免疫調節代謝物は腫瘍微小環境（TME）の重要な特徴であるが、いくつかの例外を除いて、その正体はほとんどわかっていない。今回、高悪性度漿液性癌（HGSC）患者の腫瘍と腹水から腫瘍とT細胞を解析し、これらの異なるTMEコンパートメントのメタボロームを明らかにした。腹水と腫瘍細胞には広範な代謝物の違いがある。腹水と比較して、腫瘍浸潤T細胞には1-メチルニコチンアミド（MNA）が著しく豊富である。T細胞中のMNAレベルは上昇しているが、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（S-アデノシルメチオニンからニコチンアミドへのメチル基転移を触媒する酵素）の発現は線維芽細胞と腫瘍細胞に限定されている。機能的には、MNAはT細胞に腫瘍促進サイトカイン腫瘍壊死因子αの分泌を誘導する。したがって、TME 由来の MNA は T 細胞の免疫調節に寄与し、ヒトの癌の治療における潜在的な免疫療法のターゲットとなります。
腫瘍由来代謝物は抗腫瘍免疫に対して顕著な阻害効果を有する可能性があり、疾患進行の重要な原動力としても機能しうることを示す証拠がますます増えています (1)。ワールブルク効果に加えて、最近の研究では、腫瘍細胞の代謝状態と腫瘍微小環境 (TME) の免疫状態との関係が特徴付けられ始めています。マウスモデルとヒトT細胞の研究では、グルタミン代謝 (2)、酸化代謝 (3)、およびグルコース代謝 (4) が、さまざまな免疫細胞サブグループに対して独立して作用できることが示されています。これらの経路におけるいくつかの代謝物は、T細胞の抗腫瘍機能を阻害します。補酵素テトラヒドロビオプテリン (BH4) の阻害がT細胞の増殖にダメージを与え、体内のBH4の増加がCD4およびCD8を介した抗腫瘍免疫応答を増強できることが証明されています。さらに、キヌレニンの免疫抑制効果は、BH4 の投与によって回復することができます (5)。イソクエン酸脱水素酵素 (IDH) 変異型神経膠芽腫では、エナンチオ代謝された (R)-2-ヒドロキシグルタル酸 (R-2-HG) の分泌が、T 細胞の活性化、増殖、および細胞溶解活性を阻害します (6)。最近、解糖の副産物であるメチルグリオキサールが骨髄由来の抑制細胞によって生成され、メチルグリオキサールの T 細胞への移行がエフェクター T 細胞の機能を阻害できることが示されました。治療では、メチルグリオキサールの中和が骨髄由来抑制細胞 (MDSC) の活性を克服し、マウスモデルでのチェックポイント阻害療法を相乗的に強化することができます (7)。これらの研究は総合的に、TME 由来代謝物が T 細胞の機能と活性の調節において重要な役割を果たしていることを強調しています。
T細胞機能不全は卵巣癌において広く報告されている（8）。これは、低酸素状態と異常な腫瘍血管系に固有の代謝特性（9）に一部起因し、グルコースとトリプトファンが乳酸やキヌレニンなどの副産物に変換される。過剰な細胞外乳酸はインターフェロンγ（IFN-γ）の産生を減少させ、骨髄抑制性サブグループの分化を促進する（10, 11）。トリプトファンの消費はT細胞の増殖を直接阻害し、T細胞受容体シグナル伝達を阻害する（12-14）。これらの観察にもかかわらず、免疫代謝に関する多くの研究は、最適化された培地を用いたin vitro T細胞培養、またはin vivoでの相同マウスモデルに限定して行われており、いずれもヒト癌の異質性や生理学的マクロ・ミクロ環境を完全に反映しているわけではない。
卵巣癌の共通の特徴は、腹膜播種と腹水の出現である。腹水への細胞液の蓄積は、病状の進行および予後不良と関連している（15）。報告によると、この特異な部位は低酸素状態にあり、血管内皮増殖因子（VEGF）およびインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）のレベルが高く、制御性T細胞および骨髄抑制細胞が浸潤している（15-18）。腹水の代謝環境は腫瘍自体の代謝環境とは異なる可能性があるため、腹腔内におけるT細胞の再プログラム化は不明である。さらに、腹水と腫瘍環境に存在する代謝物との間の重要な違いと不均一性は、免疫細胞の浸潤と腫瘍におけるそれらの機能を阻害する可能性があり、さらなる研究が必要である。
これらの問題を解決するために、我々は、異なる細胞タイプ（CD4 +およびCD8 + T細胞を含む）および腫瘍内および腫瘍間を研究するための高感度細胞分離および液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）法を設計しました。その代謝物は、患者の同じ腹水および腫瘍環境内の細胞に広がっています。この方法を高次元フローサイトメトリーおよび単一細胞RNAシーケンス（scRNA-seq）と組み合わせて使用​​​​して、これらの主要な集団の代謝状態の高解像度のポートレートを提供します。この方法により、腫瘍T細胞中の1-メチルニコチンアミド（MNA）のレベルが大幅に上昇することが明らかになり、in vitro実験では、T細胞機能に対するMNAの免疫調節効果がこれまで不明であることが示されました。一般に、この方法は、腫瘍と免疫細胞間の相互代謝相互作用を明らかにし、免疫調節代謝物に関する独自の洞察を提供し、T細胞ベースの卵巣癌免疫療法の治療機会に役立つ可能性があります。
高次元フローサイトメトリーを用いて、グルコース取り込み量[2-(N-(7-ニトロフェニル-2-オキサ-1,3-ジアザ-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース(2-NBDG)]とミトコンドリア活性[MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20)を同時に定量した。これらは免疫細胞と腫瘍細胞集団を区別する典型的なマーカーである（表S2および図S1A）。この解析により、腹水細胞と腫瘍細胞はT細胞と比較してグルコース取り込み量が高いものの、ミトコンドリア活性の差は小さいことが示された。腫瘍細胞[CD45-EpCAM（EpCAM）+]の平均グルコース取り込みはT細胞の3〜4倍であり、CD4 + T細胞の平均グルコース取り込みはCD8 + T細胞の1.2倍であり、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）は同じTMEでも異なる代謝要件を持っていることを示しています（図1A）。対照的に、腫瘍細胞のミトコンドリア活性はCD4 + T細胞のそれと似ており、両方の細胞タイプのミトコンドリア活性はCD8 + T細胞のそれよりも高くなっています（図1B）。一般に、これらの結果は代謝レベルを明らかにしています。腫瘍細胞の代謝活性はCD4 + T細胞の代謝活性よりも高く、CD4 + T細胞の代謝活性はCD8 + T細胞の代謝活性よりも高くなっています。細胞種間でこれらの影響が認められるにもかかわらず、腹水中のCD4 + T細胞およびCD8 + T細胞の代謝状態や、それらの相対的割合には、腫瘍と比較して一貫した差異は認められませんでした（図1C）。対照的に、CD45 + 細胞分画では、腫瘍中のEpCAM + 細胞の割合は腹水中と比較して増加していました（図1D）。また、EpCAM + 細胞とEpCAM - 細胞成分の間には明確な代謝の違いが観察されました。EpCAM +（腫瘍）細胞は、EpCAM - 細胞よりもグルコース取り込みとミトコンドリア活性が高く、これはTME中の腫瘍細胞における線維芽細胞の代謝活性よりもはるかに高い値です（図1、EおよびF）。
