019）。しかし、現在まで腸内細菌叢と神経疾患または神経症状との因果関係は確立されていません（Yap et al., 2021）。ただし、いくつかの細菌種がこれらの病態の一部に関与していると考えられています。例えば、アッカーマンシア属、バクテロイデス属、クロストリジウム属、ラクトバチルス属、デスルフォビブリオ属などの属は、自閉症患者の微生物叢においてより豊富に存在します（Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020）。特に、これらの属の一部に属する種は、PPA産生に関連する遺伝子を有することが知られています（Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023）。PPAの抗菌特性を考慮すると、PPAの存在量の増加はPPA産生細菌の増殖に有益である可能性があります（Jacobson et al., 2018）。したがって、PFA が豊富な環境は、胃腸病原体を含む腸内細菌叢の変化につながる可能性があり、これが胃腸症状につながる潜在的な要因となる可能性があります。
マイクロバイオーム研究における中心的な問いは、微生物組成の違いが基礎疾患の原因となるのか、それとも症状となるのかということです。食事、腸内マイクロバイオーム、そして神経疾患との複雑な関係を解明するための第一歩は、食事が微生物組成に及ぼす影響を評価することです。この目的のため、我々はロングリードメタゲノムシーケンシングを用いて、PPAを多く含む食餌とPPAをほとんど含まない食餌を与えられたマウスの子孫の腸内マイクロバイオームを比較しました。子孫には母親と同じ食餌を与えました。PPAを多く含む食餌は、腸内微生物組成と微生物機能経路、特にPPA代謝および／またはPPA産生に関連する経路に変化をもたらすという仮説を立てました。
本研究では、セントラルフロリダ大学動物実験委員会（UCF-IACUC）（動物使用許可番号：PROTO202000002）のガイドラインに従い、グリア特異的GFAPプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を過剰発現するFVB/N-Tg（GFAP-GFP）14Mes/Jトランスジェニックマウス（Jackson Laboratories）を使用しました。離乳後、マウスはケージに雌雄各1～5匹ずつ個別に飼育しました。マウスには精製対照食（修正オープンラベル標準食、脂肪16 kcal%）またはプロピオン酸ナトリウム添加食（修正オープンラベル標準食、脂肪16 kcal%、プロピオン酸ナトリウム5,000 ppm含有）を自由摂取させました。使用したプロピオン酸ナトリウムの量は、総飼料重量1kgあたりPFA 5,000 mgに相当しました。これは、食品保存料として承認されているPPAの最高濃度です。本研究の準備として、親マウスには交配前の4週間、両方の飼料を与え、母マウスの妊娠期間中も継続しました。子マウス（22匹、対照群9匹（雄6匹、雌3匹）、PPA群13匹（雄4匹、雌9匹））は離乳後、母マウスと同じ飼料を5ヶ月間与え続けました。子マウスは5ヶ月齢で屠殺し、腸管糞便内容物を採取しました。採取した糞便は、1.5 mlマイクロ遠心管に入れて-20℃で保存し、その後、宿主DNAが枯渇し微生物の核酸が抽出されるまで-80℃の冷凍庫に移しました。
宿主DNAは、修正プロトコル（Charalampous et al., 2019）に従って除去した。簡単に説明すると、糞便内容物を500µlのInhibitEX（Qiagen、カタログ番号/ID：19593）に移し、凍結保存した。抽出ごとに最大1～2個の糞便ペレットを処理した。次に、糞便内容物をチューブ内でプラスチック製の乳棒を使用して機械的にホモジェナイズしてスラリーを形成した。サンプルを10,000 RCFで5分間、またはサンプルがペレットになるまで遠心分離し、上清を吸引してペレットを250µlの1×PBSに再懸濁した。真核細胞膜を緩めるための界面活性剤として、サンプルに250µlの4.4%サポニン溶液（TCI、製品番号S0019）を加えた。サンプルを滑らかになるまで穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートした。次に、真核細胞を破砕するため、サンプルにヌクレアーゼフリー水350 μlを加え、30秒間インキュベートした後、5 M NaCl 12 μlを添加した。サンプルを6000 RCFで5分間遠心分離した。上清を吸引し、ペレットを100 μlの1X PBSに再懸濁した。宿主DNAを除去するため、HL-SANバッファー100 μl（NaCl 12.8568 g、1M MgCl2 4 ml、ヌクレアーゼフリー水36 ml）とHL-SAN酵素10 μl（ArticZymes P/N 70910-202）を添加した。サンプルはピペッティングで十分に混合し、Eppendorf™ ThermoMixer Cを用いて37℃、800 rpmで30分間インキュベートした。インキュベーション後、6000 RCFで3分間遠心分離し、800 µLおよび1000 µLの1X PBSで2回洗浄した。最後に、ペレットを100 µLの1X PBSに再懸濁した。
