免疫調節代謝物は腫瘍微小環境（TME）の重要な特徴であるが、いくつかの例外を除いて、その正体はほとんど不明のままである。本研究では、高悪性度漿液性癌（HGSC）患者の腫瘍および腹水から得られた腫瘍とT細胞を分析し、これらの異なるTMEコンパートメントのメタボロームを明らかにした。腹水と腫瘍細胞には広範な代謝物の違いが見られた。腹水と比較して、腫瘍浸潤T細胞では1-メチルニコチンアミド（MNA）が有意に豊富であった。T細胞中のMNAレベルは上昇しているが、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（S-アデノシルメチオニンからニコチンアミドへのメチル基転移を触媒する酵素）の発現は線維芽細胞と腫瘍細胞に限られていた。機能的には、MNAはT細胞に腫瘍促進性サイトカインである腫瘍壊死因子αを分泌させる。したがって、TME由来のMNAはT細胞の免疫調節に寄与し、ヒトがん治療における潜在的な免疫療法標的となる。
腫瘍由来の代謝産物は抗腫瘍免疫に深刻な抑制効果をもたらす可能性があり、疾患進行の主要な推進力としても機能することがますます多くの証拠によって示されている（1）。ワールブルク効果に加えて、最近の研究では、腫瘍細胞の代謝状態と腫瘍微小環境（TME）の免疫状態との関係を特徴づけ始めている。マウスモデルとヒトT細胞を用いた研究では、グルタミン代謝（2）、酸化代謝（3）、グルコース代謝（4）がさまざまな免疫細胞サブグループに独立して作用することが示されている。これらの経路のいくつかの代謝産物はT細胞の抗腫瘍機能を阻害する。補酵素テトラヒドロビオプテリン（BH4）の阻害がT細胞の増殖を阻害し、体内のBH4の増加がCD4およびCD8を介した抗腫瘍免疫応答を増強することが証明されている。さらに、キヌレニンの免疫抑制効果はBH4の投与によって回復させることができる（5）。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（IDH）変異型神経膠芽腫では、エナンチオメタボリック（R）-2-ヒドロキシグルタル酸（R-2-HG）の分泌により、T細胞の活性化、増殖、細胞溶解活性が阻害される（6）。最近、解糖系の副産物であるメチルグリオキサールが骨髄由来の抑制細胞によって産生され、メチルグリオキサールのT細胞移行がエフェクターT細胞の機能を阻害することが示された。治療において、メチルグリオキサールを中和することで、骨髄由来抑制細胞（MDSC）の活性を克服し、マウスモデルにおけるチェックポイント阻害療法を相乗的に強化することができる（7）。これらの研究は、TME由来代謝物がT細胞の機能と活性の調節において重要な役割を担っていることを総合的に強調している。
卵巣癌ではT細胞機能不全が広く報告されている（8）。これは、低酸素症や異常な腫瘍血管系に固有の代謝特性（9）が原因の一つであり、その結果、グルコースやトリプトファンが乳酸やキヌレニンなどの副産物に変換される。過剰な細胞外乳酸はインターフェロンγ（IFN-γ）の産生を減少させ、骨髄抑制性サブグループの分化を促進する（10、11）。トリプトファンの消費はT細胞の増殖を直接阻害し、T細胞受容体シグナル伝達を阻害する（12-14）。これらの観察にもかかわらず、免疫代謝に関する多くの研究は、最適化された培地を用いたin vitro T細胞培養で行われたか、in vivoで同種のマウスモデルに限定されており、いずれもヒト癌の異質性や生理学的マクロおよびミクロ環境を完全に反映していない。
卵巣がんの一般的な特徴は、腹膜播種と腹水の出現である。腹水中の細胞液の蓄積は、進行した疾患と予後不良に関連している（15）。報告によると、この特異な区画は低酸素状態であり、血管内皮増殖因子（VEGF）とインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）のレベルが高く、制御性T細胞と骨髄抑制性T細胞が浸潤している（15-18）。腹水の代謝環境は腫瘍自体の代謝環境とは異なる可能性があるため、腹腔内でのT細胞の再プログラミングは不明である。さらに、腹水と腫瘍環境に存在する代謝物との間の重要な違いと不均一性は、免疫細胞の浸潤と腫瘍に対するその機能を阻害する可能性があり、さらなる研究が必要である。
これらの問題を解決するために、高感度細胞分離および液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（LC-MS/MS）を設計し、異なる細胞型（CD4 + T 細胞および CD8 + T 細胞を含む）や腫瘍内および腫瘍間の代謝物を研究しました。その代謝物は、患者の同じ腹水および腫瘍環境内の細胞に及びます。この方法を高次元フローサイトメトリーおよびシングルセル RNA シーケンス（scRNA-seq）と組み合わせて使用​​し、これらの主要な集団の代謝状態の高解像度プロファイルを提供します。この方法により、腫瘍 T 細胞における 1-メチルニコチンアミド（MNA）レベルの有意な増加が明らかになり、in vitro 実験では、MNA の T 細胞機能に対する免疫調節効果がこれまで知られていなかったことが示されました。一般的に、この方法は、腫瘍と免疫細胞間の相互代謝相互作用を明らかにし、免疫調節代謝物に関する独自の洞察を提供し、T 細胞ベースの卵巣がん免疫療法の治療に役立つ可能性があります。
高次元フローサイトメトリーを用いて、グルコース取り込み[2-(N-(7-ニトロフェニル-2-オキサ-1,3-ジアザ-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース(2-NBDG)]とミトコンドリア活性[MitoTracker Deep Red (MT DR)](7, 19, 20)を同時に定量しました。これらは免疫細胞と腫瘍細胞集団を区別する典型的なマーカーです(表S2および図S1A)。この分析により、T細胞と比較して、腹水と腫瘍細胞はグルコース取り込みレベルが高いものの、ミトコンドリア活性の差は小さいことが示されました。腫瘍細胞[CD45-EpCAM(EpCAM)+]の平均グルコース取り込みはT細胞の3～4倍であり、CD4+T細胞の平均グルコース取り込みはCD8+T細胞の1.2倍であることから、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は同じTME内でも代謝要求が異なることが示唆される（図1A）。一方、腫瘍細胞のミトコンドリア活性はCD4+T細胞のものと類似しており、両細胞型のミトコンドリア活性はCD8+T細胞よりも高い（図1B）。一般的に、これらの結果は代謝レベルを明らかにしている。腫瘍細胞の代謝活性はCD4+T細胞よりも高く、CD4+T細胞の代謝活性はCD8+T細胞よりも高い。細胞の種類によってこのような影響があるにもかかわらず、腹水中のCD4 + T細胞とCD8 + T細胞の代謝状態や相対的な割合は、腫瘍と比較して一貫して違いはありません（図1C）。対照的に、CD45-細胞分画では、腫瘍中のEpCAM+細胞の割合は腹水中と比較して増加しました（図1D）。また、EpCAM+細胞成分とEpCAM-細胞成分の間には明確な代謝の違いが見られました。EpCAM+（腫瘍）細胞は、EpCAM-細胞よりもグルコース取り込みとミトコンドリア活性が高く、これはTME内の腫瘍細胞における線維芽細胞の代謝活性よりもはるかに高い値です（図1、EおよびF）。