(A および B) グルコース取り込み (2-NBDG) の蛍光強度中央値 (MFI) (A) および CD4 + T 細胞のミトコンドリア活性 (MitoTracker 暗赤色) (B) 腹水および腫瘍からの CD8 + T 細胞および EpCAM + CD45- 腫瘍細胞の代表的なグラフ (左) と表形式データ (右)。 (C) 腹水および腫瘍中の CD4 + 細胞および CD8 + 細胞 (CD3 + T 細胞のうち) の割合。 (D) 腹水および腫瘍 (CD45−) 中の EpCAM + 腫瘍細胞の割合。 (E および F) EpCAM + CD45- 腫瘍および EpCAM-CD45- マトリックスのグルコース取り込み (2-NBDG) (E) およびミトコンドリア活性 (MitoTracker 暗赤色) (F) 代表的なグラフ (左) および表形式データ ( (G) フローサイトメトリーによるCD25、CD137、PD1発現の代表グラフ。(HおよびI) CD4 + T細胞(H)およびCD8 + T細胞(I)におけるCD25、CD137、PD1発現。(JおよびK) CCR7およびCD45ROの発現に基づくナイーブ、セントラルメモリー(Tcm)、エフェクター(Teff)、エフェクターメモリー(Tem)表現型。腹水および腫瘍中のCD4 + T細胞(J)およびCD8 + T細胞(K)の代表画像（​​左）および表形式データ（右）。P値は対応のあるt検定（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）によって決定された。線はマッチした患者（n = 6）を表す。FMO、蛍光マイナス1、MFI、蛍光強度の中央値。
さらに分析を進めると、高度に分解された T 細胞表現型の状態に他の重要な違いがあることが明らかになりました。腫瘍内の活性化 (図 1、G ～ I) とエフェクター メモリ (図 1、J および K) は、腹水 (CD3 + T 細胞の割合) よりもはるかに頻繁です。同様に、活性化マーカー (CD25 および CD137) と枯渇マーカー [プログラム細胞死タンパク質 1 (PD1)] の発現によって表現型を分析すると、これらの集団の代謝特性は異なるものの (図 S1、B ～ E)、ナイーブ、エフェクター、またはメモリ サブセット間で一貫して有意な代謝の違いは観察されませんでした (図 S1、F ～ I)。これらの結果は、機械学習手法を使用して細胞表現型を自動的に割り当てることによって確認され (21)、患者の腹水中に多数の骨髄細胞 (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) が存在することがさらに明らかになりました (図 S2A)。同定されたすべての細胞型の中で、この骨髄系細胞集団は最も高いグルコース取り込みとミトコンドリア活性を示した（図S2、B～G）。これらの結果は、HGSC患者の腹水および腫瘍中に認められる複数の細胞型間の代謝における大きな違いを浮き彫りにしている。
TIL のメタボノミクス特性を理解する上での主な課題は、腫瘍から十分な純度、品質、量の T 細胞サンプルを分離する必要があることです。最近の研究では、フローサイトメトリーに基づくソーティングおよびビーズ濃縮法が細胞代謝プロファイルの変化につながる可能性があることが示されています (22-24)。この問題を克服するために、LC-MS/MS による分析の前に、外科的に切除されたヒト卵巣癌から TIL を分離するためのビーズ濃縮法を最適化しました (材料と方法、図 2A を参照)。このプロトコルが代謝物の変化に及ぼす全体的な影響を評価するために、上記のビーズ分離ステップ後に健康なドナーによって活性化された T 細胞の代謝物プロファイルを、ビーズ分離されずに氷上に残された細胞と比較しました。この品質管理分析により、これら 2 つの条件の間には高い相関関係があり (r = 0.77)、86 の代謝物グループの技術的な再現性も高いことがわかりました (図 2B)。したがって、これらの方法は、細胞タイプの濃縮を受けている細胞で正確な代謝産物分析を実行できるため、HGSC で特定の代謝産物を識別するための最初の高解像度プラットフォームが提供され、細胞の特異性の性代謝プログラムに対するより深い理解を得ることができます。
(A) 磁気ビーズ濃縮の模式図。LC-MS/MSによる分析の前に、細胞は3回連続して磁気ビーズ濃縮を受けるか、氷上に残されます。(B) 濃縮タイプが代謝物の存在量に与える影響。濃縮タイプごとに3回の測定値の平均±SE。灰色の線は1:1の関係を表します。繰り返し測定のクラス内相関（ICC）は軸ラベルに示されています。NAD、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド。(C) 患者の代謝物分析のワークフローの模式図。患者から腹水または腫瘍を採取し、凍結保存します。各サンプルの一部をフローサイトメトリーで分析し、残りのサンプルはCD4 +、CD8 +、およびCD45-細胞の3回の濃縮を受けました。これらの細胞画分はLC-MS/MSを使用して分析されました。(D) 標準化された代謝物の存在量のヒートマップ。樹状図は、サンプル間のユークリッド距離のウォードクラスタリングを表しています。 (E) サンプル代謝マップの主成分分析（PCA）。各サンプルを3回繰り返し、同じ患者のサンプルは線で結ばれている。(F) 患者を条件としたサンプルの代謝プロファイルのPCA（部分冗長性を使用）。サンプルタイプは凸包によって制限されている。PC1：主成分1、PC2：主成分2。
次に、この濃縮法を適用して、6 人の HGSC 患者の原発性腹水および腫瘍中の CD4 +、CD8 +、および CD45 細胞画分中の 99 の代謝物を分析しました (図 2C、図 S3A、表 S3 および S4)。 対象集団は、元の大量の生細胞サンプルの 2% ～ 70% を占め、細胞の割合は患者間で大きく異なります。 ビーズを分離した後、濃縮された対象の画分 (CD4 +、CD8 +、または CD45-) は、平均してサンプル中のすべての生細胞の 85% 以上を占めます。 この濃縮法により、大規模なサンプルからは不可能な、ヒトの腫瘍組織の代謝からの細胞集団を分析できます。 このプロトコルを使用して、これら 2 つのよく特徴付けられた免疫抑制代謝物である l-キヌレニンとアデノシンが腫瘍 T 細胞または腫瘍細胞で増加していることを判別しました (図 S3、B および C)。したがって、これらの結果は、患者組織内の生物学的に重要な代謝物を見つけるための当社の細胞分離および質量分析技術の忠実性と能力を実証しています。
我々の解析では、患者内および患者間で細胞タイプの代謝が強く分離していることも明らかになった (図 2D および図 S4A)。特に、他の患者と比較して、患者 70 は異なる代謝特性を示した (図 2E および図 S4B)。これは、患者間にかなりの代謝異質性がある可能性があることを示している。他の患者 (1.2～2 リットル、表 S1) と比較して、患者 70 で採取された腹水の総量 (80 ml) が少なかったことは注目に値します。主成分分析中に患者間の異質性を制御すると (たとえば、部分冗長性分析を使用)、細胞タイプ間で一貫した変化が示され、細胞タイプや微小環境が代謝プロファイルに従って明確に集約されていることが示されます (図 2F)。単一代謝物の解析ではこれらの効果が強調され、細胞タイプと微小環境の間に有意な差があることが明らかになりました。注目すべきは、最も顕著な差が見られるMNAです。MNAは通常、CD45陰性細胞と腫瘍に浸潤するCD4+およびCD8+細胞に多く含まれています（図3A）。CD4+細胞ではこの影響が最も顕著であり、CD8+細胞のMNAも環境の影響を強く受けているようです。しかし、腫瘍CD8+スコアを評価できるのは6人の患者のうち3人だけなので、これは重要ではありません。MNAに加えて、腹水および腫瘍内のさまざまな種類の細胞には、TILではあまり特徴付けられていない他の代謝物も異なって豊富に含まれています（図S3およびS4）。したがって、これらのデータは、さらなる研究のための有望な免疫調節代謝物のセットを明らかにしています。