全細菌DNAは、New England Biolabs MonarchゲノムDNA精製キット（New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ、カタログ番号T3010L）を使用して単離しました。キットに付属の標準操作手順を若干変更しています。最終溶出の操作前に、ヌクレアーゼフリー水を60°Cでインキュベートして維持します。10 µlのプロテイナーゼKと3 µlのRNase Aを各サンプルに加えます。次に、100 µlの細胞溶解バッファーを加え、穏やかに混合します。次に、サンプルをEppendorf™ ThermoMixer Cで56°C、1400 rpmで少なくとも1時間、最大3時間インキュベートしました。インキュベートしたサンプルを12,000 RCFで3分間遠心分離し、各サンプルの上清を400 µLの結合溶液を含む別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移しました。次に、チューブを 1 秒間隔で 5～10 秒間パルスボルテックスしました。各サンプルの全液体内容物 (約 600～700 µL) を、フロースルーコレクションチューブにセットしたフィルターカートリッジに移しました。チューブを 1,000 RCF で 3 分間遠心分離して最初の DNA 結合を可能にし、次に 12,000 RCF で 1 分間遠心分離して残留液体を除去しました。サンプルカラムを新しいコレクションチューブに移し、2 回洗浄しました。最初の洗浄では、各チューブに 500 µL の洗浄バッファーを加えます。チューブを 3～5 回転倒混和してから、12,000 RCF で 1 分間遠心分離します。コレクションチューブから液体を捨て、フィルターカートリッジを同じコレクションチューブに戻します。2 回目の洗浄では、転倒混和せずにフィルターに 500 µL の洗浄バッファーを加えます。サンプルは12,000 RCFで1分間遠心分離した。フィルターを1.5 mL LoBind®チューブに移し、予め温めておいたヌクレアーゼフリー水100 µLを加えた。フィルターは室温で1分間インキュベートした後、12,000 RCFで1分間遠心分離した。溶出したDNAは-80℃で保存した。
DNA濃度はQubit™ 4.0蛍光計を用いて定量しました。DNAは、Qubit™ 1X dsDNA高感度キット（カタログ番号Q33231）を用いて、メーカーの指示に従って調製しました。DNA断片長分布は、Aglient™ 4150または4200 TapeStationを用いて測定しました。DNAは、Agilent™ Genomic DNA Reagents（カタログ番号5067-5366）およびGenomic DNA ScreenTape（カタログ番号5067-5365）を用いて調製しました。ライブラリ調製は、Oxford Nanopore Technologies™（ONT）Rapid PCR Barcoding Kit（SQK-RPB004）を用いて、メーカーの指示に従って実施しました。DNAの配列決定は、Min106Dフローセル（R 9.4.1）を搭載したONT GridION™ Mk1シーケンサーを用いて行いました。シーケンス設定は、高精度ベースコーリング、最小Q値9、バーコードセットアップ、バーコードトリムでした。サンプルは72時間シーケンスされ、その後、ベースコールデータはさらなる処理と解析のために送信されました。
バイオインフォマティクス処理は、以前に記載された方法（Greenman et al., 2024）を用いて行われた。シーケンシングから得られたFASTQファイルは、各サンプルごとにディレクトリに分割された。バイオインフォマティクス解析の前に、以下のパイプラインを用いてデータを処理した。まず、サンプルのFASTQファイルを単一のFASTQファイルに統合した。次に、1000bp未満のリードはFiltlong v. 0.2.1を用いてフィルタリングした。変更されたパラメータは、–min_length 1000のみであった（Wick, 2024）。さらにフィルタリングを行う前に、NanoPlot v. 1.41.3を用いて以下のパラメータを用いてリード品質を管理した。–fastq –plots dot –N50 -o