(A および B) CD4 + T 細胞のグルコース取り込み (2-NBDG) の中央蛍光強度 (MFI) (A) およびミトコンドリア活性 (MitoTracker 濃い赤) (B) 腹水および腫瘍からの CD8 + T 細胞および EpCAM + CD45-腫瘍細胞の代表的なグラフ (左) および表形式データ (右)。 (C) 腹水および腫瘍中の CD4 + 細胞と CD8 + 細胞 (CD3 + T 細胞) の比率。 (D) 腹水および腫瘍中の EpCAM + 腫瘍細胞 (CD45−) の割合。 (E および F) EpCAM + CD45-腫瘍および EpCAM-CD45-マトリックスのグルコース取り込み (2-NBDG) (E) およびミトコンドリア活性 (MitoTracker 濃い赤) (F) の代表的なグラフ (左) および表形式データ (右) 腹水および腫瘍細胞。 (G) フローサイトメトリーによる CD25、CD137、PD1 発現の代表的なグラフ。(H および I) CD4 + T 細胞 (H) および CD8 + T 細胞 (I) における CD25、CD137、PD1 の発現。(J および K) CCR7 および CD45RO の発現に基づくナイーブ、セントラル メモリー (Tcm)、エフェクター (Teff)、エフェクター メモリー (Tem) 表現型。腹水および腫瘍中の CD4 + T 細胞 (J) および CD8 + T 細胞 (K) の代表的な画像 (左) および表形式データ (右)。P 値は、対応のある t 検定により決定 (*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。線は、対応する患者 (n = 6) を表す。FMO、蛍光マイナス 1。MFI、中央蛍光強度。
さらなる解析により、高解像度の T 細胞表現型状態の間に他の重要な違いが明らかになった。腫瘍中の活性化 (図 1、G ～ I) およびエフェクター メモリー (図 1、J および K) は、腹水 (CD3 + T 細胞の割合) よりもはるかに多い。同様に、活性化マーカー (CD25 および CD137) および枯渇マーカー [プログラム細胞死タンパク質 1 (PD1)] の発現による表現型の解析では、これらの集団の代謝特性は異なるものの (図 S1、B ～ E)、ナイーブ、エフェクター、またはメモリーのサブセット間で一貫して有意な代謝の違いは観察されなかった (図 S1、F ～ I)。これらの結果は、機械学習法を使用して細胞表現型を自動的に割り当てることによって確認され (21)、患者の腹水中に多数の骨髄細胞 (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) が存在することがさらに明らかになった (図 S2A)。同定されたすべての細胞型の中で、この骨髄系細胞集団は最も高いグルコース取り込みとミトコンドリア活性を示した（図S2、B～G）。これらの結果は、HGSC患者の腹水および腫瘍に見られる複数の細胞型間の代謝における大きな違いを浮き彫りにしている。
TILのメタボローム特性を理解する上での主な課題は、腫瘍から十分な純度、品質、量のT細胞サンプルを分離する必要があることです。最近の研究では、フローサイトメトリーに基づくソーティングおよびビーズ濃縮法が細胞代謝プロファイルの変化につながる可能性があることが示されています（22-24）。この問題を克服するために、LC-MS/MSによる分析の前に、外科的に切除されたヒト卵巣癌からTILを分離するためのビーズ濃縮法を最適化しました（材料と方法を参照、図2A）。このプロトコルが代謝物の変化に及ぼす全体的な影響を評価するために、上記のビーズ分離ステップ後に健常ドナーによって活性化されたT細胞の代謝プロファイルを、ビーズ分離せずに氷上に残した細胞と比較しました。この品質管理分析により、これら2つの条件間に高い相関関係（r = 0.77）があり、86の代謝物グループの技術的再現性が高いことがわかりました（図2B）。したがって、これらの方法は細胞型濃縮中の細胞で正確な代謝物分析を実行できるため、HGSCにおける特定の代謝物を同定するための最初の高解像度プラットフォームを提供し、それによって人々は細胞特異性性代謝プログラムについてより深い理解を得ることができます。
(A) 磁気ビーズ濃縮の概略図。LC-MS/MSによる分析の前に、細胞は3回連続して磁気ビーズ濃縮を受けるか、氷上に保管されます。(B) 濃縮タイプが代謝物の存在量に及ぼす影響。各濃縮タイプについて3回の測定値の平均±SE。灰色の線は1:1の関係を表します。軸ラベルには、繰り返し測定の級内相関係数(ICC)が示されています。NADはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドです。(C) 患者の代謝物分析のワークフローの概略図。腹水または腫瘍は患者から採取され、凍結保存されます。各サンプルのごく一部はフローサイトメトリーで分析され、残りのサンプルはCD4+、CD8+、CD45-細胞について3回の濃縮を受けました。これらの細胞分画はLC-MS/MSを使用して分析されました。(D) 標準化された代謝物存在量のヒートマップ。デンドログラムは、サンプル間のユークリッド距離のWardクラスタリングを表します。 （E）サンプル代謝物マップの主成分分析（PCA）。各サンプルの3つの複製を示し、同じ患者からのサンプルは線で結ばれています。（F）患者に基づいて条件付けられたサンプルの代謝物プロファイルのPCA（つまり、部分的な冗長性を使用）。サンプルタイプは凸包によって制限されます。PC1は主成分1、PC2は主成分2です。
次に、この濃縮法を応用して、HGSC患者6人の原発性腹水および腫瘍中のCD4+、CD8+、CD45-細胞画分中の99種類の代謝物を分析しました（図2C、図S3A、表S3およびS4）。対象となる細胞集団は、元の生細胞の大きなサンプルの2%から70%を占め、細胞の割合は患者によって大きく異なります。ビーズを分離した後、濃縮された対象画分（CD4+、CD8+またはCD45-）は、平均してサンプル中の全生細胞の85%以上を占めます。この濃縮法により、大きなサンプルでは不可能なヒト腫瘍組織の代謝から細胞集団を分析することが可能になります。このプロトコルを使用して、よく特徴づけられた2つの免疫抑制代謝物であるl-キヌレニンとアデノシンが、腫瘍T細胞または腫瘍細胞で上昇していることを確認しました（図S3、BおよびC）。したがって、これらの結果は、患者組織中の生物学的に重要な代謝物を検出する上で、当社の細胞分離および質量分析技術の信頼性と能力を実証するものである。
また、我々の分析では、患者内および患者間で細胞型の代謝的分離が顕著であることが明らかになった（図2Dおよび図S4A）。特に、他の患者と比較して、患者70は異なる代謝特性を示しており（図2Eおよび図S4B）、患者間で代謝的異質性がかなり大きい可能性があることを示唆している。注目すべきは、他の患者（1.2～2リットル、表S1）と比較して、患者70で採取された腹水の総量（80ml）が少なかったことである。主成分分析中の患者間異質性の制御（例えば、部分冗長性分析の使用）では、細胞型間で一貫した変化が示され、代謝プロファイルに従って細胞型および／または微小環境が明確に集約されている（図2F）。単一代謝物の分析では、これらの効果が強調され、細胞型と微小環境の間に有意な差があることが明らかになった。注目すべきは、観察された最も極端な違いはMNAであり、これは通常CD45-細胞、および腫瘍に浸潤するCD4+細胞とCD8+細胞に豊富に存在する（図3A）。CD4+細胞ではこの効果が最も顕著であり、CD8+細胞のMNAも環境の影響を強く受けているように見える。しかし、6人の患者のうち3人しか腫瘍CD8+スコアを評価できないため、これは重要ではない。腹水と腫瘍の異なる種類の細胞では、MNAに加えて、TILで十分に特徴付けられていない他の代謝物も異なって豊富に存在する（図S3およびS4）。したがって、これらのデータは、今後の研究にとって有望な免疫調節代謝物群を明らかにしている。