(A) 腹水および腫瘍由来の CD4+、CD8+、CD45- 細胞における MNA の正規化含有量。ボックス プロットは、中央値 (線)、四分位範囲 (フレーム ヒンジ)、および四分位範囲の最大 1.5 倍までのデータ範囲 (フレーム ウィスカー) を示しています。「患者材料および方法」に記載されているように、患者の limma 値を使用して P 値を決定します (*P<0.05、**P<0.01)。(B) MNA 代謝の模式図 (60)。代謝物: S-アデノシル-1-メチオニン。SAH、S-アデノシン-1-ホモシステイン。NA、ニコチンアミド。MNA、1-メチルニコチンアミド。2-PY、1-メチル-2-ピリドン-5-カルボキサミド。4-PY、1-メチル-4-ピリドン-5-カルボキサミド。NR、ニコチンアミド リボース。 NMN、ニコチンアミドモノヌクレオチド。酵素（緑）：NNMT、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ；SIRT、サーチュイン；NAMPT、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ；AOX1、アルデヒドオキシダーゼ1；NRK、ニコチンアミドリボシドキナーゼ；NMNAT、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニル酸トランスフェラーゼ；Pnp1、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ。（C）腹水（灰色）および腫瘍（赤色）のscRNA-seqのt-SNE；n = 3患者）。（D）scRNA-seqを用いて同定された異なる細胞集団におけるNNMTの発現。（E）SK-OV-3、ヒト胎児腎（HEK）293T、T細胞、およびMNA処理T細胞におけるNNMTおよびAOX1の発現。折り畳まれた発現はSK-OV-3に対する相対値で示されている。標準誤差（SEM）を付した発現パターンを示します（n = 6人の健康なドナー）。Ct値が35を超える場合は検出限界以下（UD）とみなします。（F）SK-OV-3、HEK293T、T細胞、および8mM MNA処理したT細胞におけるSLC22A1およびSLC22A2の発現。SK-OV-3に対する相対的な発現を示します。標準誤差（SEM）を付した発現パターンを示します（n = 6人の健康なドナー）。Ct値が35を超える場合は検出限界以下（UD）とみなします。（G）MNA添加72時間後の活性化された健康なドナーT細胞における細胞MNA含有量。標準誤差（SEM）を付した発現パターンを示します（n = 4人の健康なドナー）。
MNAは、ニコチンアミドNメチルトランスフェラーゼ（NNMT；図3B）によってS-アデノシル-1-メチオニン（SAM）のメチル基がニコチンアミド（NA）に転移されることによって生成される。NNMTはさまざまなヒト癌で過剰発現しており、増殖、浸潤、転移に関連している（25-27）。TMEにおけるT細胞のMNAの起源をより深く理解するために、我々はscRNA-seqを用いて、3人のHGSC患者の腹水と腫瘍中の細胞タイプ間でのNNMTの発現を特徴付けた（表S5）。約6,500個の細胞を解析した結果、腹水および腫瘍環境において、NNMTの発現は推定される線維芽細胞および腫瘍細胞集団に限定されていることが示された（図3、CおよびD）。注目すべきは、PTPRC（CD45 +）を発現するどの集団にも明らかなNNMTの発現がないことです（図3Dおよび図S5A）。これは、代謝物スペクトルで検出されたMNAがT細胞に導入されたことを示しています。アルデヒドオキシダーゼ1（AOX1）の発現は、MNAを1-メチル-2-ピリドン-5-カルボキサミド（2-PYR）または1-メチル-4-ピリドン-5-カルボキサミド（4-PYR）に変換します（図3B）。また、COL1A1を発現する線維芽細胞の集団に限定されています（図S5A）。これらは、T細胞が従来のMNA代謝能力を欠いていることを示しています。これらのMNA関連遺伝子の発現パターンは、HGSC患者の腹水からの2番目の独立した細胞データセットを使用して検証されました（図S5B、n = 6）（16）。さらに、MNA処理した健常ドナーT細胞を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）で解析したところ、対照群のSK-OV-3卵巣腫瘍細胞と比較して、NNMTおよびAOX1の発現がほとんど見られないことが示されました（図3E）。これらの予想外の結果は、TMEにおいてMNAが線維芽細胞または腫瘍から隣接するT細胞へ分泌される可能性を示唆しています。
候補としては、可溶性キャリア22（SLC22）ファミリー（SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3）によってコードされる有機カチオントランスポーター1～3ファミリー（OCT1、OCT2、OCT3）が挙げられるが、MNAの潜在的なトランスポーターは未だ特定されていない（28）。健常ドナーT細胞由来のmRNAのQPCRでは、SLC22A1の発現レベルは低かったものの、SLC22A2は検出限界以下であり、文献で報告されていたことが確認された（図3F）（29）。対照的に、SK-OV-3卵巣腫瘍細胞株では、両トランスポーターの発現レベルが高かった（図3F）。
T細胞が外来MNAを吸収する能力を有する可能性を検証するため、健常ドナーT細胞を異なる濃度のMNA存在下で72時間培養した。外因性MNAが存在しない場合、細胞内のMNA含量は検出されなかった（図3G）。しかし、外因性MNAで処理した活性化T細胞では、細胞内のMNA含量が用量依存的に増加し、最大6 mM MNAまで増加した（図3G）。この結果は、トランスポーターの発現レベルが低く、細胞内MNA代謝を担う主要酵素が欠損しているにもかかわらず、TILはMNAを吸収できることを示している。
患者T細胞の代謝産物のスペクトルとin vitro MNA吸収実験は、癌関連線維芽細胞（CAF）がMNAを分泌し、腫瘍細胞がTILの表現型と機能を制御する可能性を高めます。 T細胞に対するMNAの効果を調べるために、健康なドナーT細胞をMNAの存在下または非存在下でin vitroで活性化し、その増殖とサイトカイン産生を評価しました。 最高用量のMNAを添加してから7日後、集団倍加数は中程度に減少しましたが、活力はすべての用量で維持されました（図4A）。 さらに、外因性MNAの処理により、腫瘍壊死因子α（TNFα）を発現しているCD4 +およびCD8 + T細胞の割合が増加しました（図4B）。 対照的に、IFN-γの細胞内産生はCD4 + T細胞で有意に減少しましたが、CD8 + T細胞では減少せず、インターロイキン2（IL-2）には有意な変化はありませんでした（図4、CおよびD）。そのため、これらの MNA 処理 T 細胞培養物から得た上清の酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) では、TNFα が有意に増加し、IFN-γ が減少し、IL-2 に変化がないことが確認されました (図 4、E ～ G)。IFN-γ の減少は、MNA が T 細胞の抗腫瘍活性を阻害する役割を果たしている可能性を示しています。MNA の T 細胞介在性細胞傷害に対する効果をシミュレートするために、葉酸受容体 α を標的とするキメラ抗原受容体 T (FRα-CAR-T) 細胞と緑色蛍光タンパク質 (GFP) によって制御される CAR-T (GFP -CAR-T) 細胞が、健康なドナーの末梢血単核細胞 (PBMC) によって生成されました。CAR-T 細胞は MNA の存在下で 24 時間培養し、その後、葉酸受容体 α を発現するヒト SK-OV-3 卵巣腫瘍細胞と、エフェクター対ターゲット比 10:1 で共培養しました。 MNA 処理により FRα-CAR-T 細胞の殺傷活性が大幅に減少しましたが、これはアデノシン処理した FRα-CAR-T 細胞の場合と同様でした (図 4H)。