分類学的分類には、Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) を用いてリードとアセンブルされたコンティグを分類しました。リードとアセンブリについて、それぞれレポートと出力ファイルを生成します。リードとアセンブリを解析するには、–use-names オプションを使用します。–gzip-compressed および –paired オプションは、リードセグメントに対して指定します。メタゲノムにおける分類群の相対的存在量は、Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) を用いて推定しました。まず、以下のパラメータを用いてbracken-buildを使用し、1000塩基からなるkmerデータベースを作成しました。-d
遺伝子アノテーションと相対存在量の推定は、Marangaら（Maranga et al., 2023）が報告したプロトコルの修正版を用いて実施した。まず、SeqKit v. 2.5.1（Shen et al., 2016）を用いて、すべてのアセンブリから500bp未満のコンティグを除去した。次に、選択されたアセンブリをパンメタゲノムに統合した。オープンリーディングフレーム（ORF）は、Prodigal v. 1.0.1（Prodigal v. 2.6.3の並列版）を用いて、以下のパラメータを用いて同定した。-d
遺伝子は、まずeggNOGによって割り当てられた京都遺伝子ゲノム百科事典（KEGG）オーソログ（KO）識別子に従ってグループ化され、遺伝子パスウェイの存在量を比較しました。ノックアウトのない遺伝子または多重ノックアウトの遺伝子は分析前に除去されました。次に、サンプルあたりの各KOの平均存在量が計算され、統計分析が実行されました。PPA代謝遺伝子は、KEGGに従ってプロピオン酸代謝における役割を示す、KEGG_Pathway列の行ko00640に割り当てられた遺伝子と定義されました。PPA産生に関連すると特定された遺伝子は、補足表1にリストされています（Reichardtら、2014年；Yangら、2017年）。順列検定を実行して、各サンプルタイプで有意に多いPPA代謝および産生遺伝子を特定しました。分析した遺伝子ごとに1000通りの順列が実行されました。統計的有意性を決定するためのカットオフとしてp値0.05を使用しました。機能アノテーションは、クラスター内の代表的な遺伝子のアノテーションに基づいて、クラスター内の個々の遺伝子に割り当てられました。PPA代謝および／またはPPA産生に関連する分類群は、Kraken2出力ファイル内のコンティグIDと、eggNOGを用いた機能アノテーション中に保持された同じコンティグIDを照合することで特定できました。有意差検定は、前述のMann-Whitney U検定を用いて実施しました。多重検定の補正は、Benjamini-Hochberg法を用いて実施しました。統計的有意性を判断するためのカットオフ値として、p値≤0.05を使用しました。
マウスの腸内マイクロバイオームの多様性をシンプソン多様性指数を用いて評価した。対照群とPPA群のサンプル間で、属および種の多様性に関して有意差は認められなかった（属のp値：0.18、種のp値：0.16）（図1）。次に、主成分分析（PCA）を用いて微生物組成を比較した。図2は、サンプルの門別クラスタリングを示しており、PPA群と対照群のサンプル間でマイクロバイオームの種組成に差があることを示している。このクラスタリングは属レベルではそれほど顕著ではなく、PPAが特定の細菌に影響を与えていることを示唆している（補足図1）。
図1. マウス腸内マイクロバイオームの属および種構成のアルファ多様性。PPAおよび対照サンプルにおける属（A）および種（B）のシンプソン多様性指数を示すボックスプロット。有意差はMann-Whitney U検定を用いて判定し、Benjamini-Hochberg法を用いて多重補正を行った。ns、p値は有意ではなかった（p>0.05）。
図2. マウス腸内マイクロバイオーム構成の種レベルでの主成分分析の結果。主成分分析プロットは、サンプルの最初の2つの主成分にわたる分布を示しています。色はサンプルの種類を示します。PPA曝露マウスは紫、対照マウスは黄色です。主成分1と主成分2はそれぞれx軸とy軸にプロットされ、説明分散比として表されています。
