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砂嵐は、農業、人間の健康、交通網、インフラに破壊的な影響を与えるため、世界中の多くの国々に深刻な脅威をもたらしています。その結果、風食は地球規模の問題と考えられています。風食を抑制するための環境に優しいアプローチの1つは、微生物誘導炭酸塩沈殿（MICP）の使用です。しかし、尿素分解ベースのMICPの副産物であるアンモニアなどは、大量に生成されると理想的ではありません。本研究では、尿素を生成せずにMICPを分解するための2種類のギ酸カルシウム細菌の配合を提示し、その性能をアンモニアを生成しない2種類の酢酸カルシウム細菌の配合と包括的に比較します。対象とする細菌は、枯草菌とバチルス・アミロリケファシエンスです。まず、CaCO3生成を制御する因子の最適化値を決定しました。次に、最適化された配合で処理した砂丘サンプルに対して風洞試験を実施し、耐風食性、剥離閾値速度、耐砂衝撃性を測定した。炭酸カルシウム（CaCO3）の異形体を光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡（SEM）、X線回折分析を用いて評価した。ギ酸カルシウムをベースとした製剤は、酢酸カルシウムをベースとした製剤よりも炭酸カルシウムの生成において有意に優れた性能を示した。さらに、B. subtilisはB. amyloliquefaciensよりも多くの炭酸カルシウムを生成した。SEM顕微鏡写真では、活性細菌と不活性細菌が沈殿によって炭酸カルシウムに結合し、刷り込みを受けていることが明確に示された。すべての製剤において、風食が有意に低減した。
風食は、米国南西部、中国西部、サハラ砂漠、そして中東の大部分といった乾燥地帯および半乾燥地帯が直面する大きな問題として、長年認識されてきました1。乾燥地帯および極度乾燥地帯における降雨量の減少は、これらの地域の大部分を砂漠、砂丘、そして未耕作地へと変貌させています。風食が進行すると、交通網、農地、工業用地といったインフラに環境上の脅威をもたらし、劣悪な生活環境や都市開発コストの高騰につながります2,3,4。重要なのは、風食は発生場所に影響を与えるだけでなく、発生源から遠く離れた地域に風によって粒子を運ぶため、遠隔地のコミュニティに健康問題や経済問題を引き起こすということです5,6。
風食の抑制は依然として世界的な問題です。風食を抑制するために、さまざまな土壌安定化方法が使用されています。これらの方法には、水散布7、オイルマルチ8、バイオポリマー5、微生物誘導炭酸塩沈殿（MICP）9,10,11,12、酵素誘導炭酸塩沈殿（EICP）1などの材料が含まれます。土壌湿潤は、現場での粉塵抑制の標準的な方法です。しかし、急速に蒸発するため、この方法は乾燥地域や半乾燥地域では効果が限られています1。オイルマルチ化合物を散布すると、砂の凝集力と粒子間の摩擦が増加します。その凝集特性により砂粒が互いに結合しますが、オイルマルチには他の問題もあります。暗い色は熱吸収を増加させ、植物や微生物の死につながります。その臭いと煙は呼吸器系の問題を引き起こす可能性があり、最も顕著なのは、コストが高いことです。バイオポリマーは、最近提案された風食を緩和する環境に優しい方法の1つです。バイオポリマーは、植物、動物、細菌などの天然資源から抽出されます。キサンタンガム、グアーガム、キトサン、ジェランガムは、工学用途で最も一般的に使用されているバイオポリマーです5。しかし、水溶性バイオポリマーは、水にさらされると強度が低下し、土壌から浸出する可能性があります13,14。EICPは、未舗装道路、鉱滓池、建設現場など、さまざまな用途において効果的な粉塵抑制方法であることが示されています。その成果は有望ですが、コストや核生成サイトの欠如（CaCO3結晶の形成と沈殿を促進する15,16）など、いくつかの潜在的な欠点を考慮する必要があります。
MICP は、19 世紀後半に Murray と Irwin (1890)、および Steinmann (1901) が海洋微生物による尿素分解に関する研究の中で初めて記述しました17。MICP は、微生物の代謝産物由来の炭酸イオンと環境中のカルシウムイオンとの反応によって炭酸カルシウムが沈殿する、さまざまな微生物活動と化学プロセスを伴う自然発生的な生物学的プロセスです18,19。尿素分解窒素サイクル (尿素分解 MICP) を伴う MICP は、微生物誘導炭酸塩沈殿の最も一般的なタイプであり、細菌によって生成されるウレアーゼが尿素の加水分解を触媒します20,21,22,23,24,25,26,27。