(A) 腹水および腫瘍由来の CD4+、CD8+、CD45- 細胞における MNA の正規化含有量。ボックスプロットは、中央値 (線)、四分位範囲 (枠のヒンジ)、および四分位範囲の 1.5 倍までのデータ範囲 (枠のひげ) を示します。患者の材料と方法に記載されているように、患者の limma 値を使用して P 値を決定してください (*P<0.05 および **P<0.01)。(B) MNA 代謝の概略図 (60)。代謝物: S-アデノシル-1-メチオニン; SAH、S-アデノシン-1-ホモシステイン; NA、ニコチンアミド; MNA、1-メチルニコチンアミド; 2-PY、1-メチル-2-ピリドン-5-カルボキサミド; 4-PY、1-メチル-4-ピリドン-5-カルボキサミド; NR、ニコチンアミドリボース; NMN、ニコチンアミドモノヌクレオチド。酵素（緑）：NNMT、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ；SIRT、サーチュイン；NAMPT、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ；AOX1、アルデヒドオキシダーゼ1；NRK、ニコチンアミドリボシドキナーゼ；NMNAT、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニル酸トランスフェラーゼ；Pnp1、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ。（C）腹水（灰色）と腫瘍（赤；n = 3人の患者）のscRNA-seqのt-SNE。（D）scRNA-seqを使用して同定された異なる細胞集団におけるNNMTの発現。（E）SK-OV-3、ヒト胎児腎臓（HEK）293T、T細胞、およびMNA処理T細胞におけるNNMTとAOX1の発現。折り畳まれた発現はSK-OV-3に対する相対値で示されている。 SEMによる発現パターンを示します（n = 6人の健常ドナー）。Ct値が35を超える場合は検出不能（UD）とみなされます。（F）SK-OV-3、HEK293T、T細胞、および8mM MNAで処理したT細胞におけるSLC22A1およびSLC22A2の発現。SK-OV-3に対する相対的な発現量を示します。SEMによる発現パターンを示します（n = 6人の健常ドナー）。Ct値が35を超える場合は検出不能（UD）とみなされます。（G）MNAで72時間培養した後の活性化健常ドナーT細胞における細胞内MNA含有量。SEMによる発現パターンを示します（n = 4人の健常ドナー）。
MNAは、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（NNMT）によってS-アデノシル-1-メチオニン（SAM）からニコチンアミド（NA）にメチル基が転移されることで生成されます（図3B）。NNMTは様々なヒト癌で過剰発現しており、増殖、浸潤、転移と関連しています（25-27）。TMEにおけるT細胞のMNAの起源をよりよく理解するために、scRNA-seqを使用して、3人のHGSC患者の腹水と腫瘍における細胞種全体にわたるNNMTの発現を特徴付けました（表S5）。約6,500個の細胞の解析により、腹水と腫瘍環境では、NNMTの発現は線維芽細胞と腫瘍細胞集団に限定されていることが示されました（図3、CおよびD）。 PTPRC (CD45 +) を発現するどの集団にも明らかな NNMT 発現が見られないことは注目に値する (図 3D および図 S5A)。これは、代謝物スペクトルで検出された MNA が T 細胞に導入されたことを示している。アルデヒド オキシダーゼ 1 (AOX1) の発現は、MNA を 1-メチル-2-ピリドン-5-カルボキサミド (2-PYR) または 1-メチル-4-ピリドン-5-カルボキサミド (4-PYR) に変換する。図 3B) も COL1A1 を発現する線維芽細胞の集団に限定されている (図 S5A)。これらを総合すると、T 細胞は従来の MNA 代謝能力を欠いていることがわかる。これらの MNA 関連遺伝子の発現パターンは、HGSC 患者の腹水から得られた 2 番目の独立した細胞データセットを使用して検証された (図 S5B; n = 6) (16)。さらに、MNAで処理した健常ドナーT細胞の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析では、対照のSK-OV-3卵巣腫瘍細胞と比較して、NNMTまたはAOX1の発現がほとんど見られなかった（図3E）。これらの予想外の結果は、MNAが線維芽細胞または腫瘍からTME内の隣接するT細胞に分泌される可能性を示唆している。
候補としては、可溶性キャリア22（SLC22）ファミリー（SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3）によってコードされる有機カチオントランスポーター1～3（OCT1、OCT2、OCT3）ファミリーが含まれるが、MNAの潜在的なトランスポーターはまだ特定されていない（28）。健常ドナーT細胞のmRNAのqPCRでは、SLC22A1の発現レベルは低かったが、SLC22A2のレベルは検出されず、これは以前に文献で報告されていたことを確認した（図3F）（29）。対照的に、SK-OV-3卵巣腫瘍細胞株は両方のトランスポーターを高レベルで発現していた（図3F）。
T細胞が外来性MNAを取り込む能力を持つ可能性を検証するため、健常ドナーのT細胞を様々な濃度のMNA存在下で72時間培養した。外因性MNAが存在しない場合、細胞内のMNA含有量は検出されなかった（図3G）。しかし、外因性MNAで処理した活性化T細胞では、細胞内のMNA含有量が用量依存的に増加し、最大6 mMのMNAまで増加した（図3G）。この結果は、輸送体の発現レベルが低く、細胞内MNA代謝を担う主要酵素が欠如しているにもかかわらず、TILがMNAを取り込むことができることを示している。
患者の T 細胞における代謝産物のスペクトルと、in vitro での MNA 吸収実験から、癌関連線維芽細胞 (CAF) が MNA を分泌し、腫瘍細胞が TIL の表現型と機能を調節する可能性が高まっている。MNA が T 細胞に及ぼす影響を調べるため、健常ドナーの T 細胞を MNA の存在下または非存在下で in vitro で活性化し、その増殖とサイトカイン産生を評価した。最高用量の MNA を 7 日間添加した後、集団倍加数は中程度に減少したが、すべての用量で活力は維持された (図 4A)。さらに、外因性 MNA の処理により、腫瘍壊死因子-α (TNFα) を発現する CD4 + および CD8 + T 細胞の割合が増加した (図 4B)。対照的に、細胞内 IFN-γ 産生は CD4 + T 細胞では有意に減少したが、CD8 + T 細胞では減少せず、インターロイキン 2 (IL-2) には有意な変化はなかった (図 4、C および D)。したがって、これらのMNA処理T細胞培養の上清の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）では、TNFαの有意な増加、IFN-γの減少、IL-2の変化なしが示された（図4、E～G）。IFN-γの減少は、MNAがT細胞の抗腫瘍活性の阻害に役割を果たしている可能性を示唆している。MNAのT細胞媒介細胞傷害性への影響をシミュレートするために、葉酸受容体αを標的とするキメラ抗原受容体T（FRα-CAR-T）細胞と緑色蛍光タンパク質（GFP）で制御されるCAR-T（GFP-CAR-T）細胞は、健常ドナー末梢血単核細胞（PBMC）によって産生される。CAR-T細胞はMNAの存在下で24時間培養され、その後、葉酸受容体αを発現するヒトSK-OV-3卵巣腫瘍細胞とエフェクター対ターゲット比10:1で共培養された。 MNA処理によりFRα-CAR-T細胞の殺傷活性が著しく低下したが、これはアデノシン処理したFRα-CAR-T細胞と同様であった（図4H）。