RLE変換されたカウントデータを用いたところ、対照群およびPPAマウスにおいて、バクテロイデス／バチルス比の中央値が有意に低下したことが観察されました（対照群：9.66、PPA群：3.02、p値 = 0.0011）。この差は、PPAマウスにおけるバクテロイデスの存在量が対照群と比較して高かったことによるものですが、有意差はありませんでした（対照群の平均CLR：5.51、PPA群の平均CLR：6.62、p値 = 0.054）。一方、バクテロイデスの存在量は対照群と同程度でした（対照群の平均CLR：7.76、PPA群の平均CLR：7.60、p値 = 0.18）。
腸内マイクロバイオームの分類学的メンバーの存在量を解析した結果、PPAサンプルと対照サンプル間で1門77種に有意な差が認められました（補足表2）。PPAサンプルでは59種の菌種が対照サンプルよりも有意に多く存在しましたが、対照サンプルでは16種の菌種のみがPPAサンプルよりも多く存在しました（図3）。
図3。PPAマウスとコントロールマウスの腸内細菌叢における分類群の存在量の差。ボルケーノプロットは、PPAサンプルとコントロールサンプル間の属（A）または種（B）の存在量の差を示しています。灰色の点は、分類群の存在量に有意差がないことを示します。色付きの点は、存在量の有意な差（p値≤0.05）を示します。サンプルタイプ間で存在量の差が最も大きかった上位20の分類群は、それぞれ赤と水色（コントロールサンプルとPPAサンプル）で示されています。黄色と紫色の点は、コントロールまたはPPAサンプルの方がコントロールよりも少なくとも2.7倍豊富でした。黒色の点は、存在量が有意に異なる分類群を表し、平均CLR差は-1と1の間です。P値は、Mann-Whitney U検定を使用して計算され、Benjamini-Hochberg手順を使用して多重検定に対して補正されました。太字の平均CLR差は、存在量の有意な差を示しています。
腸内微生物組成を解析した後、マイクロバイオームの機能アノテーションを実施しました。低品質遺伝子を除外した結果、全サンプルにおいて合計378,355個の固有遺伝子が同定されました。これらの遺伝子の変換された存在量を主成分分析（PCA）に用いたところ、サンプルの種類ごとに機能プロファイルに基づく高度なクラスタリングが示されました（図4）。
図4. マウス腸内マイクロバイオームの機能プロファイルを用いたPCAの結果。PCAプロットは、サンプルの最初の2つの主成分にわたる分布を示しています。色はサンプルの種類を示しています。PPA曝露マウスは紫、対照マウスは黄色です。主成分1と主成分2はそれぞれx軸とy軸にプロットされ、説明分散比として表されています。
次に、異なるサンプルタイプにおける KEGG ノックアウトの存在量を調べました。合計 3,648 個のユニークなノックアウトが特定され、そのうち 196 個はコントロールサンプルで有意に多く、106 個は PPA サンプルでより豊富でした (図 5)。コントロールサンプルでは合計 145 個の遺伝子、PPA サンプルでは 61 個の遺伝子が検出され、存在量が有意に異なっていました。脂質およびアミノ糖代謝に関連するパスウェイは、PPA サンプルで有意に多く含まれていました (補足表 3)。窒素代謝および硫黄リレーシステムに関連するパスウェイは、コントロールサンプルで有意に多く含まれていました (補足表 3)。アミノ糖/ヌクレオチド代謝 (ko:K21279) およびイノシトールリン酸代謝 (ko:K07291) に関連する遺伝子の存在量は、PPA サンプルで有意に多くなっていました (図 5)。対照サンプルでは、安息香酸代謝（ko:K22270）、窒素代謝（ko:K00368）、解糖系/糖新生（ko:K00131）に関連する遺伝子が有意に多く存在した（図5）。
図5. PPAマウスとコントロールマウスの腸内マイクロバイオームにおけるKOの存在量の差。ボルケーノプロットは、機能グループ（KO）の存在量の差を示しています。灰色の点は、サンプルタイプ間で存在量が有意に差がなかったKOを示しています（p値> 0.05）。色付きの点は、存在量に有意な差があることを示しています（p値≤ 0.05）。サンプルタイプ間で存在量の差が最も大きかった20個のKOは、それぞれコントロールサンプルとPPAサンプルに対応して、赤と水色で示されています。黄色と紫色の点は、それぞれコントロールサンプルとPPAサンプルで少なくとも2.7倍豊富だったKOを示しています。黒色の点は、平均CLR差が-1と1の間である、存在量が有意に異なるKOを示しています。P値は、Mann-Whitney U検定を使用して計算され、Benjamini-Hochberg手順を使用して多重比較のために調整されました。NaNは、KOがKEGGのパスウェイに属していないことを示します。太字で示された平均CLR差の値は、存在量に有意な差があることを示しています。記載されているKOが属する経路の詳細については、補足表3を参照してください。