有機塩酸化炭素循環（尿素分解を伴わないMICP）では、従属栄養細菌が酢酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸、グリオキシル酸などの有機塩をエネルギー源として炭酸塩鉱物を生成する28。炭素源として乳酸カルシウムとカルシウムイオンが存在する場合、炭酸カルシウム生成の化学反応は式（5）で示される。
MICPプロセスにおいて、細菌細胞は炭酸カルシウムの沈殿に特に重要な核形成部位を提供します。細菌細胞表面は負に帯電しており、カルシウムイオンなどの二価陽イオンの吸着剤として作用します。細菌細胞にカルシウムイオンが吸着されると、炭酸イオン濃度が十分であれば、カルシウム陽イオンと炭酸陰イオンが反応し、炭酸カルシウムが細菌表面に沈殿します29,30。このプロセスは以下のように要約できます31,32。
生物由来の炭酸カルシウム結晶は、方解石、バテライト、アラゴナイトの3種類に分けられます。中でも、方解石とバテライトは、細菌誘導炭酸カルシウム異形態の中で最も一般的です33,34。方解石は、炭酸カルシウム異形態の中で最も熱力学的に安定な結晶です35。バテライトは準安定状態にあると報告されていますが、最終的には方解石に変化します36,37。バテライトはこれらの結晶の中で最も密度が高く、六方晶系の結晶で、サイズが大きいため、他の炭酸カルシウム結晶よりも細孔充填性に優れています38。尿素分解MICPと尿素非分解MICPの両方がバテライトの沈殿を引き起こす可能性があります13,39,40,41。
MICPは問題のある土壌や風食の影響を受けやすい土壌の安定化に有望な可能性を示しているが42,43,44,45,46,47,48、尿素加水分解の副産物の一つであるアンモニアは、曝露レベルに応じて軽度から重度の健康問題を引き起こす可能性がある49。この副作用のため、特に粉塵抑制など広い面積を処理する必要がある場合、この特定の技術の使用は物議を醸している。さらに、アンモニアの臭気は、高適用率で大量に処理すると耐え難いものとなり、実用性に影響を与える可能性がある。最近の研究では、アンモニウムイオンをストルバイトなどの他の生成物に変換することで低減できることが示されているが、これらの方法ではアンモニウムイオンが完全に除去されるわけではない50。したがって、アンモニウムイオンを生成しない代替ソリューションを依然として模索する必要がある。 MICPの尿素を使わない分解経路の利用は、風食軽減の観点からこれまで十分に検討されていなかった潜在的な解決策となる可能性があります。Fattahiらは、酢酸カルシウムとバチルス・メガテリウムを用いて尿素を使わないMICPの分解を研究しました41。一方、Mohebbiらは酢酸カルシウムとバチルス・アミロリケファシエンスを用いて分解を研究しました9。しかし、彼らの研究では、最終的に風食耐性を向上させる可能性のある他のカルシウム源や従属栄養細菌と比較されていません。また、風食軽減において尿素を使わない分解経路と尿素分解経路を比較した文献も不足しています。
さらに、風食と粉塵抑制に関する研究のほとんどは、平坦な表面を持つ土壌サンプルを用いて行われてきました。1,51,52,53 しかし、自然界では平坦な表面は丘や窪地ほど一般的ではありません。そのため、砂漠地域では砂丘が最も一般的な景観となっています。
上記の欠点を克服するため、本研究では、アンモニアを生成しない新しい一連の細菌性薬剤の導入を目的とした。この目的のために、尿素を分解しないMICP経路を考慮した。2種類のカルシウム源（ギ酸カルシウムと酢酸カルシウム）の効率を調査した。著者らの知る限り、2種類のカルシウム源と細菌の組み合わせ（ギ酸カルシウム-枯草菌、ギ酸カルシウム-バチルス・アミロリケファシエンス）を使用した炭酸塩沈殿は、以前の研究で調査されたことはない。これらの細菌の選択は、ギ酸カルシウムと酢酸カルシウムの酸化を触媒して微生物炭酸塩沈殿を形成する酵素を生成するという理由に基づいている。pH、細菌とカルシウム源の種類とその濃度、細菌とカルシウム源溶液の比率、硬化時間などの最適因子を見つけるために、徹底的な実験研究を計画した。最後に、この一連の細菌性薬剤が炭酸カルシウムの沈殿を通じて風食を抑制する効果について、砂丘で一連の風洞試験を実施して風食の規模、限界剥離速度、砂の風衝撃抵抗を測定することで調査しました。また、貫入計による測定と微細構造の研究（X線回折（XRD）分析や走査型電子顕微鏡（SEM）など）も行いました。