(A) 7日目の培養から直接得られた生細胞の総数と集団倍加（PD）。棒グラフは6名の健康なドナーの平均+ SEMを表します。少なくともn = 3の独立した実験のデータを表します。(B～D) CD3/CD28とIL-2を使用して、それぞれのMNA濃度で7日間T細胞を活性化しました。分析の前に、細胞はGolgiStopを添加したPMA/イオノマイシンで4時間刺激されました。T細胞におけるTNFα（B）の発現。生細胞におけるTNFαの発現の例画像（左）と表形式データ（右）。T細胞におけるIFN-γ（C）とIL-2（D）の発現。サイトカインの発現はフローサイトメトリーで測定しました。棒グラフは平均値（n = 6名の健康なドナー）+ SEMを表します少なくともn = 3の独立した実験からのデータを表します。（EからG）CD3 / CD28およびIL-2を使用して、それぞれのMNA濃度で7日間T細胞を活性化しました。培地はPMA /イオノマイシン刺激の4時間前と後に収集されました。TNFα（E）、IFN-γ（F）、およびIL-2（G）の濃度はELISAによって測定されました。棒グラフは平均（n = 5人の健康なドナー）+ SEMを表します。P値は、一元配置分散分析および反復測定を使用して決定されました（* P<0.05）。点線は検出限界を示しています。（H）細胞溶解アッセイ。FRα-CAR-TまたはGFP-CAR-T細胞を、アデノシン（250μM）またはMNA（10 mM）で24時間調整するか、未処理のままにしました（Ctrl）。SK-OV-3細胞の死滅率を測定しました。 P値はWelch t検定によって決定されました（*P<0.5および**P<0.01）。
MNA依存性のTNFα発現調節のメカニズムを理解するために、MNA処理T細胞のTNFα mRNAの変化を評価した（図5A）。MNAで処理した健康なドナーT細胞はTNFα転写レベルが2倍に増加したことから、MNAはTNFαの転写調節に依存していることが示された。この可能性のある調節メカニズムを調査するために、TNFαを制御する2つの既知の転写因子、すなわち活性化T細胞核因子（NFAT）と特異的タンパク質1（Sp1）が、近位TNFαプロモーターへのMNA結合への反応として評価された（30）。TNFαプロモーターには、6つの同定されたNFAT結合部位と2つのSp1結合部位があり、1つの部位（5'キャップから-55塩基対（bp））で重複している（30）。クロマチン免疫沈降（ChIP）により、MNA処理するとTNFαプロモーターへのSp1の結合が3倍に増加することが示された。 NFATの取り込みも増加し、重要性に近づきました（図5B）。これらのデータは、MNAがSp1転写を介してTNFαの発現を制御し、NFATの発現もそれよりわずかに制御していることを示唆しています。
(A) MNAなしで培養したT細胞と比較した、MNAで処理したT細胞でのTNFα発現の倍数変化。発現パターンをSEMとともに示す(n = 5人の健康なドナー)。少なくともn = 3の独立した実験のデータを示す。(B) NFATとSp1を(Ctrl)およびPMA/イオノマイシン刺激と組み合わせ、4時間刺激した後、8 mM MNAで処理した、または処理しなかったT細胞のTNFαプロモーター。免疫沈降のネガティブコントロールとして免疫グロブリンG (IgG)、ポジティブコントロールとしてH3を使用した。ChIPの定量化により、MNA処理細胞内のTNFαプロモーターへのSp1およびNFATの結合は、コントロールと比較して数倍増加することが示された。少なくともn = 3の独立した実験のデータを示す。P値は多重t検定により決定した(*** P <0.01)。 (C) HGSC腹水と比較して、T細胞（非細胞傷害性）は腫瘍においてTNFの発現が増加した。色は異なる患者を表す。表示されている細胞はランダムに300個抽出され、過描画を制限するためにジッタリングされている（** Padj = 0.0076）。(D) 卵巣癌に対するMNAの提案モデル。MNAはTME中の腫瘍細胞と線維芽細胞で産生され、T細胞に取り込まれる。MNAはSp1のTNFαプロモーターへの結合を増加させ、TNFα転写とTNFαサイトカイン産生の増加につながる。MNAはまた、IFN-γの減少も引き起こす。T細胞機能の阻害は、殺傷能力の低下と腫瘍の増殖の加速につながる。
報告によると、TNFαは前方および後方依存性の抗腫瘍効果および抗腫瘍効果を有するが、卵巣癌の増殖および転移を促進する役割がよく知られている（31-33）。報告によると、卵巣癌患者の腹水および腫瘍組織中のTNFα濃度は、良性組織中のそれよりも高い（34-36）。メカニズムの観点から、TNFαは白血球の活性化、機能および増殖を制御し、癌細胞の表現型を変化させることができる（37、38）。これらの知見と一致して、差次的遺伝子発現解析は、腹水と比較して腫瘍組織中のT細胞でTNFが有意に上方制御されていることを示した（図5C）。TNF発現の増加は、非細胞傷害性表現型のT細胞集団でのみ明らかであった（図S5A）。要約すると、これらのデータは、MNAがHGSCにおいて免疫抑制効果と腫瘍促進効果の両方を有するという見解を支持している。
フローサイトメトリーに基づく蛍光標識は、TIL代謝を研究するための主な方法となっている。これらの研究は、末梢血リンパ球または二次リンパ器官のT細胞と比較して、マウスおよびヒトTILはグルコースを取り込む傾向が高く（4、39）、ミトコンドリア機能が徐々に失われることを示しています（19、40）。この研究でも同様の結果が観察されましたが、重要な進展は、同じ切除腫瘍組織からの腫瘍細胞とTILの代謝を比較することです。これらの以前の報告のいくつかと一致して、腹水および腫瘍からの腫瘍（CD45-EpCAM +）細胞は、CD8 +およびCD4 + T細胞よりも高いグルコース取り込みを示し、腫瘍細胞の高いグルコース取り込みをT細胞と比較できることを裏付けています。T細胞競合の概念。TME。ただし、腫瘍細胞のミトコンドリア活性はCD8 + T細胞よりも高いですが、ミトコンドリア活性はCD4 + T細胞のそれと似ています。これらの結果は、酸化代謝が腫瘍細胞にとって重要であるという新たなテーマを補強するものである (41, 42)。また、CD8 + T細胞はCD4 + T細胞よりも酸化機能不全の影響を受けやすい可能性があること、またはCD4 + T細胞はミトコンドリアの活性を維持するためにグルコース以外の炭素源を使用する可能性があることも示唆している (43, 44)。腹水中のCD4 + Tエフェクター細胞、Tエフェクターメモリー細胞、およびTセントラルメモリー細胞の間でグルコース取り込みやミトコンドリア活性に違いが見られなかったことは注目すべきである。同様に、腫瘍内のCD8 + T細胞の分化状態はグルコース取り込みの変化とは無関係であり、in vitroで培養されたT細胞とin vivoでのヒトTILとの間に有意な差があることが強調されている (22)。これらの観察結果は、偏りのない自動細胞集団割り当ての使用によっても確認され、腫瘍細胞よりもグルコース取り込みおよびミトコンドリア活性が高いCD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +細胞が多く存在するが、代謝が活発な細胞集団であることがさらに明らかになった。この集団は、scRNA-seq解析で同定された骨髄抑制細胞または形質細胞様樹状細胞の推定サブポピュレーションを表している可能性があります。これらはいずれもヒト卵巣腫瘍で報告されていますが[45]、この骨髄サブポピュレーションを記述するにはさらなる研究が必要です。