(A) 7日目の培養から直接得られた総生存細胞数と集団倍加数 (PD)。棒グラフは、6人の健康なドナーの平均 + SEM を表します。少なくとも n = 3 回の独立した実験からのデータを表します。(B ～ D) CD3/CD28 と IL-2 をそれぞれの MNA 濃度で 7 日間使用して T 細胞を活性化しました。分析前に、細胞を PMA/イオノマイシンと GolgiStop で 4 時間刺激しました。T 細胞における TNFα (B) の発現。生細胞における TNFα 発現の例画像 (左) と表形式データ (右)。T 細胞における IFN-γ (C) と IL-2 (D) の発現。サイトカインの発現はフローサイトメトリーで測定しました。棒グラフは、平均 (n = 6 人の健康なドナー) + SEM を表します。P 値を決定するために、一元配置分散分析と反復測定 (*P<0.05 および **P<0.01) を使用します。少なくとも n = 3 回の独立した実験からのデータを示します。(E ～ G) CD3/CD28 および IL-2 を使用して、それぞれの MNA 濃度で T 細胞を 7 日間活性化しました。培地は、PMA/イオノマイシン刺激の 4 時間前と後に回収しました。TNFα (E)、IFN-γ (F)、および IL-2 (G) の濃度を ELISA で測定しました。棒グラフは、平均値 (n = 5 人の健康なドナー) + SEM を表します。P 値は、一元配置分散分析と反復測定を使用して決定しました (*P<0.05)。点線は検出限界を示します。(H) 細胞溶解アッセイ。FRα-CAR-T 細胞または GFP-CAR-T 細胞を、アデノシン (250μM) または MNA (10 mM) で 24 時間調整するか、未処理のままにしました (Ctrl)。SK-OV-3 細胞の殺傷率を測定しました。 P値はウェルチt検定によって決定された（*P<0.5、**P<0.01）。
MNA依存的なTNFα発現調節のメカニズムを理解するために、MNA処理したT細胞のTNFα mRNAの変化を評価した（図5A）。MNAで処理した健常ドナーT細胞ではTNFα転写レベルが2倍に増加し、MNAがTNFα転写調節に依存していることが示された。この可能性のある調節メカニズムを調査するために、TNFαを調節する2つの既知の転写因子、すなわち活性化T細胞核因子（NFAT）と特異的タンパク質1（Sp1）が、近位TNFαプロモーターへのMNA結合に応答して評価された（30）。TNFαプロモーターには、6つの同定されたNFAT結合部位と2つのSp1結合部位があり、1つの部位で重複している[5'キャップから-55塩基対（bp）]（30）。クロマチン免疫沈降（ChIP）により、MNAで処理すると、Sp1のTNFαプロモーターへの結合が3倍に増加することが示された。 NFATの組み込みも増加し、重要性に近づいた（図5B）。これらのデータは、MNAがSp1転写を介してTNFαの発現を調節し、程度は低いもののNFATの発現も調節することを示している。
(A) MNAなしで培養したT細胞と比較して、MNAで処理したT細胞におけるTNFα発現の倍率変化。SEMによる発現パターンを示す（n = 5人の健常ドナー）。少なくともn = 3回の独立した実験からのデータを示す。(B) NFATとSp1を(Ctrl)およびPMA/イオノマイシン刺激と組み合わせ、4時間後、8 mM MNAの有無にかかわらず処理したT細胞のTNFαプロモーター。免疫沈降の陰性および陽性コントロールとして、それぞれ免疫グロブリンG（IgG）およびH3を使用した。ChIPの定量により、MNA処理細胞におけるSp1およびNFATのTNFαプロモーターへの結合がコントロールと比較して数倍増加したことが示された。少なくともn = 3回の独立した実験からのデータを示す。多重t検定により決定されたP値（*** P <0.01）。(C) HGSCの腹水と比較して、T細胞（非細胞傷害性）は腫瘍内でTNFの発現が増加した。色は異なる患者を表しています。表示されているセルは、300 個にランダムにサンプリングされ、オーバードローを制限するためにジッターされています (** Padj = 0.0076)。 (D) 卵巣がんに対する MNA の提案モデル。MNA は TME 内の腫瘍細胞と線維芽細胞で産生され、T 細胞に取り込まれます。MNA は Sp1 の TNFα プロモーターへの結合を増加させ、TNFα 転写と TNFα サイトカイン産生の増加につながります。MNA はまた、IFN-γ の減少を引き起こします。T 細胞機能の阻害は、殺傷能力の低下と腫瘍の増殖の加速につながります。
報告によると、TNFαは前部および後部依存的な抗腫瘍効果と抗腫瘍効果を有するが、卵巣癌の増殖と転移を促進する役割がよく知られている（31-33）。報告によると、卵巣癌患者の腹水および腫瘍組織中のTNFα濃度は良性組織中の濃度よりも高い（34-36）。メカニズムの観点から、TNFαは白血球の活性化、機能、および増殖を調節し、癌細胞の表現型を変化させることができる（37、38）。これらの知見と一致して、遺伝子発現差解析では、腹水と比較して腫瘍組織のT細胞でTNFが有意に上方制御されていることが示された（図5C）。TNF発現の増加は、非細胞傷害性表現型のT細胞集団でのみ明らかであった（図S5A）。要約すると、これらのデータは、MNAがHGSCにおいて二重の免疫抑制効果と腫瘍促進効果を有するという見解を支持する。
フローサイトメトリーに基づく蛍光標識法は、TIL代謝の研究の主要な方法となっている。これらの研究では、末梢血リンパ球や二次リンパ器官のT細胞と比較して、マウスおよびヒトのTILはグルコースの取り込み傾向が高く（4、39）、ミトコンドリア機能が徐々に失われる（19、40）ことが示されている。本研究でも同様の結果が得られたが、重要な進展は、同じ切除腫瘍組織からの腫瘍細胞とTILの代謝を比較することである。これらの以前の報告の一部と一致して、腹水および腫瘍からの腫瘍（CD45-EpCAM +）細胞はCD8 +およびCD4 + T細胞よりもグルコースの取り込みが高く、腫瘍細胞の高いグルコース取り込みはT細胞と比較できることを裏付けている。T細胞競合の概念。TME。しかし、腫瘍細胞のミトコンドリア活性はCD8 + T細胞よりも高いが、ミトコンドリア活性はCD4 + T細胞と類似している。これらの結果は、酸化代謝が腫瘍細胞にとって重要であるという新たなテーマを裏付けています（41、42）。また、CD8 + T 細胞は CD4 + T 細胞よりも酸化機能障害を受けやすいか、CD4 + T 細胞はグルコース以外の炭素源を使用してミトコンドリア活性を維持している可能性があることも示唆しています（43、44）。腹水中の CD4 + T エフェクター、T エフェクター メモリー、T セントラル メモリー細胞の間でグルコース取り込みやミトコンドリア活性に差が見られなかったことに留意すべきです。同様に、腫瘍内の CD8 + T 細胞の分化状態はグルコース取り込みの変化とは無関係であり、in vitro で培養した T 細胞とヒト TIL in vivo との間に大きな違いがあることを強調しています（22）。これらの観察結果は、バイアスのない自動細胞集団割り当ての使用によっても確認され、腫瘍細胞よりもグルコース取り込みとミトコンドリア活性が高い CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + 細胞が優勢であるが、代謝活性細胞集団があることがさらに明らかになりました。この集団は、scRNA-seq解析で同定された骨髄抑制細胞または形質細胞様樹状細胞の推定サブポピュレーションを表している可能性がある。これら両方はヒト卵巣腫瘍で報告されているが[45]、この骨髄サブポピュレーションを記述するにはさらなる研究が必要である。