炭酸カルシウムの製造には、カルシウムイオンと炭酸イオンが必要です。カルシウムイオンは、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、脱脂粉乳など、さまざまなカルシウム源から得ることができます54,55。炭酸イオンは、尿素加水分解や有機物の好気性または嫌気性酸化など、さまざまな微生物法で生成できます56。本研究では、炭酸イオンをギ酸と酢酸の酸化反応から得ました。また、純粋な炭酸カルシウムを製造するためにギ酸と酢酸のカルシウム塩を使用したため、副産物としてCO2とH2Oのみが得られました。このプロセスでは、カルシウム源と炭酸源として機能するのは1つの物質のみであり、アンモニアは生成されません。これらの特徴により、私たちが考えたカルシウム源と炭酸塩の製造方法は非常に有望です。
ギ酸カルシウムと酢酸カルシウムが炭酸カルシウムを生成する反応を式(7)～(14)に示す。式(7)～(11)は、ギ酸カルシウムが水に溶解してギ酸またはギ酸塩を生成することを示している。したがって、この溶液は遊離カルシウムイオンと水酸化物イオンの供給源となる（式8および9）。ギ酸の酸化の結果、ギ酸中の炭素原子は二酸化炭素に変換される（式10）。最終的に炭酸カルシウムが生成される（式11および12）。
同様に、炭酸カルシウムは酢酸カルシウムから生成されます（式 13 ～ 15）。ただし、ギ酸の代わりに酢酸または酢酸塩が生成されます。
酵素がなければ、酢酸とギ酸は室温では酸化できません。FDH（ギ酸脱水素酵素）とCoA（補酵素A）は、それぞれギ酸と酢酸の酸化を触媒して二酸化炭素を生成します（式16、17）57、58、59。さまざまな細菌がこれらの酵素を産生できますが、本研究では従属栄養細菌、すなわちBacillus subtilis（PTCC #1204（Persian Type Culture Collection）、NCIMB #13061（International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures）としても知られています）とBacillus amyloliquefaciens（PTCC #1732、NCIMB #12077）を使用しました。これらの細菌は、肉ペプトン (5 g/L) と肉エキス (3 g/L) を含む栄養ブロス (NBR) (105443 Merck) と呼ばれる培地で培養されました。
そこで、2 種類のカルシウム源と 2 種類の細菌を使用して炭酸カルシウムの沈殿を誘発する 4 つの配合物を調製しました。配合物は、ギ酸カルシウムと枯草菌 (FS)、ギ酸カルシウムとバチルス・アミロリケファシエンス (FA)、酢酸カルシウムと枯草菌 (AS)、酢酸カルシウムとバチルス・アミロリケファシエンス (AA) です。
実験設計の最初の部分では、炭酸カルシウムの生産量を最大化する最適な組み合わせを決定するための試験を実施しました。土壌サンプルには炭酸カルシウムが含まれていたため、様々な組み合わせで生成されるCaCO3を正確に測定するための一連の予備評価試験が計画され、培養培地とカルシウム源溶液の混合物が評価されました。上記で定義したカルシウム源と細菌溶液の各組み合わせ（FS、FA、AS、およびAA）について、最適化係数（カルシウム源濃度、硬化時間、溶液の光学密度（OD）で測定された細菌溶液濃度、カルシウム源と細菌溶液の比率、およびpH）が導出され、以下のセクションで説明する砂丘処理風洞試験で使用されました。
それぞれの組み合わせについて、CaCO3沈殿の効果を検証し、カルシウム源濃度、硬化時間、細菌のOD値、カルシウム源と細菌溶液の比率、および有機物の好気酸化中のpHといった様々な因子を評価するため、150回の実験を実施しました（表1）。最適化されたプロセスのpH範囲は、より速い増殖を得るために、Bacillus subtilisおよびBacillus amyloliquefaciensの増殖曲線に基づいて選択されました。これについては、「結果」のセクションで詳しく説明します。