フローサイトメトリーに基づく方法は、細胞タイプ間のグルコースおよび酸化代謝の一般的な違いを明らかにすることができますが、TME におけるミトコンドリア代謝のためのグルコースまたは他の炭素源によって生成される正確な代謝物はまだ決定されていません。特定の TIL サブセットに代謝物の有無を割り当てるには、切除組織から細胞集団を精製する必要があります。したがって、質量分析と組み合わせた細胞濃縮法は、一致する患者サンプルの T 細胞および腫瘍細胞集団で差別的に濃縮されている代謝物に関する洞察を提供します。この方法は蛍光活性化セルソーティングよりも優れていますが、特定の代謝物ライブラリは、固有の安定性および/または急速な回転率のために影響を受ける可能性があります (22)。それでも、サンプルタイプ間で大きく異なる 2 つの既知の免疫抑制代謝物、アデノシンとキヌレニンを私たちの方法で特定することができました。
腫瘍およびTILサブタイプのメタボノミクス解析により、卵巣TMEにおける代謝物の役割についてさらなる知見が得られる。まず、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍とCD4 + T細胞のミトコンドリア活性に差がないことを判定した。しかし、LC-MS/MS解析により、これらの集団間で代謝物の存在量に有意な変化が認められ、TIL代謝とその全体的な代謝活性に関する結論には慎重な解釈が必要であることが示された。次に、MNAは、腫瘍ではなく腹水中のCD45細胞とT細胞間で最も差が見られる代謝物である。したがって、区画化と腫瘍の位置がTIL代謝に異なる影響を及ぼす可能性があり、特定の微小環境における不均一性の可能性が浮き彫りになる。最後に、MNA産生酵素NNMTの発現は主にCAF（腫瘍細胞ではない程度）に限定されているが、腫瘍由来T細胞では検出可能なレベルのMNAが観察される。卵巣CAFにおけるNNMTの過剰発現は、CAF代謝、腫瘍浸潤および転移の促進により、がん促進効果があることが知られています（27）。全体的なTILレベルは中程度ですが、CAFにおけるNNMTの発現は、予後不良に関連するCancer Genome Atlas（TCGA）の間葉系サブタイプと密接に関連しています（27、46、47）。最後に、MNA分解に関与する酵素AOX1の発現もCAF集団に限定されており、これはT細胞がMNAを代謝する能力を欠いていることを示しています。これらの結果は、この発見を検証するにはさらなる研究が必要ですが、T細胞内の高レベルのMNAは免疫抑制性のCAF微小環境の存在を示唆している可能性があるという考えを支持しています。
MNAトランスポーターの発現レベルが低く、MNA代謝に関与する主要タンパク質が検出限界以下であることを考えると、T細胞にMNAが存在することは予想外です。2つの独立したコホートを対象としたscRNA-seq解析および標的qPCRでは、NNMTもAOX1も検出されませんでした。これらの結果は、MNAがT細胞によって合成されるのではなく、周囲のTMEから吸収されることを示唆しています。in vitro実験では、T細胞は外因性MNAを蓄積する傾向があることが示されています。
我々のin vitro研究では、外因性MNAがT細胞におけるTNFαの発現を誘導し、Sp1のTNFαプロモーターへの結合を増強することが示されている。TNFαには抗腫瘍作用と抗腫瘍作用の両方があるが、卵巣癌においてはTNFαが卵巣癌の増殖を促進する可能性がある（31-33）。卵巣腫瘍細胞培養におけるTNFαの中和、またはマウスモデルにおけるTNFαシグナルの除去は、TNFαを介した炎症性サイトカイン産生を改善し、腫瘍の増殖を抑制できる（32, 35）。したがって、この場合、TME由来MNAはオートクリンループを介したTNFα依存性メカニズムによって炎症誘発性代謝物として作用し、卵巣癌の発生と転移を促進する可能性がある（31）。この可能性に基づき、TNFα阻害は卵巣癌の潜在的治療薬として研究されている（37, 48, 49）。さらに、MNAはCAR-T細胞の卵巣腫瘍細胞に対する細胞傷害性を阻害し、MNAを介した免疫抑制のさらなる証拠となります。これらの結果を総合すると、腫瘍およびCAF細胞がMNAを細胞外TMEに分泌するというモデルが示唆されます。これは、(i) TNF誘導性卵巣癌の増殖刺激と(ii) MNA誘導性T細胞細胞傷害活性の抑制を介して、二重の腫瘍効果をもたらす可能性があります（図5D）。
結論として、本研究では、迅速な細胞濃縮、単一細胞シーケンス、および代謝プロファイリングを組み合わせて適用することにより、HGSC患者の腫瘍細胞と腹水細胞間の免疫代謝の大きな違いを明らかにしました。この包括的な分析により、T細胞間でグルコースの取り込みとミトコンドリアの活動に違いがあることが示され、MNAが非細胞自律的免疫調節代謝物として特定されました。これらのデータは、TMEがヒトの癌におけるT細胞代謝にどのように影響するかに影響を与えます。T細胞と癌細胞の間で栄養素をめぐる直接的な競合が報告されていますが、代謝物は間接的な調節因子として作用し、腫瘍の進行を促進し、内因性免疫応答を抑制する可能性もあります。これらの調節代謝物の機能的役割をさらに説明することで、抗腫瘍免疫応答を強化するための代替戦略が開拓される可能性があります。
患者の検体と臨床データは、カナダ組織リポジトリネットワークによって認定されたBCがん腫瘍組織リポジトリから入手しました。BCがん研究倫理委員会とブリティッシュコロンビア大学によって承認されたプロトコル（H07-00463）に従って、すべての患者の検体と臨床データは書面によるインフォームドコンセントを得るか、正式に同意を放棄しました。検体は認定バイオバンク（BRC-00290）に保管されています。詳細な患者の特徴は表S1とS5に示されています。凍結保存のために、メスを使用して患者の腫瘍検体を機械的に分解し、100ミクロンのフィルターに通して単一細胞懸濁液を取得します。患者の腹水を4°Cで1500 rpmで10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去しました。腫瘍および腹水から採取した細胞は、50%加熱不活化ヒトAB血清（Sigma-Aldrich）、40%RPMI-1640（Thermo Fisher Scientific）、および10%ジメチルスルホキシドの混合液中で凍結保存した。保存した単一細胞懸濁液を解凍し、後述するメタボロミクスおよび代謝物定量に使用した。