注釈が付けられた遺伝子のうち、1601 個の遺伝子はサンプルタイプ間で存在量が有意に異なり (p ≤ 0.05)、各遺伝子は少なくとも 2.7 倍豊富でした。これらの遺伝子のうち、4 個の遺伝子はコントロールサンプルでより豊富で、1597 個の遺伝子は PPA サンプルでより豊富でした。PPA には抗菌作用があるため、サンプルタイプ間で PPA 代謝および生成遺伝子の存在量を調べました。1332 個の PPA 代謝関連遺伝子のうち、27 個の遺伝子はコントロールサンプルで有意に多く、12 個の遺伝子は PPA サンプルでより豊富でした。223 個の PPA 生成関連遺伝子のうち、1 個の遺伝子は PPA サンプルで有意に多くありました。図 6A はさらに、PPA 代謝に関与する遺伝子の存在量が多いことを示しており、コントロールサンプルで有意に多く、効果サイズが大きいことを示しています。一方、図 6B は、PPA サンプルで観察された有意に多い個々の遺伝子を強調表示しています。
図6. マウス腸内マイクロバイオームにおけるPPA関連遺伝子の差異。ボルケーノプロットは、PPA代謝（A）およびPPA産生（B）に関連する遺伝子の差異を示しています。灰色の点は、サンプルタイプ間で存在量に有意差がなかった遺伝子を示しています（p値> 0.05）。色付きの点は、存在量に有意な差があることを示しています（p値≤ 0.05）。存在量の差が最も大きい20個の遺伝子は、それぞれ赤と水色（コントロールサンプルとPPAサンプル）で示されています。黄色と紫色の点は、コントロールサンプルとPPAサンプルで、コントロールサンプルよりも少なくとも2.7倍多くありました。黒い点は、平均CLR差が-1と1の間の、存在量が有意に異なる遺伝子を表しています。P値は、Mann-Whitney U検定を使用して計算され、Benjamini-Hochberg法を使用して多重比較が補正されました。遺伝子は、非冗長遺伝子カタログの代表的な遺伝子に対応しています。遺伝子名は、KO遺伝子を示すKEGGシンボルで構成されています。太字の平均CLR差は、有意に異なる存在量を示します。ダッシュ（-）は、KEGGデータベースにその遺伝子のシンボルが存在しないことを示します。
PPA代謝および／または産生に関連する遺伝子を持つ分類群は、コンティグの分類学的IDと遺伝子のコンティグIDを照合することにより同定された。属レベルでは、130属がPPA代謝に関連する遺伝子を持ち、61属がPPA産生に関連する遺伝子を持つことが判明した（補足表4）。しかし、いずれの属も存在量に有意差は認められなかった（p > 0.05）。
種レベルでは、144 種の細菌が PPA 代謝に関連する遺伝子を持ち、68 種の細菌が PPA 生成に関連する遺伝子を持つことが判明しました (補足表 5)。PPA 代謝細菌のうち、8 種の細菌はサンプル タイプ間で存在量の有意な増加を示し、すべての細菌が効果に有意な変化を示しました (補足表 6)。存在量に有意な差があると特定されたすべての PPA 代謝細菌は、PPA サンプルでより豊富でした。種レベルの分類により、サンプル タイプ間で有意な差がない属の代表が明らかになり、これにはいくつかの Bacteroides および Ruminococcus 種、Duncania dubois、Myxobacterium enterica、Monococcus pectinolyticus、および Alcaligenes polymorpha が含まれます。PPA 生成細菌のうち、4 種の細菌はサンプル タイプ間で存在量に有意な差を示しました。存在量に大きな差があった種としては、Bacteroides novorossi、Duncania dubois、Myxobacterium enteritidis、および Ruminococcus bovis が挙げられます。
本研究では、マウスの腸内細菌叢に対するPPA曝露の影響を調査しました。PPAは特定の種によって産生され、他の種の食料源として使用され、抗菌作用を持つため、細菌にさまざまな反応を引き起こす可能性があります。そのため、食事性サプリメントとして腸内環境にPPAを追加すると、耐性、感受性、栄養源としての利用能力に応じてさまざまな影響が出る可能性があります。感受性の高い細菌種は排除され、PPAに対してより耐性があるか、またはPPAを食料源として利用できる細菌種に置き換わり、腸内細菌叢の構成が変化する可能性があります。私たちの結果は、微生物構成に有意な差があるものの、全体的な微生物多様性には影響がないことを明らかになりました。最も大きな影響は種レベルで観察され、PPAとコントロールサンプルの間で70以上の分類群の存在量に有意な差がありました（補足表2）。 PPAに曝露されたサンプルの組成をさらに評価したところ、曝露されていないサンプルと比較して微生物種の多様性が高まっていることが明らかになりました。これは、PPAが細菌の増殖特性を高め、PPAに富む環境で生存できる細菌集団を制限する可能性があることを示唆しています。したがって、PPAは腸内細菌叢の多様性を広範囲に破壊するのではなく、選択的に変化を誘発すると考えられます。