最適化フェーズ用のサンプルは、以下の手順で調製しました。まず、培養培地の初期 pH を調整して MICP 溶液を調製し、121 °C で 15 分間オートクレーブ処理しました。次に、菌株を層流で接種し、30 °C、180 rpm の振盪インキュベーターで維持しました。細菌の OD が目的のレベルに達したら、カルシウム源溶液と目的の割合で混合しました (図 1a)。MICP 溶液を、目標値に達するまで、220 rpm、30 °C の振盪インキュベーターで反応させて固化させました。沈殿した CaCO3 は、6000 g で 5 分間遠心分離した後に分離し、40 °C で乾燥させて、カルシウムメーター試験用のサンプルを調製しました (図 1b)。次に、ベルナール型カルシウムメーターを用いてCaCO3の沈殿を測定しました。この方法では、CaCO3粉末を1.0 N HCl（ASTM-D4373-02）と反応させてCO2を生成し、このガスの体積をCaCO3含有量の尺度としました（図1c）。CO2の体積をCaCO3含有量に変換するために、純粋なCaCO3粉末を1 N HClで洗浄し、発生したCO2に対してプロットすることで検量線を作成しました。沈殿したCaCO3粉末の形態と純度は、SEM画像とXRD分析を用いて調査しました。倍率1000倍の光学顕微鏡を用いて、細菌周囲の炭酸カルシウムの形成、形成された炭酸カルシウムの相、および細菌の活性を調べました。
デジェグ盆地は、イラン南西部のファールス州に位置する、侵食が著しい地域として知られています。研究者らは、この地域から風食土壌サンプルを採取しました。サンプルは研究のために土壌表層から採取されました。土壌サンプルの指標試験の結果、土壌はシルトを含む淘汰の悪い砂質土であり、統一土壌分類システム（USC）によればSP-SMに分類されることが示されました（図2a）。XRD分析の結果、デジェグ土壌は主に方解石と石英で構成されていることが示されました（図2b）。さらに、EDX分析では、Al、K、Feなどの他の元素も少量含まれていることが示されました。
風食試験用の実験室用砂丘を準備するため、土壌を170mmの高さから直径10mmの漏斗を通して固い表面まで粉砕し、高さ60mm、直径210mmの典型的な砂丘を形成しました。自然界では、最も密度の低い砂丘は風成作用によって形成されます。同様に、上記の手順で調製した試料は相対密度が最も低く、γ = 14.14 kN/m³で、水平面上に堆積した砂丘を形成し、安息角は約29.7°でした。
前のセクションで得られた最適な MICP 溶液を、1、2、3 lm-2 の散布率で砂丘の斜面に散布し、その後サンプルを 30 °C のインキュベーターで 9 日間 (つまり、最適な硬化時間) 保管し、その後風洞試験のために取り出しました。
各処理について、4 つの試験片が用意され、1 つは貫入計を使用して炭酸カルシウム含有量と表面強度を測定するためのもので、残りの 3 つの試験片は 3 つの異なる速度での侵食試験に使用されました。風洞試験では、異なる風速で侵食量を測定し、次に侵食量と風速のプロットを使用して各処理試験片の閾値分離速度を決定しました。風洞試験に加えて、処理済み試験片は砂の衝撃（すなわち、ジャンプ実験）にかけられました。この目的のために、適用速度 2 L m−2 および 3 L m−2 で 2 つの追加試験片が用意されました。砂の衝撃試験は、以前の研究60,61,62 で選択された値の範囲内である 120 gm−1 の流束で 15 分間続きました。研磨ノズルと砂丘の基部との間の水平距離は 800 mm で、風洞底から 100 mm 上にありました。この位置は、飛び散った砂粒のほとんどすべてが砂丘に落ちるように設定されました。
風洞試験は、長さ8m、幅0.4m、高さ1mの開放型風洞で実施されました（図4a）。風洞は亜鉛メッキ鋼板で作られており、最大25m/sの風速を発生させることができます。さらに、周波数変換器を用いてファン周波数を調整し、徐々に周波数を上げて目標風速を達成しました。図4bは、風によって侵食された砂丘の模式図と、風洞内で測定された風速プロファイルを示しています。