完全培地は、0.22 μmフィルターを50:50でろ過したRPMI 1640：AimVで構成されています。RPMI 1640 + 2.05 mM l-グルタミン（Thermo Fisher Scientific）に、10%加熱不活化ヒトAB血清（Sigma-Aldrich）、12.5 mM Hepes（Thermo Fisher Scientific）、2 mM l-グルタミン（Thermo Fisher Scientific）、1 x ペニシリンストレプトマイシン（PenStrep）溶液（Thermo Fisher Scientific）、および50 μMメルカプトエタノールを添加しています。AimV（Invitrogen）には、20 mM Hepes（Thermo Fisher Scientific）と2 mM l-グルタミン（Thermo Fisher Scientific）を添加しています。フローサイトメーター染色バッファーは、0.22μmフィルター処理したリン酸緩衝生理食塩水（PBS；Invitrogen）に3%の加熱不活化AB型ヒト血清（Sigma）を添加したものを使用した。細胞濃縮バッファーは、0.22μmフィルター処理したPBSに0.5%の加熱不活化AB型ヒト血清（Sigma-Aldrich）を添加したものを使用した。
37℃の完全培地中で、細胞を10 nM MT DRおよび100 μM 2-NBDGで30分間染色した。次に、細胞を生存率染色色素eF506で4℃で15分間染色した。細胞をFC Block（eBioscience）およびBrilliant Stain Buffer（BD Biosciences）に再懸濁し、フローサイトメーター染色バッファー（メーカーの指示に従って）で希釈し、室温で10分間インキュベートした。フローサイトメーター染色バッファー中の抗体セット（表S2）で細胞を4℃で20分間染色した。解析前に、フローサイトメーター染色バッファー（Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R構成）に細胞を再懸濁した。細胞数データの解析にはSpectroFloおよびFlowJo V10を使用し、データの作成にはGraphPad Prism 8を使用した。 2-NBDGおよびMT DRの蛍光強度中央値（MFI）を対数正規化し、マッチングした患者を考慮するために対応のあるt検定を用いて統計解析を行いました。イベント数が40未満の集団はすべて解析から除外し、負の値にはMFI値を1として統計解析とデータ可視化を実行してください。
上記プロセスパネルの手動ゲーティング戦略を補完するために、FlowJoで死細胞を除外した後、形状制限木（FAUST）（21）による完全なアノテーションを用いて、細胞を集団に自動的に割り当てました。出力を手動で管理し、誤って割り当てられていると思われる集団（PD1陽性細胞とPD1陰性腫瘍細胞の組み合わせ）と保持された集団を統合しました。各サンプルには平均2%以上の細胞が含まれており、合計11の集団があります。
フィコール密度勾配遠心法を使用して、PBMCを白血球分離製品（STEMCELL Technologies）から分離しました。CD8 + T細胞は、CD8 MicroBeads（Miltenyi）を使用してPBMCから分離し、製造元の指示に従ってTransAct（Miltenyi）を使用して2週間完全培地で増殖させました。細胞はIL-7（10 ng/ml、PeproTech）を含む完全培地中で5日間放置し、その後TransActで再刺激しました。7日目に、製造元の指示に従って、ヒトCD45 MicroBeads（Miltenyi）を使用して3回連続で細胞を濃縮しました。細胞はフローサイトメトリー分析用に分注し（上記のように）、100万個の細胞をLC-MS/MS分析用に3回分注しました。サンプルは、以下のようにLC-MS/MSで処理しました。各サンプルは総イオン数 (TIC) で正規化され、対数変換されて、分析前に MetaboAnalystR で自動的に正規化されます。
各患者の単一細胞懸濁液を解凍し、40 μm フィルターで完全培地に濾過しました (上記のとおり)。製造元のプロトコルに従い、MicroBeads (Miltenyi) を使用した磁気ビーズ分離による 3 回連続のポジティブセレクションにより、サンプルを CD8+、CD4+、および CD45- 細胞 (氷上) で濃縮しました。簡単に言うと、細胞を細胞濃縮バッファーに再懸濁し (上記のとおり)、計数しました。細胞をヒト CD8 ビーズ、ヒト CD4 ビーズ、またはヒト CD45 ビーズ (Miltenyi) とともに 4°C で 15 分間インキュベートし、次に細胞濃縮バッファーで洗浄しました。サンプルを LS カラム (Miltenyi) に通し、陽性画分と陰性画分を収集しました。所要時間を短縮し、細胞回収ステップを最大化するために、CD8 画分を 2 回目の CD4+ 濃縮に使用し、CD4 画分を次の CD45 濃縮に使用します。分離プロセス中は溶液を氷の上に置いておきます。
代謝物分析用のサンプルを調製するため、細胞を氷冷した食塩水で1回洗浄し、各サンプルに80%メタノール1mlを加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、液体窒素で急速凍結した。サンプルは3回の凍結融解サイクルを経て、4℃、14,000 rpmで15分間遠心分離した。代謝物を含む上清を蒸発乾固させた。代謝物を0.03%ギ酸50μlに再溶解し、ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離してデブリを除去した。
上記の方法で代謝物を抽出します。上清をメタボロミクス研究用の高速液体クロマトグラフィーボトルに移します。バッチ効果を防ぐため、各サンプルを同数の細胞で処理するランダム処理プロトコルを用います。AB SCIEX QTRAP 5500トリプル四重極質量分析計(50)を用いて、以前に発表された包括的代謝物の定性評価を実施しました。クロマトグラフィー分析とピーク面積積分は、MultiQuantバージョン2.1ソフトウェア（Applied Biosystems SCIEX）を用いて実施しました。
イオンカウント1000を使用して、欠損している代謝物の値を推定し、各サンプルのTICを使用して、検出された各代謝物の正規化されたピーク面積を計算し、サンプル処理からの機器分析によって導入された変化を補正しました。 TICが正規化された後、MetaboAnalystR（51）（デフォルトパラメータ）を使用して対数変換と自動ノルムラインスケーリングを行います。 vegan RパッケージでPCAを使用して、サンプルタイプ間のメタボロームの違いを探索的に分析し、部分冗長性分析を使用して患者を分析しました。 Ward法を使用して、ヒートマップデンドログラムを作成し、サンプル間のユークリッド距離をクラスター化しました。 標準化された代謝物の存在量にlimma（52）を使用して、細胞タイプと微小環境全体にわたって差別的に豊富な代謝物を識別しました。 説明を簡素化するために、グループ平均パラメータを使用してモデルを指定し、微小環境内の細胞タイプを各グループ（n = 6グループ）と見なします。有意差検定では、各代謝物について3回の反復測定を実施しました。偽の複製を避けるため、患者をlimmaデザインに障害物として組み入れました。患者間の代謝物の違いを確認するため、患者をlimmaモデルに一定の方法で組み入れました。細胞種と微小環境との間の事前に設定されたコントラストは、Padj <0.05（Benjamini-Hochberg補正）であり、有意差が認められました。