フローサイトメトリー法は細胞種間のグルコースおよび酸化代謝の一般的な違いを明らかにすることができるが、TMEにおけるミトコンドリア代謝のためにグルコースまたはその他の炭素源から生成される正確な代謝物はまだ特定されていない。特定のTILサブセットに代謝物の存在または非存在を割り当てるには、切除した組織から細胞集団を精製する必要がある。したがって、質量分析法と組み合わせた細胞濃縮法は、対応する患者サンプル中のT細胞および腫瘍細胞集団で異なって濃縮されている代謝物に関する知見を提供することができる。この方法は蛍光活性化セルソーティングよりも優れているが、特定の代謝物ライブラリーは固有の安定性および/または急速なターンオーバー率によって影響を受ける可能性がある（22）。それにもかかわらず、サンプルタイプ間で大きく変動するため、この方法は、アデノシンとキヌレニンという2つの既知の免疫抑制代謝物を同定することができた。
腫瘍およびTILサブタイプのメタボロミクス解析により、卵巣TMEにおける代謝物の役割についてより深い洞察が得られました。まず、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍とCD4+T細胞の間でミトコンドリア活性に差がないことを確認しました。しかし、LC-MS/MS分析により、これらの集団間で代謝物の存在量に有意な変化が見られ、TIL代謝とその全体的な代謝活性に関する結論は慎重に解釈する必要があることが示されました。次に、MNAはCD45細胞と腹水中のT細胞の間で最も大きな差が見られる代謝物であり、腫瘍細胞では見られませんでした。したがって、区画化と腫瘍の位置はTIL代謝に異なる影響を与える可能性があり、特定の微小環境における異質性の可能性が強調されます。第三に、MNA産生酵素NNMTの発現は主にCAFに限られており、腫瘍細胞ではそれほど多くはありませんが、腫瘍由来T細胞では検出可能なMNAレベルが観察されました。卵巣CAFにおけるNNMTの過剰発現は、CAF代謝、腫瘍浸潤および転移の促進などにより、癌促進効果があることが知られている（27）。TILの全体的なレベルは中程度であるが、CAFにおけるNNMTの発現は、予後不良と関連するCancer Genome Atlas（TCGA）間葉系サブタイプと密接に関連している（27、46、47）。最後に、MNA分解に関与する酵素AOX1の発現もCAF集団に限定されており、T細胞がMNAを代謝する能力を欠いていることを示唆している。これらの結果は、この知見を検証するにはさらなる研究が必要であるが、T細胞における高レベルのMNAは、免疫抑制的なCAF微小環境の存在を示している可能性があるという考えを支持する。
MNAトランスポーターの発現レベルが低く、MNA代謝に関与する主要タンパク質のレベルが検出限界以下であることから、T細胞にMNAが存在することは予想外である。2つの独立したコホートのscRNA-seq解析および標的qPCRでは、NNMTもAOX1も検出されなかった。これらの結果は、MNAがT細胞によって合成されるのではなく、周囲のTMEから吸収されることを示している。in vitro実験では、T細胞が外因性MNAを蓄積する傾向があることが示されている。
我々のin vitro研究では、外因性MNAがT細胞におけるTNFαの発現を誘導し、Sp1のTNFαプロモーターへの結合を強化することが示されています。TNFαは抗腫瘍機能と抗腫瘍機能の両方を有していますが、卵巣癌においては、TNFαは卵巣癌の増殖を促進する可能性があります（31-33）。卵巣腫瘍細胞培養におけるTNFαの中和、またはマウスモデルにおけるTNFαシグナルの除去は、TNFαを介した炎症性サイトカイン産生を改善し、腫瘍増殖を抑制します（32、35）。したがって、この場合、TME由来のMNAは、自己分泌ループを介したTNFα依存性メカニズムによって炎症促進性代謝物として作用し、それによって卵巣癌の発生と拡散を促進します（31）。この可能性に基づいて、TNFα阻害は卵巣癌の潜在的な治療薬として研究されています（37、48、49）。さらに、MNAはCAR-T細胞の卵巣腫瘍細胞に対する細胞傷害性を阻害し、MNAを介した免疫抑制のさらなる証拠を提供する。これらの結果を総合すると、腫瘍とCAF細胞がMNAを細胞外TMEに分泌するというモデルが示唆される。(i) TNF誘導性卵巣癌増殖促進と(ii) MNA誘導性T細胞細胞傷害活性阻害を介して、これは二重の腫瘍効果をもたらす可能性がある（図5D）。
結論として、本研究では、迅速な細胞濃縮、シングルセルシーケンス、および代謝プロファイリングを組み合わせることにより、HGSC患者の腫瘍細胞と腹水細胞の間に大きな免疫代謝の違いがあることを明らかにしました。この包括的な解析により、T細胞間でグルコース取り込みとミトコンドリア活性に違いがあることが示され、MNAが非細胞自律的な免疫調節代謝物であることが特定されました。これらのデータは、ヒト癌におけるTMEがT細胞代謝にどのように影響するかという点に影響を与えます。T細胞と癌細胞の間で栄養素を直接競合することが報告されていますが、代謝物は間接的な調節因子として腫瘍の進行を促進し、内因性免疫応答を抑制する可能性もあります。これらの調節代謝物の機能的役割をさらに解明することで、抗腫瘍免疫応答を強化するための新たな戦略が開かれる可能性があります。
患者検体および臨床データは、カナダ組織リポジトリネットワークによって認定されたBCがん腫瘍組織リポジトリから入手した。BCがん研究倫理委員会およびブリティッシュコロンビア大学（H07-00463）によって承認されたプロトコルに従って、すべての患者の検体および臨床データは、書面によるインフォームドコンセントまたは正式に同意の放棄を得て取得された。サンプルは、認定バイオバンク（BRC-00290）に保管されている。詳細な患者特性は、表S1およびS5に示されている。凍結保存のために、メスを使用して患者の腫瘍サンプルを機械的に分解し、100ミクロンのフィルターに通して単一細胞懸濁液を得る。患者の腹水は、細胞をペレット化して上清を除去するために、4℃で1500 rpmで10分間遠心分離した。腫瘍および腹水から得られた細胞は、50%熱失活ヒトAB血清（Sigma-Aldrich）、40% RPMI-1640（Thermo Fisher Scientific）、および10%ジメチルスルホキシドを含む溶液中で凍結保存された。これらの保存された単細胞懸濁液は解凍され、後述するメタボロミクスおよび代謝物測定に使用された。
完全培地は、0.22 μm フィルターでろ過した 50:50 の RPMI 1640:AimV 添加物で構成されています。RPMI 1640 + 2.05 mM l-グルタミン (Thermo Fisher Scientific) に、10% 熱失活ヒト AB 血清 (Sigma-Aldrich)、12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific)、2 mM l-グルタミン (Thermo Fisher Scientific)、1 x ペニシリン ストレプトマイシン (PenStrep) 溶液 (Thermo Fisher Scientific)、および 50 μM B-メルカプトエタノールを添加します。AimV (Invitrogen) には、20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) と 2 mM l-グルタミン (Thermo Fisher Scientific) が添加されています。フローサイトメーター染色バッファーは、0.22μmフィルターでろ過したリン酸緩衝生理食塩水（PBS；Invitrogen）に、3%の熱失活AB型ヒト血清（Sigma）を添加したもので構成されている。細胞濃縮バッファーは、0.22μmフィルターでろ過したPBSに、0.5%の熱失活AB型ヒト血清（Sigma-Aldrich）を添加したもので構成されている。