最後に、本研究で提案した非尿素分解性 MICP 製剤の結果と尿素分解性 MICP 対照試験の結果を比較するために、砂丘サンプルも調製し、尿素、塩化カルシウム、および Sporosarcina pasteurii (Sporosarcina pasteurii はウレアーゼを産生する顕著な能力を有するため63) を含む生物学的溶液で処理した。細菌溶液の光学密度は 1.5 であり、尿素と塩化カルシウムの濃度は 1 M であった (以前の研究36,64,65 で推奨された値に基づいて選択)。培養培地は、栄養ブロス (8 g/L) と尿素 (20 g/L) で構成されていた。細菌溶液を砂丘表面に噴霧し、細菌の付着のために 24 時間放置した。付着から 24 時間後、セメント溶液 (塩化カルシウムと尿素) を噴霧した。尿素分解性 MICP 対照試験を、以下 UMC と呼ぶ。尿素処理した土壌サンプルと尿素処理していない土壌サンプルの炭酸カルシウム含有量は、Choiら66が提案した手順に従って洗浄することによって得られた。
図5は、培養液（栄養溶液）の初期pH範囲が5～10のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）の増殖曲線を示しています。図に示すように、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）とバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）は、それぞれpH6～8と7～9でより速く増殖しました。そのため、最適化段階ではこのpH範囲を採用しました。
栄養培地の異なる初期 pH 値における (a) Bacillus amyloliquefaciens と (b) Bacillus subtilis の成長曲線。
図6は、ベルナール石灰計で生成された二酸化炭素の量を示しており、これは沈降炭酸カルシウム（CaCO3）を表しています。各組み合わせにおいて1つの要因が固定され、他の要因が変化したため、これらのグラフ上の各点は、その実験セットにおける二酸化炭素の最大量に対応しています。図に示すように、カルシウム源濃度が増加すると、炭酸カルシウムの生成量も増加しています。したがって、カルシウム源の濃度は炭酸カルシウムの生成量に直接影響します。カルシウム源と炭素源は同じ（すなわち、ギ酸カルシウムと酢酸カルシウム）であるため、より多くのカルシウムイオンが放出されるほど、より多くの炭酸カルシウムが形成されます（図6a）。ASおよびAA配合では、硬化時間の増加に伴い炭酸カルシウムの生成量が増加し続け、9日後には沈殿物の量がほとんど変化しませんでした。FA配合では、硬化時間が6日を超えると炭酸カルシウムの生成率が低下しました。他の配合と比較して、配合FSは3日後に比較的低い炭酸カルシウム生成率を示しました（図6b）。配合FAおよびFSでは、3日後に総炭酸カルシウム生成量の70%および87%が得られたのに対し、配合AAおよびASでは、それぞれ約46%および45%にとどまりました。これは、ギ酸ベースの配合では、酢酸ベースの配合と比較して、初期段階でのCaCO3生成速度が高いことを示しています。しかし、硬化時間が長くなるにつれて、生成速度は低下します。図6cから、細菌濃度がOD1を超えても、炭酸カルシウム生成への有意な寄与はないと結論付けられます。
ベルナールカルシウムメーターで測定した CO2 量（および対応する CaCO3 含有量）の変化。これは、(a) カルシウム源濃度、(b) 硬化時間、(c) OD、(d) 初期 pH、(e) カルシウム源と細菌溶液の比率（各配合について）、および (f) カルシウム源と細菌の各組み合わせで生成される炭酸カルシウムの最大量の関数として表されます。