Miltenyi Dead Cell Removal Kit（Miltenyi Dead Cell Removal Kit）を用いて細胞活性を増強した後（生存率80%超）、凍結腹水および腫瘍サンプル全例に対し、10倍速5′遺伝子発現プロトコルを用いてシングルセルトランスクリプトームシーケンスを実施した。腫瘍と腹水が一致する5症例を解析したが、1つの腫瘍サンプルは生存率が低かったため解析に含めなかった。複数の患者を選択するため、各患者のサンプルを10倍速クロムコントローラーのレーンに混合し、腹水と腫瘍部位を個別に解析した。シーケンス後（Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ペアエンド（PE）、ケベックゲノム；腫瘍と腹水ではそれぞれ細胞あたり平均 73,488 と 41,378 の読み取り]]、CellSNP と Vireo (53) (CellSNP に基づく) を使用しました。GRCh38 によって提供される一般的なヒト SNP (VCF) には、ドナー ID が割り当てられています。SNPRelate を使用して、患者の遺伝子型状態 (IBS) に最も近い ID (IBS) を推測し、割り当てられていない細胞と、二重鎖として識別された細胞と、腹水と腫瘍サンプル間で一致するドナーを除外します (54)。このタスクに基づいて、腫瘍と腹水に細胞が豊富に存在する 3 つのケースを下流の分析用に保持しました。scater (55) と scran (56) BioConductor パッケージでマス フィルトレーション ステップを実行した後、分析用に 6975 個の細胞 (腫瘍と腹水からそれぞれ 2792 個と 4183 個の細胞) が得られました。igraph (57) Jaccard距離に基づくSNN（Synchronization Network）を用いて、細胞を発現レベルでクラスター化した。クラスターは、マーカー遺伝子発現に基づいて手動で推定細胞タイプにアノテーションされ、t-SNEで可視化された。細胞傷害性T細胞はCD8AおよびGZMAの発現によって定義され、リボソームタンパク質発現が低いサブクラスターは除外された。Izarら（16）の発表データ（t-SNE埋め込みを含む）を参照し、免疫細胞マーカーとNNMT発現間の発現重複を制御できることを明らかにした。
PBMCは、白血球分離製品（STEMCELL Technologies社製）からフィコール密度勾配遠心法を用いて分離した。CD3陽性細胞は、CD3ビーズ（Miltenyi社製）を用いてPBMCから単離した。MNA存在下または非存在下で、CD3陽性細胞はプレートに結合したCD3（5μg/ml）、可溶性CD28（3μg/ml）、およびIL-2（300 U/ml；Proleukin社製）で活性化した。増殖培養最終日に、フローサイトメトリーを用いて生存率（Fixable Viability Dye eFluor450、eBioscience社製）および増殖率（123count eBeads、Thermo Fisher Scientific社製）を評価した。エフェクター機能を評価するため、細胞をPMA（20 ng/ml）およびイオノマイシン（1μg/ml）で4時間刺激し、GolgiStopを用いてCD8-PerCP（RPA-T8、BioLegend）、CD4-AF700（RPA-T4、BioLegend）、およびTNFα-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（MAb11、BD）をモニタリングした。qPCRおよびChIP細胞をPMA（20 ng/ml）およびイオノマイシン（1μg/ml）で4時間刺激した。PMA（20 ng/ml）およびイオノマイシン（1μg/ml）で4時間刺激する前後のELISA上清を採取した。
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) を用いて、製造元のプロトコルに従ってRNAを単離します。QIAshredder (QIAGEN) を用いてサンプルをホモジェナイズします。High Capacity RNA to cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific) を用いて相補DNA (cDNA) を合成します。TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) を用いて、以下のプローブを用いて遺伝子発現を定量します（製造元のプロトコルに従います）。Hs00196287_m1 (NNMT)、Hs00154079_m1 (AOX1)、Hs00427552_m1 (SLC22A1)、Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)]、およびHs01010726_m1 (SLC22A2)。サンプルは、MicroAmp光学フィルムを装着したMicroAmp高速光学96ウェル反応プレート（Applied Biosystems）を用いて、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）で分析されました。Ct値が35を超える場合は検出閾値を超えているとみなされ、検出不可と表示されます。
前述のようにChIPを実施した（58）。簡単に説明すると、細胞をホルムアルデヒド（最終濃度1.42%）で処理し、室温で10分間インキュベートした。補充した膨張バッファー（25 mM Hepes、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl、0.1% NP-40）を用いて氷上で10分間培養した後、記載のように免疫沈降バッファーに再懸濁した（58）。次に、サンプルを以下のサイクルで超音波処理した：10サイクル（1秒パルス20回）、静置時間40秒。ChIPグレードの免疫グロブリンG（Cell Signaling Technology; 1μl）、ヒストンH3（Cell Signaling Technology; 3μl）、NFAT（Invitrogen; 3μl）、およびSP1（Cell Signaling Technology; 3μl）抗体をサンプルとともに4°Cで一晩振盪培養した。プロテインAビーズ（Thermo Fisher Scientific）とサンプルを4℃で1時間穏やかに振盪インキュベートした後、キレックスビーズ（Bio-Rad）を用いてDNAを濃縮し、プロテイナーゼK（Thermo Fisher）を用いてタンパク質分解を行った。PCRによりTNFαプロモーターを検出した。順方向：GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT、逆方向：GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG（207 bpの産物）。画像はImage Lab（Bio-Rad）で作成し、ImageJソフトウェアを用いて定量化した。
細胞培養上清は上記の方法で採取した。測定は、ヒトTNFα ELISAキット（Invitrogen）、ヒトIL-2 ELISAキット（Invitrogen）、およびヒトIFN-γ ELISAキット（Abcam）のメーカーの手順に従って実施した。メーカーのプロトコルに従い、TNFαおよびIL-2の検出には上清を1:100に、IFN-γの検出には1:3に希釈した。EnVision 2104マルチラベルリーダー（PerkinElmer）を用いて450 nmの吸光度を測定した。
PBMCは、白血球分離製品（STEMCELL Technologies社製）からフィコール密度勾配遠心法を用いて分離した。CD3陽性細胞は、CD3ビーズ（Miltenyi社製）を用いてPBMCから単離した。MNA存在下または非存在下で、CD3陽性細胞をプレートに結合させたCD3（5μg/ml）、可溶性CD28（3μg/ml）、およびIL-2（300 U/ml、Proleukin社製）で3日間活性化した。3日後、細胞を回収し、0.9%生理食塩水で洗浄した後、ペレットを急速凍結した。細胞数は、123count eBeadsを用いたフローサイトメトリー（Cytek Aurora、3L-16V-14B-8R構成）で測定した。