37°C 完全培地で、細胞を 10 nM MT DR と 100 μM 2-NBDG で 30 分間染色した。次に、細胞を 4°C で 15 分間生存率染色色素 eF506 で染色した。FC Block (eBioscience) と Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) に細胞を再懸濁し、フローサイトメーター染色バッファーで希釈し (製造元の指示に従って)、室温で 10 分間インキュベートする。フローサイトメトリー染色バッファーで、4°C で 20 分間、一連の抗体 (表 S2) で細胞を染色する。分析前に、フローサイトメトリー染色バッファー (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R 構成) に細胞を再懸濁する。SpectroFlo と FlowJo V10 を使用して細胞数データを分析し、GraphPad Prism 8 を使用してデータを作成する。 2-NBDGとMT DRの蛍光強度の中央値（MFI）を対数正規化し、その後、対応する患者を考慮して、統計解析にペアt検定を使用しました。解析からイベント数が40未満のすべての集団を除外し、統計解析とデータ可視化を実行する前に、負の値にはMFI値1を入力します。
上記のプロセスパネルの手動ゲーティング戦略を補完するために、FlowJoで死細胞を除去した後、FAUST（Full Annotation by the Shape Limitation Tree）（21）を使用して細胞を集団に自動的に割り当てました。出力は手動で管理し、誤って割り当てられたと思われる集団（PD1+とPD1-腫瘍細胞を結合したもの）を統合し、保持された集団を統合しました。各サンプルには平均2%以上の細胞が含まれており、合計11の集団があります。
フィコール密度勾配遠心分離法を用いて、PBMCを白血球分離製品（STEMCELL Technologies）から分離した。CD8+ T細胞は、CD8マイクロビーズ（Miltenyi）を用いてPBMCから分離し、製造元の指示に従って、TransAct（Miltenyi）を用いて完全培地で2週間増殖させた。細胞をIL-7（10 ng/ml；PeproTech）を含む完全培地で5日間静置し、その後TransActで再刺激した。7日目に、製造元の指示に従って、ヒトCD45マイクロビーズ（Miltenyi）を用いて、3回連続して細胞を濃縮した。細胞は、フローサイトメトリー分析用に分注し（上記のように）、100万個の細胞をLC-MS/MS分析用に3回分注した。サンプルは、以下に示すようにLC-MS/MSで処理した。イオン番号1,000で、欠損代謝物の値を推定した。各サンプルは、総イオン数（TIC）で正規化され、対数変換された後、分析前にMetaboAnalystRで自動的に正規化されます。
各患者の単細胞懸濁液を解凍し、40 μm フィルターを通して完全培地にろ過した (上記のとおり)。製造元のプロトコルに従って、マイクロビーズ (Miltenyi) を使用した磁気ビーズ分離による陽性選択を 3 回連続して行い、サンプルを CD8+、CD4+、および CD45- 細胞で濃縮した (氷上)。簡単に言うと、細胞を細胞濃縮バッファー (上記のとおり) に再懸濁し、カウントする。細胞をヒト CD8 ビーズ、ヒト CD4 ビーズ、またはヒト CD45 ビーズ (Miltenyi) とともに 4°C で 15 分間インキュベートし、その後細胞濃縮バッファーで洗浄した。サンプルを LS カラム (Miltenyi) に通し、陽性画分と陰性画分を回収する。時間の短縮と細胞回収ステップの最大化のために、CD8 画分を 2 回目の CD4+ 濃縮に使用し、CD4 画分をその後の CD45 濃縮に使用する。分離工程全体を通して、溶液を氷で冷やしておいてください。
代謝物分析用のサンプルを準備するために、細胞を氷冷塩溶液で1回洗浄し、各サンプルに80%メタノール1 mlを加え、ボルテックスした後、液体窒素で急速凍結した。サンプルを3回の凍結融解サイクルにかけ、4℃で14,000 rpmで15分間遠心分離した。代謝物を含む上清を乾燥するまで蒸発させた。代謝物を0.03%ギ酸50 μlに再溶解し、ボルテックスして混合した後、遠心分離して残渣を除去した。
上記のように代謝物を抽出します。上清をメタボロミクス研究用の高性能液体クロマトグラフィーボトルに移します。バッチ効果を防ぐため、各サンプルを同数の細胞で処理するランダム処理プロトコルを使用します。AB SCIEX QTRAP 5500 トリプル四重極質量分析計 (50) で以前に発表されたグローバル代謝物の定性評価を実施しました。クロマトグラフィー分析とピーク面積積分は、MultiQuant バージョン 2.1 ソフトウェア (Applied Biosystems SCIEX) を使用して実行しました。
イオンカウント1000を使用して、欠損している代謝物値を推定し、各サンプルのTICを使用して、サンプル処理からの機器分析によって導入された変化を補正するために、検出された各代謝物の正規化ピーク面積を計算しました。TICが正規化された後、MetaboAnalystR(51)(デフォルトパラメータ)を使用して対数変換と自動正規線スケーリングを行いました。vegan RパッケージのPCAを使用して、サンプルタイプ間のメタボロームの違いの探索的分析を実行し、部分冗長性分析を使用して患者を分析しました。Ward法を使用して、サンプル間のユークリッド距離をクラスタリングするヒートマップデンドログラムを構築しました。limma(52)を使用して、標準化された代謝物存在量で、細胞タイプと微小環境全体で異なる存在量の代謝物を特定しました。説明を簡略化するために、グループ平均パラメータを使用してモデルを指定し、微小環境の細胞タイプを各グループ(n = 6グループ)とみなします。有意性検定では、各代謝物について3回の繰り返し測定を行いました。偽の複製を避けるため、limma設計では患者を障害物として含めました。異なる患者間の代謝物の違いを確認するために、固定的に患者を含むlimmaモデルを調整しました。細胞型と微小環境間の事前に指定されたコントラストの有意性はPadj <0.05（Benjamini-Hochberg補正）であると報告します。