培地の初期 pH の影響については、図 6d は、FA および FS の場合、CaCO3 生成が pH 7 で最大値に達したことを示しています。この観察結果は、FDH 酵素が pH 7-6.7 で最も安定するという以前の研究と一致しています。しかし、AA および AS の場合、pH が 7 を超えると CaCO3 沈殿が増加しました。以前の研究では、CoA 酵素活性の最適 pH 範囲は 8 から 9.2-6.8 であることも示されています。CoA 酵素活性と B. amyloliquefaciens の増殖の最適 pH 範囲がそれぞれ (8-9.2) と (6-8) であることを考慮すると (図 5a)、AA 処方の最適 pH は 8 であると予想され、2 つの pH 範囲が重なります。この事実は、図 6d に示すように実験によって確認されました。 B. subtilis の生育に最適な pH は 7～9（図 5b）、CoA 酵素活性の最適 pH は 8～9.2 であるため、CaCO3 沈殿の最大収率は pH 8～9 の範囲にあると予想され、これは図 6d で確認されています（つまり、最適沈殿 pH は 9）。図 6e に示す結果は、酢酸溶液とギ酸溶液の両方において、カルシウム源溶液と細菌溶液の最適比率は 1 であることを示しています。比較のために、異なる配合（AA、AS、FA、および FS）の性能を、異なる条件（カルシウム源濃度、硬化時間、OD、カルシウム源と細菌溶液の比率、および初期 pH）における最大 CaCO3 生成量に基づいて評価しました。調査した配合の中で、配合 FS の CaCO3 生成量が最も高く、配合 AA の約 3 倍でした（図 6f）。両方のカルシウム源について 4 回の無菌対照実験を実施しましたが、30 日後には CaCO3 の沈殿は観察されませんでした。
すべての製剤の光学顕微鏡画像から、炭酸カルシウムが形成される主な相はバテライトであることが示されました（図 7）。バテライトの結晶は球形でした69,70,71。細菌細胞の表面は負に帯電しており、二価陽イオンの吸着剤として作用するため、炭酸カルシウムが細菌細胞上に沈殿することが分かりました。本研究では製剤 FS を例にとると、24 時間後、一部の細菌細胞上に炭酸カルシウムが形成され始め（図 7a）、48 時間後には炭酸カルシウムで覆われた細菌細胞の数が大幅に増加しました。さらに、図 7b に示すように、バテライト粒子も検出できました。最終的に、72 時間後には、多数の細菌がバテライト結晶に結合しているように見え、バテライト粒子の数が大幅に増加しました（図 7c）。
FS組成物中のCaCO3沈殿の経時的光学顕微鏡観察：(a) 24、(b) 48、(c) 72時間。
析出相の形態をさらに調査するため、粉末のX線回折（XRD）およびSEM分析を実施した。XRDスペクトル（図8a）およびSEM顕微鏡写真（図8b、c）から、バテライト結晶の存在が確認された。バテライト結晶はレタスのような形状をしており、バテライトのピークと析出物のピークが一致していた。
(a) 形成されたCaCO3とバテライトのX線回折スペクトルの比較。(b) 1 kHzおよび(c) 5.27 kHzの倍率でのバテライトのSEM顕微鏡写真。
風洞試験の結果を図 9a、b に示します。図 9a から、未処理の砂の閾値浸食速度 (TDV) は約 4.32 m/s であることがわかります。施用量 1 l/m² (図 9a) では、画分 FA、FS、AA、および UMC の土壌流出速度線の傾きは、未処理の砂丘とほぼ同じです。これは、この施用量での処理は効果がなく、風速が TDV を超えるとすぐに薄い土壌クラストが消失し、砂丘の浸食速度が未処理の砂丘と同じになることを示しています。画分 AS の浸食傾きも、横軸 (つまり TDV) が低い他の画分の傾きよりも低くなっています (図 9a)。図 9b の矢印は、最大風速 25 m/s で、施用量 2 および 3 l/m² で処理済み砂丘に浸食が発生しなかったことを示しています。言い換えれば、FS、FA、AS、UMCにおいて、砂丘はCaCO³施用量2および3 l/m²において、最大風速（すなわち25 m/s）時よりもCaCO³の堆積による風食に対してより耐性があった。したがって、これらの試験で得られたTDV値25 m/sは、TDVが最大風洞速度とほぼ等しいAAの場合を除いて、図9bに示されている施用量の下限値である。
風食試験 (a) 重量損失と風速の関係 (散布量 1 l/m2)、(b) 剥がれ速度の閾値と散布量および配合 (酢酸カルシウムの場合は CA、ギ酸カルシウムの場合は CF)。