PPAなどの食品保存料は、腸内マイクロバイオームの構成要素の多様性全体に影響を与えることなく、その存在量を変化させることがこれまでに示されています（Nagpal et al., 2021）。本研究では、バクテロイデス門（旧称バクテロイデス門）内のバクテロイデス属菌種間で最も顕著な違いを観察しました。バクテロイデス属菌種は、PPA曝露マウスにおいて顕著に増加していました。バクテロイデス属菌種の増加は粘液分解の増加と関連しており、感染リスクの増大や炎症の促進につながる可能性があります（Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019）。ある研究では、バクテロイデス・フラギリスを投与された雄の新生仔マウスが自閉症スペクトラム障害（ASD）を想起させる社会行動を示したことが明らかになりました（Carmel et al., 2023）。また、他の研究では、バクテロイデス属が免疫活性を変化させ、自己免疫性炎症性心筋症を引き起こす可能性があることが示されています（Gil-Cruz et al., 2019）。また、PPAに曝露されたマウスでは、ルミノコッカス属、プレボテラ属、パラバクテロイデス属に属する菌種も有意に増加しました（Coretti et al., 2018）。特定のルミノコッカス属細菌は、炎症性サイトカインの産生を通じてクローン病などの疾患と関連しています（Henke et al., 2019）。一方、プレボテラ・ヒューマニなどのプレボテラ属細菌は、高血圧やインスリン感受性などの代謝性疾患と関連しています（Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017）。最後に、PPA曝露マウスでは対照マウスと比較して、バクテロイデス属（旧称フィルミクテス属）とバクテロイデス属の比率が有意に低下していることが分かりました。これは、バクテロイデス属の総量が増加したためです。この比率は以前に腸の恒常性の重要な指標であることが示されており、この比率の乱れは炎症性腸疾患（Stojanov et al., 2020）を含むさまざまな疾患状態（Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023）と関連付けられています。全体的に、バクテロイデス門の種は、食事性PPAの上昇によって最も強く影響を受けるようです。これは、PPAに対する耐性が高いか、PPAをエネルギー源として利用する能力による可能性があり、少なくとも1つの種、Hoylesella enoceaに当てはまることが示されています（Hitch et al., 2022）。あるいは、母親のPPA曝露は、マウスの子孫の腸をバクテロイデスのコロニー形成に対してより感受性にすることで胎児の発達を促進する可能性がありますが、私たちの研究デザインではそのような評価ができませんでした。
メタゲノム含有量評価により、PPA代謝および産生に関連する遺伝子の存在量に有意な差があることが明らかになりました。PPAに曝露されたマウスはPPA産生を担う遺伝子の存在量が高く、一方PPA非曝露マウスはPAA代謝を担う遺伝子の存在量が高くなりました（図6）。これらの結果は、PPAが微生物組成に及ぼす影響はPPAの使用のみによるものではないことを示唆しており、そうでなければ、PPA曝露マウスの腸内微生物叢においてPPA代謝に関連する遺伝子の存在量が高くなっているはずです。1つの説明として、PPAは栄養素として細菌によって利用されるのではなく、主にその抗菌効果によって細菌の存在量を媒介していると考えられます。これまでの研究では、PPAがサルモネラ・チフス菌の増殖を用量依存的に阻害することが示されている（Jacobson et al., 2018）。高濃度のPPAに曝露されると、その抗菌性に耐性を持つ細菌が選択される可能性があり、必ずしもPPAを代謝または産生できるとは限りません。例えば、いくつかの Parabacteroides 種は PPA サンプルで有意に高い存在量を示しましたが、PPA の代謝または生成に関連する遺伝子は検出されませんでした (補足表 2、4、および 5)。