上記の方法で代謝物を抽出した。乾燥抽出物を4000細胞当量/μlの濃度に調製した。サンプルは逆相クロマトグラフィー（1290 Infinity II、Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ）およびCORTECS T3カラム（2.1×150 mm、粒子径1.6μm、細孔径120Å、品番186008500、Waters）で分析した。極性質量分析計（6470、Agilent）を使用し、エレクトロスプレーイオン化はポジティブモードで行った。移動相Aは0.1%ギ酸（H2O溶液）、移動相Bは90%アセトニトリル、0.1%ギ酸である。 LCグラジエントは、100% Aの場合は0～2分、99% Bの場合は2～7.1分、99% Bの場合は7.1～8分です。次に、移動相Aを流速0.6 ml/分で3分間流し、カラムを再平衡化します。流速は0.4 ml/分で、カラムチャンバーは50℃に加熱されます。MNAの純粋な化学標準（M320995、Toronto Research Chemical Company、オンタリオ州ノースヨーク）を使用して、保持時間（RT）と変換（RT = 0.882分、変換1 = 137→94.1、変換2 = 137→92、変換3 = 137→78）を確立します。3つの遷移がすべて正しい保持時間で発生した場合、特異性を確保するために、遷移1を使用して定量化します。 MNA（Toronto Research Chemical Company）の標準曲線は、原液（1 mg/ml）を6段階に希釈し、それぞれ0.1、1.0、10、100 ng/ml、および1.0、10μg/mlの標準液を得ることで作成しました。検出限界は1 ng/mlで、直線性は10 ng/ml～10μg/mlの範囲でした。LC/MS分析には、サンプルと標準液それぞれ2μLを注入し、分析プラットフォームの安定性を確保するために、8回の注入ごとに混合品質管理サンプルを分析に供しました。MNA処理したすべての細胞サンプルのMNA応答は、アッセイの直線性範囲内でした。データ解析は、MassHunter定量分析ソフトウェア（v9.0、Agilent）を用いて実施しました。
第二世代αFR-CARコンストラクトはSongら（59）から引用した。このコンストラクトは、CD8aリーダー配列、ヒトαFR特異的単鎖可変領域、CD8aヒンジおよび膜貫通領域、CD27細胞内ドメイン、およびCD3z細胞内ドメインから構成される。完全なCAR配列はGenScriptによって合成され、第二世代レンチウイルス発現ベクターにクローニングされ、導入効率の評価に使用したGFP発現カセットの上流に導入された。
レンチウイルスは、HEK293T細胞（American Type Culture Collection (ATCC)）へのトランスフェクションによって作製されます。細胞は、10%ウシ胎児血清（FBS）および1%ペンストレップを含むダルベッコ改変イーグル培地で培養し、CAR-GFPベクターとパッケージングプラスミド（psPAX2およびpMD2.G、Addgene）を用いてリポフェクションアミン（Sigma-Aldrich）で処理しました。トランスフェクション後48時間および72時間にウイルスを含む上清を採取し、ろ過後、超遠心分離により濃縮しました。濃縮したウイルス上清は、形質導入まで-80℃で保存してください。
PBMCは、健康なドナーの白血球分離製品（STEMCELL Technologies）からフィコール密度勾配遠心分離によって分離されます。陽性選択CD8マイクロビーズ（Miltenyi）を使用して、PBMCからCD8 +細胞を分離します。TransAct（Miltenyi）およびTexMACS培地（Miltenyi、3％の熱不活化ヒト血清、1％のPenStrepおよびIL-2（300 U/ml）を補充）でT細胞を刺激します。刺激の24時間後、T細胞にレンチウイルス（10μlの濃縮ウイルス上清、106個の細胞あたり）を導入しました。導入の1～3日後、Cytek Aurora（FSC（前方散乱）/SSC（側方散乱）、シングレット、GFP +）で細胞のGFP発現を評価し、少なくとも30％の導入効率を実証します。
CAR-T細胞をImmunocult（STEMCELL Technologies社製、1% PenStrep添加）で24時間培養した。培養条件は、未処理、アデノシン250μM、またはMNA10mMとした。前処理後、CAR-T細胞をPBSで洗浄し、20,000個のSK-OV-3細胞（ATCC社製、10% FBSおよび1% PenStrep添加McCoy 5A培地（Sigma-Aldrich社製）で10倍希釈した。エフェクター/ターゲット比1の増幅は、Immunocult培地で3回繰り返して行った。SK-OV-3細胞およびジギタリスサポニン（0.5mg/ml、Sigma-Aldrich社製）で溶解したSK-OV-3細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。 24時間の共培養後、上清を採取し、製造元の指示（LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit、Promega）に従って乳酸脱水素酵素（LDH）を測定した。LDH上清をLDH緩衝液で1:50に希釈した。殺菌率は以下の式を用いて測定した：殺菌率＝補正率／最大殺菌率×100%。ここで、補正率＝共培養T細胞のみ、最大殺菌率＝陽性対照／陰性対照。
本文または材料と方法に記載されている通り、統計解析にはGraphPad Prism 8、Microsoft Excel、またはR v3.6.0を使用してください。腹水と腫瘍など、同一患者から複数のサンプルが採取された場合は、対応のあるt検定を用いるか、患者を線形モデルまたは一般化モデルにおけるランダム効果として適宜含めます。メタボロミクス解析では、重要度検定を3回実施します。
この記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1をご覧ください。
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マリサ K. キルガー (マリサ K. キルガー)、サラ マクファーソン (サラ マクファーソン)、ローレン G. ザカリアス (ローレン G. ザカリアス)、アビゲイル イーライ アリス G. ワトソン (H. ワトソン)、ジョン スタッグ (ジョン スタッグ)、ブラッド H. ネルソン (ブラッド H. ネルソン)、ラルフ J. デ ベラルディーニ (ラルフ J.デベラルディニス）、ラッセル G. ジョーンズ（ラッセル G. ジョーンズ）、フィニアス T. ハミルトン（フィニアス T.
MNA は T 細胞の免疫抑制に寄与し、ヒトの癌治療における潜在的な免疫療法のターゲットとなります。
マリサ K. キルガー (マリサ K. キルガー)、サラ マクファーソン (サラ マクファーソン)、ローレン G. ザカリアス (ローレン G. ザカリアス)、アビゲイル イーライ アリス G. ワトソン (H. ワトソン)、ジョン スタッグ (ジョン スタッグ)、ブラッド H. ネルソン (ブラッド H. ネルソン)、ラルフ J. デ ベラルディーニ (ラルフ J.デベラルディニス）、ラッセル G. ジョーンズ（ラッセル G. ジョーンズ）、フィニアス T. ハミルトン（フィニアス T.
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