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80%生存率) を使用した活力濃縮後、10x 5′遺伝子発現プロトコルを使用して、凍結保存した全生体腹水および腫瘍サンプルに対してシングルセル転写産物シーケンスを実施した。腫瘍と腹水が一致する5症例を解析したが、1つの腫瘍サンプルの生存率が低かったため、解析対象から除外した。複数の患者を選択するために、各患者のサンプルを10xクロムコントローラーのレーンにまとめて、腹水と腫瘍部位を別々に解析した。シーケンス後 [Illumina HiSeq 4000 28×98 bpペアエンド (PE)、ケベックゲノム;腫瘍と腹水でそれぞれ細胞あたり平均73,488と41,378のリードが得られました]]、CellSNPとVireo（53）（CellSNPに基づく）を使用しました。GRCh38が提供する一般的なヒトSNP（VCF）にはドナーIDが割り当てられます。SNPRelateを使用して、割り当てられていない細胞とデュプレックスとして識別された細胞を除外し、腹水と腫瘍サンプル間でドナーを一致させて、患者の遺伝子型状態（IBS）の最も近いID（IBS）を推測します（54）。このタスクに基づいて、下流解析のために腫瘍と腹水に細胞が豊富に存在する3つのケースを保持しました。scater（55）とscran（56）BioConductorパッケージで大量フィルタリングステップを実行した後、解析用に6975個の細胞（腫瘍と腹水からそれぞれ2792個と4183個）が得られました。共有最近傍ネットワークのigraph（57）Louvainクラスタリングを使用します。 （SNN）は、Jaccard距離に基づいて発現によって細胞をクラスタリングします。クラスターは、マーカー遺伝子発現に基づいて推定細胞タイプに手動で注釈付けされ、t-SNEで可視化されました。細胞傷害性T細胞は、CD8AとGZMAの発現によって定義され、リボソームタンパク質発現が低いサブクラスターは除外されます。我々は、Izarら（16）の公開データにアクセスし、t-SNE埋め込みを含め、免疫細胞マーカーとNNMT発現間の発現オーバーラップを制御できます。
PBMCは、Ficoll密度勾配遠心分離により白血球分離製品（STEMCELL Technologies）から分離した。CD3+細胞は、CD3ビーズ（Miltenyi）を用いてPBMCから分離した。MNAの存在下または非存在下で、CD3+細胞は、プレート結合CD3（5μg/ml）、可溶性CD28（3μg/ml）、およびIL-2（300 U/ml；Proleukin）で活性化した。培養最終日に、フローサイトメトリーにより生存率（Fixable Viability Dye eFluor450、eBioscience）および増殖（123count eBeads、Thermo Fisher Scientific）を評価した。エフェクター機能を評価するため、GolgiStop を用いて PMA (20 ng/ml) とイオノマイシン (1μg/ml) で細胞を 4 時間刺激し、CD8-PerCP (RPA-T8、BioLegend)、CD4-AF700 (RPA-T4、BioLegend) および TNFα-フルオレセインイソチオシアネート (FITC) (MAb11、BD) をモニタリングする。qPCR および ChIP 細胞を PMA (20 ng/ml) とイオノマイシン (1μg/ml) で 4 時間刺激する。ELISA 上清は、PMA (20 ng/ml) とイオノマイシン (1 μg/ml) で 4 時間刺激する前と後に回収した。
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) を使用して、製造元のプロトコルに従って RNA を分離します。QIAshredder (QIAGEN) を使用してサンプルを均質化します。high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) を使用して相補的 DNA (cDNA) を合成します。TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) を使用して、以下のプローブ (製造元のプロトコルに従って) で遺伝子発現を定量します: Hs00196287_m1 (NNMT)、Hs00154079_m1 (AOX1)、Hs00427552_m1 (SLC22A1)、Hs02786624_g1 [グリセルアルデヒド-3-リン酸オフ水素 (GAPDH)]、および Hs01010726_m1 (SLC22A2)。サンプルは、MicroAmp光学フィルムを備えたMicroAmp高速光学96ウェル反応プレート（Applied Biosystems社製）で、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems社製）を用いて測定した。Ct値が35を超える場合は検出限界を超えているとみなし、検出不能と判定した。
前述のように ChIP を実行します (58)。簡単に言うと、細胞をホルムアルデヒド (最終濃度 1.42%) で処理し、室温で 10 分間インキュベートします。補充膨潤バッファー (25 mM Hepes、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl、0.1% NP-40) を氷上で 10 分間使用し、その後、記載されているように免疫沈降バッファーに再懸濁します (58)。次に、サンプルを次のサイクルで超音波処理します: 10 サイクル (20 回の 1 秒パルス)、静止時間 40 秒。ChIP グレードの免疫グロブリン G (Cell Signaling Technology; 1μl)、ヒストン H3 (Cell Signaling Technology; 3μl)、NFAT (Invitrogen; 3μl)、および SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) 抗体をサンプルとともに 4°CC で一晩振盪しながらインキュベートします。プロテインAビーズ（Thermo Fisher Scientific）をサンプルとともに4℃で1時間穏やかに振盪しながらインキュベートし、その後、Chelexビーズ（Bio-Rad）を使用してDNAを濃縮し、プロテイナーゼK（Thermo Fisher）を使用してタンパク質を消化した。TNFαプロモーターはPCRにより検出した。フォワードプライマーはGGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT、リバースプライマーはGTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG（207 bpの産物）である。画像はImage Lab（Bio-Rad）で作成し、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。
細胞培養上清は上記のように採取した。測定は、ヒトTNFα ELISAキット（Invitrogen）、ヒトIL-2 ELISAキット（Invitrogen）、およびヒトIFN-γ ELISAキット（Abcam）の製造元の手順に従って行った。製造元のプロトコルに従い、上清を1:100に希釈してTNFαおよびIL-2を検出し、1:3に希釈してIFN-γを検出した。EnVision 2104マルチラベルリーダー（PerkinElmer）を使用して450 nmの吸光度を測定した。
PBMCは、Ficoll密度勾配遠心分離により白血球分離製品（STEMCELL Technologies）から分離した。CD3+細胞は、CD3ビーズ（Miltenyi）を用いてPBMCから分離した。MNAの存在下または非存在下で、CD3+細胞をプレート結合CD3（5μg/ml）、可溶性CD28（3μg/ml）、およびIL-2（300 U/ml；Proleukin）で3日間活性化した。3日後、細胞を回収し、0.9%生理食塩水で洗浄し、沈殿物を急速凍結した。細胞数は、123count eBeadsを用いてフローサイトメトリー（Cytek Aurora；3L-16V-14B-8R構成）により測定した。