さらに、発酵副産物としての PPA 生成は、さまざまな細菌に広く分布しています (Gonzalez-Garcia et al., 2017)。細菌の多様性が高いことが、コントロールサンプルで PPA 代謝に関連する遺伝子の存在量が多い理由である可能性があります (Averina et al., 2020)。さらに、1332 個の遺伝子のうち、27 個 (2.14%) のみが PPA 代謝にのみ関連する遺伝子であると予測されました。PPA 代謝に関連する多くの遺伝子は、他の代謝経路にも関与しています。これはさらに、PPA 代謝に関与する遺伝子の存在量がコントロールサンプルで高かったことを示しています。これらの遺伝子は、PPA の利用または副産物としての形成につながらない経路で機能している可能性があります。この場合、PPA 生成に関連する 1 つの遺伝子のみが、サンプルタイプ間で存在量に有意な差を示しました。 PPA代謝に関連する遺伝子とは対照的に、PPA産生マーカー遺伝子は細菌のPPA産生経路に直接関与するため、選択された。PPAに曝露されたマウスでは、すべての種においてPPA産生量と能力が有意に増加した。これは、PPAがPPA産生者を選択し、その結果PPA産生能力が増加するという予測を裏付けている。しかし、遺伝子の豊富さは必ずしも遺伝子発現と相関するわけではない。そのため、PPA代謝に関連する遺伝子の豊富さは対照群で高いものの、発現率は異なる可能性がある（Shi et al., 2014）。PPA産生遺伝子の普及とPPA産生の関係を確認するためには、PPA産生に関与する遺伝子の発現に関する研究が必要である。
PPAおよびコントロールメタゲノムの機能アノテーションにより、いくつかの違いが明らかになりました。遺伝子含有量のPCA解析により、PPAサンプルとコントロールサンプルの間には明確なクラスターが認められました（図5）。サンプル内クラスタリングでは、コントロール遺伝子含有量はより多様であるのに対し、PPAサンプルはクラスターを形成していることが明らかになりました。遺伝子含有量によるクラスタリングは、種構成によるクラスタリングと同等でした。したがって、パスウェイの豊富さの違いは、特定の種およびその中の株の豊富さの変化と一致しています。PPAサンプルでは、有意に豊富であった2つのパスウェイは、アミノ糖／ヌクレオチド糖代謝（ko:K21279）と複数の脂質代謝パスウェイ（ko:K00647、ko:K03801、補足表3）に関連していました。ko:K21279に関連する遺伝子は、PPAサンプル中で有意に多くの種を含む属の一つであるBacteroides属に関連することが知られています。この酵素は、莢膜多糖を発現することで免疫応答を回避することができます（Wang et al., 2008）。これは、PPAに曝露されたマウスで観察されたバクテロイデス属細菌の増加を説明するものと考えられます。これは、PPAマイクロバイオームで観察された脂肪酸合成の増加を補完するものです。細菌はFASIIko:K00647（fabB）経路を利用して脂肪酸を産生しますが、これが宿主の代謝経路に影響を及ぼす可能性があります（Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020）。また、脂質代謝の変化は神経発達に関与している可能性があります（Yu et al., 2020）。PPAサンプルで増加を示したもう一つの経路は、ステロイドホルモン生合成（ko:K12343）でした。腸内細菌叢がホルモンレベルに影響を与える能力とホルモンの影響を受ける能力の間には逆相関関係があり、ステロイドレベルの上昇が下流の健康に影響を与える可能性があるという証拠が増えています（Tetel et al., 2018）。
この研究には限界や考慮すべき点がないわけではありません。重要な違いは、動物の生理学的評価を行っていないことです。したがって、マイクロバイオームの変化が何らかの疾患に関連しているかどうかを直接結論付けることはできません。もう1つの考慮事項は、この研究で使用したマウスには母親と同じ食事を与えられたことです。今後の研究では、PPAを多く含む食事からPPAを含まない食事に切り替えることで、マイクロバイオームへの影響が改善されるかどうかを判断できる可能性があります。他の多くの研究と同様に、本研究の限界の1つはサンプルサイズが限られていることです。有効な結論を導き出すことはできますが、サンプルサイズが大きいほど、結果を分析する際の統計的検出力が向上します。また、腸内マイクロバイオームの変化と何らかの疾患との関連性について結論を出すことにも慎重です（Yap et al., 2021）。