図 10 には、サンドボンバードメント試験後に異なる配合と施用量で処理した砂丘の表面浸食が示されており、定量的な結果は図 11 に示されています。未処理のケースは、抵抗を示さず、サンドボンバードメント試験中に完全に浸食された (総質量損失) ため、示されていません。図 11 からは、バイオ組成物 AA で処理したサンプルは施用量 2 l/m2 で重量の 83.5% を失ったのに対し、その他のすべてのサンプルはサンドボンバードメント処理中に 30% 未満の浸食を示したことがわかります。施用量を 3 l/m2 に増やすと、処理したすべてのサンプルの重量損失は 25% 未満でした。両方の施用量で、化合物 FS が砂ボンバードメントに対して最も優れた耐性を示しました。FS および AA で処理したサンプルの最大および最小のボンバードメント耐性は、最大および最小の CaCO3 沈殿に起因すると考えられます (図 6f)。
異なる組成の砂丘を流量 2 l/m2 および 3 l/m2 で衝撃を与えた結果 (矢印は風向、十字は図面の平面に垂直な風向を示します)。
図12に示すように、施用量が1 L/m²から3 L/m²に増加するにつれて、すべての配合において炭酸カルシウム含有量が増加しました。さらに、すべての施用量において、炭酸カルシウム含有量が最も高かったのはFSで、次いでFA、UMCの順でした。これは、これらの配合が表面抵抗性が高い可能性を示唆しています。
図 13a は、透過計テストで測定された未処理、対照、および処理済みの土壌サンプルの表面抵抗の変化を示しています。この図から、UMC、AS、FA、および FS 製剤の表面抵抗は、施用量の増加とともに大幅に増加したことが明らかです。ただし、AA 製剤では表面強度の増加は比較的小さかったです。図に示すように、尿素分解しない MICP の FA および FS 製剤は、尿素分解した MICP と比較して表面浸透性が優れています。図 13b は、土壌表面抵抗による TDV の変化を示しています。この図から、表面抵抗が 100 kPa を超える砂丘では、閾値剥離速度が 25 m/s を超えることが明らかです。現場の表面抵抗は透過計で簡単に測定できるため、この知識は風洞試験がなくても TDV を推定するのに役立ち、現場での適用における品質管理指標として役立ちます。
SEM の結果を図 14 に示します。図 14a ～ b は、未処理の土壌サンプルの拡大した粒子を示しており、これは明らかにこのサンプルが粘着性があり、自然な結合やセメント結合がないことを示しています。図 14c は、尿素分解 MICP で処理した対照サンプルの SEM 顕微鏡写真を示しています。この画像は、方解石多形として CaCO3 沈殿物が存在することを示しています。図 14d ～ o に示すように、沈殿した CaCO3 は粒子を結合しています。球状のバテライト結晶も SEM 顕微鏡写真で確認できます。本研究および以前の研究の結果は、バテライト多形として形成された CaCO3 結合が妥当な機械的強度も提供できることを示しており、表面抵抗が 350 kPa に増加し、閾値分離速度が 4.32 から 25 m/s 以上に増加することを示しています。この結果は、MICP 沈殿 CaCO3 のマトリックスがバテライトであり、適度な機械的強度と耐風食性13,40 を備え、野外環境条件に 180 日間さらされた後でも適度な耐風食性を維持できるという以前の研究の結果と一致しています13。
(a、b) 未処理土壌のSEM顕微鏡写真、(c) MICP尿素分解制御、(df) AA処理サンプル、(gi) AS処理サンプル、(jl) FA処理サンプル、および(mo) FS処理サンプル（施用量3 L/m2）の異なる倍率での顕微鏡写真。
図14d-fは、AA化合物処理後、炭酸カルシウムが砂粒子の表面および粒子間に沈殿していることを示しています。また、コーティングされていない砂粒子も一部観察されました。AS成分では、CaCO3の生成量は有意に増加しませんでしたが（図6f）、CaCO3による砂粒子間の接触量はAA化合物と比較して有意に増加しました（図14g-i）。
図14j-lおよび14m-oから、カルシウム源としてギ酸カルシウムを使用すると、AS化合物と比較してCaCO3の沈殿がさらに増加することが明らかであり、これは図6fのカルシウムメーターの測定値と一致しています。この追加のCaCO3は主に砂粒子に堆積し、必ずしも接触品質を向上させるわけではないようです。これは、以前に観察された挙動を裏付けています。CaCO3の沈殿量（図6f）に違いがあるにもかかわらず、3つの配合（AS、FA、FS）は、耐風性能（図11）と表面抵抗（図13a）の点で大きな違いはありません。