上記のように代謝物を抽出した。乾燥抽出物を4000細胞相当/μlの濃度で再溶解した。逆相クロマトグラフィー（1290 Infinity II、Agilent Technologies、Santa Clara、CA）とCORTECS T3カラム（2.1×150 mm、粒子サイズ1.6μm、細孔サイズ120Å、#186008500、Waters）でサンプルを分析した。エレクトロスプレーイオン化が正モードで動作する極性質量分析計（6470、Agilent）を使用した。移動相Aは0.1%ギ酸（H2O中）、移動相Bは90%アセトニトリル、0.1%ギ酸である。 LC グラジエントは、100% A で 0 ～ 2 分、99% B で 2 ～ 7.1 分、99% B で 7.1 ～ 8 分です。次に、移動相 A でカラムを 0.6 ml/min の流速で 3 分間再平衡化します。流速は 0.4 ml/min で、カラム チャンバーは 50°C に加熱されます。MNA の純粋な化学標準 (M320995、Toronto Research Chemical Company、North York、Ontario、Canada) を使用して、保持時間 (RT) と変換 (RT = 0.882 分、変換 1 = 137→94.1、変換 2 = 137→92、変換 3 = 137→78) を確立します。3 つの遷移すべてが正しい保持時間で発生した場合、特異性を確保するために、遷移 1 を定量に使用します。 MNA（トロント・リサーチ・ケミカル・カンパニー）の標準曲線は、原液（1 mg/ml）を6段階に希釈して、それぞれ0.1、1.0、10、100 ng/mlおよび1.0、10μg/mlの標準液を得ることによって作成されました。検出限界は1 ng/mlで、直線応答は10 ng/mlから10μg/mlの間です。LC/MS分析には、サンプルと標準液の2マイクロリットルをそれぞれ注入し、分析プラットフォームの安定性を確保するために、8回の注入ごとに混合品質管理サンプルを実行しました。MNA処理したすべての細胞サンプルのMNA応答は、アッセイの直線範囲内でした。データ解析は、MassHunter定量分析ソフトウェア（v9.0、Agilent）を使用して行いました。
第2世代αFR-CARコンストラクトはSongら（59）から入手した。簡単に言うと、このコンストラクトはCD8aリーダー配列、ヒトαFR特異的単鎖可変フラグメント、CD8aヒンジおよび膜貫通領域、CD27細胞内ドメイン、CD3z細胞内ドメインから構成されている。完全なCAR配列はGenScriptによって合成され、その後、形質導入効率を評価するために使用されたGFP発現カセットの上流にある第2世代レンチウイルス発現ベクターにクローニングされた。
レンチウイルスは、HEK293T細胞（American Type Culture Collection（ATCC）；10%ウシ胎児血清（FBS）および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で培養）をトランスフェクションして産生し、CAR-GFPベクターおよびパッケージングプラスミド（psPAX2およびpMD2.G、Addgene）をリポフェクションアミン（Sigma-Aldrich）を用いてパッケージングした。ウイルスを含む上清は、トランスフェクション後48時間および72時間後に回収し、ろ過後、超遠心分離により濃縮した。濃縮したウイルス上清は、形質導入まで-80℃で保存する。
PBMCは、Ficoll密度勾配遠心分離により、健常ドナー白血球分離製品（STEMCELL Technologies）から分離されます。陽性選択CD8マイクロビーズ（Miltenyi）を使用して、PBMCからCD8+細胞を分離します。T細胞をTransAct（Miltenyi）およびTexMACS培地［Miltenyi；3%熱失活ヒト血清、1%ペニシリン・ストレプトマイシン、IL-2（300 U/ml）を添加］で刺激します。刺激後24時間、T細胞にレンチウイルス（10⁶細胞あたり10 μlの濃縮ウイルス上清）を導入します。Cytek Aurora（FSC（前方散乱）/SSC（側方散乱）、Singlet、GFP+）上で、導入後1～3日後に細胞のGFP発現を評価し、少なくとも30%の導入効率を実証します。
CAR-T細胞は、未処理、250 μMアデノシンまたは10 mM MNAで処理した条件下で、Immunocult（STEMCELL Technologies; 1% PenStrep添加）で24時間培養した。前処理後、CAR-T細胞をPBSで洗浄し、10% FBSおよび1% PenStrepを添加したMcCoy 5A培地（Sigma-Aldrich）中の20,000個のSK-OV-3細胞[ATCC; 10:1の比率で混合した。エフェクター対ターゲット比1は、添加したImmunocult培地で3回増幅した。SK-OV-3細胞およびジギタリスサポニン（0.5mg/ml; Sigma-Aldrich）で溶解したSK-OV-3細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。 24時間の共培養後、上清を回収し、製造元の指示に従って乳酸脱水素酵素（LDH）を測定した（LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit、Promega）。LDH上清をLDHバッファーで1:50に希釈した。殺傷率は、次の式を使用して測定した：殺傷率 = 補正率 / 最大殺傷率 × 100%、ここで、補正率 = 共培養 - T細胞のみ、最大殺傷率 = 陽性対照 - 陰性対照。
本文または材料と方法に記載されているとおり、統計解析にはGraphPad Prism 8、Microsoft Excel、またはR v3.6.0を使用します。同一患者から複数のサンプル（腹水と腫瘍など）を採取した場合は、対応のあるt検定を使用するか、線形モデルまたは一般化モデルに患者をランダム効果として含めます。メタボロミクス解析では、重要度検定を3回繰り返して実施します。
本記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 を参照してください。
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マリサ K. キルガー (マリサ K. キルガー)、サラ マクファーソン (サラ マクファーソン)、ローレン G. ザカリアス (ローレン G. ザカリアス)、アビゲイル イーライ アリス G. ワトソン (H. ワトソン)、ジョン スタッグ (ジョン スタッグ)、ブラッド H. ネルソン (ブラッド H. ネルソン)、ラルフ J. デ ベラルディーニ (ラルフ J.デベラルディニス）、ラッセル G. ジョーンズ（ラッセル G. ジョーンズ）、フィニアス T. ハミルトン（フィニアス T.
MNAはT細胞の免疫抑制に寄与し、ヒトがん治療における潜在的な免疫療法標的となる。
マリサ K. キルガー (マリサ K. キルガー)、サラ マクファーソン (サラ マクファーソン)、ローレン G. ザカリアス (ローレン G. ザカリアス)、アビゲイル イーライ アリス G. ワトソン (H. ワトソン)、ジョン スタッグ (ジョン スタッグ)、ブラッド H. ネルソン (ブラッド H. ネルソン)、ラルフ J. デ ベラルディーニ (ラルフ J.デベラルディニス）、ラッセル G. ジョーンズ（ラッセル G. ジョーンズ）、フィニアス T. ハミルトン（フィニアス T.
MNAはT細胞の免疫抑制に寄与し、ヒトがん治療における潜在的な免疫療法標的となる。
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