年齢、性別、食事などの交絡因子は、微生物の構成に大きな影響を与える可能性があります。これらの要因は、腸内マイクロバイオームと複合疾患との関連に関する文献で観察される矛盾を説明できるかもしれない (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023)。例えば、バクテロイデス属のメンバーは、ASD の動物およびヒトで増加または減少していることがわかっている (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017)。同様に、炎症性腸疾患患者の腸内組成の研究では、同じ分類群で増加と減少の両方が見つかっている (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023)。性別による偏りの影響を制限するために、違いが食事によって引き起こされる可能性が最も高いように、男女が均等に表現されるように努めた。機能アノテーションの課題の 1 つは、冗長な遺伝子配列を削除することである。我々の遺伝子クラスタリング法では、誤ったクラスタリングを排除するために、95%の配列同一性、85%の長さ類似性、そして90%のアライメントカバレッジが求められます。しかしながら、いくつかのケースでは、同じアノテーションを持つCOG（例：MUT）が観察されました（図6）。これらのオーソログがそれぞれ異なるものなのか、特定の属に関連しているのか、あるいは遺伝子クラスタリング手法の限界なのかを判断するには、さらなる研究が必要です。機能アノテーションのもう一つの限界は、誤分類の可能性です。細菌遺伝子mmdAはプロピオン酸合成に関与する酵素として知られていますが、KEGGではこれをプロピオン酸代謝経路に関連付けていません。一方、scpBとmmcDのオーソログは関連しています。ノックアウトが指定されていない遺伝子が多数存在するため、遺伝子存在量を評価する際、PPA関連遺伝子を特定できない可能性があります。今後の研究では、腸内細菌叢の機能特性をより深く理解し、遺伝子発現と下流への影響を結び付けることができるメタトランスクリプトーム解析が役立つでしょう。特定の神経発達障害や炎症性腸疾患に関する研究では、マイクロバイオーム構成の変化とこれらの疾患との関連性を明らかにするために、動物を用いた生理学的および行動学的評価が必要です。腸内マイクロバイオームを無菌マウスに移植する追加研究も、マイクロバイオームが疾患の誘因となるのか、あるいは疾患の特徴となるのかを明らかにする上で有用です。
要約すると、食事性PPAが腸内細菌叢の構成を変化させる要因として作用することを実証しました。PPAはFDA承認の防腐剤であり、様々な食品に広く含まれていますが、長期曝露により正常な腸内細菌叢の破壊につながる可能性があります。いくつかの細菌の存在量に変化が見られたことから、PPAが腸内細菌叢の構成に影響を与える可能性があることが示唆されます。細菌叢の変化は、特定の代謝経路のレベルの変化につながり、それが宿主の健康に関連する生理学的変化につながる可能性があります。食事性PPAが微生物構成に及ぼす影響が、腸内細菌叢の乱れやその他の疾患につながるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。本研究は、PPAが腸内構成に及ぼす影響がヒトの健康にどのような影響を与えるかについての今後の研究の基礎を築くものです。
本研究で提示されたデータセットは、オンラインリポジトリで公開されています。リポジトリ名とアクセッション番号は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/、PRJNA1092431です。
この動物実験は、セントラルフロリダ大学動物実験委員会（UCF-IACUC）の承認を得ました（動物使用許可番号：PROTO202000002）。本研究は、現地の法律、規制、および機関の要件に準拠しています。
NG：概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、ソフトウェア、視覚化、執筆（原稿）、執筆（レビューと編集）。LA：概念化、データキュレーション、方法論、リソース、執筆（レビューと編集）。SH：形式分析、ソフトウェア、執筆（レビューと編集）。SA：調査、執筆（レビューと編集）。審査委員長：調査、執筆（レビューと編集）。SN：概念化、プロジェクト管理、リソース、監督、執筆（レビューと編集）。TA：概念化、プロジェクト管理、監督、執筆（レビューと編集）。
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投稿日時: 2025年4月18日