CaCO3 でコーティングされた細菌細胞と沈殿した結晶上の細菌の痕跡をよりよく視覚化するために、高倍率の SEM 顕微鏡写真を撮影し、その結果を図 15 に示します。図に示すように、炭酸カルシウムは細菌細胞上に沈殿し、そこで沈殿に必要な核を提供します。この図には、CaCO3 によって誘導された活性結合と不活性結合も示されています。不活性結合の増加は、必ずしも機械的挙動のさらなる改善につながるわけではないと結論付けることができます。したがって、CaCO3 の沈殿の増加は必ずしも機械的強度の向上につながるわけではなく、沈殿パターンが重要な役割を果たします。この点は、Terzis と Laloui72 および Soghi と Al-Kabani45,73 の研究でも研究されています。沈殿パターンと機械的強度の関係をさらに調査するには、µCT イメージングを使用した MICP 研究が推奨されますが、これは本研究の範囲外です (つまり、アンモニアを含まない MICP にカルシウム源と細菌のさまざまな組み合わせを導入すること)。
CaCO3 は、(a) AS 組成物と (b) FS 組成物で処理したサンプルで活性結合と不活性結合を誘発し、堆積物に細菌細胞の痕跡を残しました。
図14j-oおよび15bに示すように、CaCO膜が形成されている（EDX分析によると、膜中の各元素の組成比は炭素11%、酸素46.62%、カルシウム42.39%であり、これは図16のCaCOの割合と非常に近い）。この膜はバテライト結晶と土壌粒子を覆い、土壌堆積系の健全性を維持するのに役立っている。この膜の存在は、ギ酸ベースの製剤で処理したサンプルでのみ観察された。
表2は、先行研究および本研究において、尿素分解性および非尿素分解性MICP経路で処理した土壌の表面強度、閾値剥離速度、および生物由来CaCO3含有量を比較したものである。MICP処理した砂丘サンプルの風食抵抗性に関する研究は限られている。Mengらは、リーフブロワーを用いてMICP処理した尿素分解性砂丘サンプルの風食抵抗性を調査した13。一方、本研究では、非尿素分解性砂丘サンプル（および尿素分解性対照サンプル）を風洞で試験し、4つの異なる細菌と物質の組み合わせで処理した。
ご覧のとおり、いくつかの以前の研究では、4 L / m2を超える高施用量が検討されています13,41,74。水の供給、輸送、および大量の水の散布に関連するコストのため、経済的観点から、高施用量を現場で簡単に適用できない場合があることに留意する価値があります。1.62〜2 L / m2などのより低い施用量でも、最大190 kPaおよびTDV 25 m / sを超えるかなり良好な表面強度が達成されました。本研究では、尿素分解なしでギ酸ベースのMICPで処理した砂丘は、同じ範囲の施用量で尿素分解経路で得られたものと匹敵する高い表面強度を達成しました（つまり、尿素分解なしでギ酸ベースのMICPで処理したサンプルも、より高い施用量でMengら、13によって報告されたのと同じ範囲の表面強度値を達成することができました、図13a）。また、施用量 2 L/m2 では、風速 25 m/s での風食軽減のための炭酸カルシウムの収率は、尿素分解のないフォーマートベースの MICP では 2.25% であり、同じ施用量および同じ風速 (25 m/s) で尿素分解のあるコントロール MICP で処理した砂丘と比較して、必要な CaCO3 量 (つまり 2.41%) に非常に近いことがわかります。
したがって、この表から、尿素分解経路と尿素を含まない分解経路の両方が、表面抵抗と TDV の点で非常に許容できるパフォーマンスを提供できると結論付けることができます。主な違いは、尿素を含まない分解経路にはアンモニアが含まれないため、環境への影響が少ないことです。さらに、本研究で提案された尿素分解のないギ酸ベースの MICP 法は、尿素分解のない酢酸ベースの MICP 法よりも優れたパフォーマンスを発揮するようです。Mohebbi らは、尿素分解のない酢酸ベースの MICP 法を研究しましたが、その研究には平面上のサンプルが含まれていました9。砂丘サンプルの周りの渦形成によって引き起こされる侵食の程度が高く、その結果として生じるせん断によって TDV が低くなるため、同じ速度の平面上のサンプルよりも砂丘サンプルの風食がより顕著になると予想されます。